Введение к работе
Актуальность проблемы. Роль лекарственных растений, как источников веществ медицинского назначения постоянно возрастает. Более 25% всех препаратов, в настоящее время, содержат соединения растительного происхождения. Однако использование в медицинской промышленности природных источников лекарственного сырья приводит к сокращению их ареала в результате неограниченного сбора или воздействия антропогенных факторов. Поэтому альтернативным источником вторичных метаболитов является культура клеток и тканей лекарственных растений, используемая в фармацевтической промышленности. Этот метод имеет ряд преимуществ перед сбором лекарственного сырья в природе и, в определенной мере, выращивания интактных растений на полях. Технология in vitro позволяет регулировать рост растительных клеток и накопление ими биологически активных веществ (БАВ), оптимизируя питательную среду путем добавления в нее гормонов, элиситоров и предшественников синтеза. Регуляторами роста и морфогенеза также могут служить факторы внешней среды, особое место среди которых занимает свет, который не только выступает как источник энергии для фотосинтеза, но также через систему рецепторов различных участков спектра может воздействовать на процессы роста клеточных культуры накопления ими вторичных метаболитов (Воскресенская, 1957; Шульгин, 1964; Карначук и др., 1987; Тихомиров, 1993; Sakamoto et. al, 1994; Kurata et. al, 1998; Ouyang et. al., 2003; Seo et. al., 2004; Головацкая, 2007; Карначук и др. 2008).
К перспективным растениям для введения в культуру in vitro относится полынь однолетняя - Artemisia annua L, (семейство сложноцветные Asteraceae) которая продуцирует ценные сесквитерпеновые лактоны (Schou, 2007) и флавоноиды. Показано их противомалярийное, противопаразитарное, противоопухолевое и противовирусное действие. (Wright et. al., 2002). Введение Artemisia annua L. в асептическую культуру in vitro открывает перспективу круглогодичного получения растительного материала в качестве возможного источника сесквитерпеновых лактонов. Однако на сегодняшний день немногое известно о путях действия селективного света на рост клеток культуры in vitro и накопление ею биологически-активных веществ..
Цель диссертационной работы заключалась в получении каллусной, суспензионной культуры клеток полыни однолетней {Artemisia annua L.), а также культуры hairy-root (бородатые корни), и исследование регуляторной роли селективного света в фотоморфогенезе этих культур in vitro.
Задачи исследования:
Получить каллусную, суспензионную культуры Artemisia annua L. и культуру hairy-root, определить оптимальные условия их роста. Изучить действие различных концентраций ростовых, сигнальных веществ и элиситоров на рост и морфологические характеристики клеток каллусной и суспензионной культур.
Изучить действие селективного света на рост клеток каллусной и суспензионной культуры Artemisia annua L.
Исследовать влияние условий культивирования на содержание пигментов хлорофиллов А, В и каротиноидов в клетках культуры.
Установить характер накопления флавоноидов в клеточных культурах
Artemisia annua L. и зависимость этих процессов от действия селективного света. Защищаемые положения.
Оптимальной средой для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. является среда MS с 0,5 мг/л а-НУК и 0,2 мг/л 6-БАП. Добавление в питательную среду 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л приводит к снижению объемов клеток культуры. Увеличение концентрации этого гормона до 1 мг/л приводит к снижению доли вытянутых клеток по сравнению с округлыми.
Синий свет (450 нм) стимулирует рост каллусной культуры Artemisia annua L. уменьшая размеры клеток. Зеленый свет (550 нм) равной интенсивности и экспозиции подавляет рост каллусной культуры с одновременным увеличением объема клеток.
Культура клеток Artemisia annua L. in vitro на свету разного спектрального состава способна к синтезу пигментов фотосинтеза: хлорофиллов А, Б и каротиноидов.
4. Свет подавляет образование флавоноидов в каллусной культуре Artemisia
annuaL.
Научная новизна. Впервые изучено действие различных концентраций фитогормонов на морфологические параметры клеток каллусной и суспензионной культур Artemisia annua L. Показано, что гомобрассинолид в концентрации 5-10 мкг/л и сахароза в концентрации 15 г/л стимулировали рост каллусной культуры. Впервые изучено регуляторное действие селективного света на рост и морфогенез клеточных культур Artemisia annua L. Показано, что синий свет (450 нм) с экспозицией 16 часов стимулировал рост каллусной культуры Artemisia annua L, уменьшая размер всех типов клеток, что может свидетельствовать о специфическом действии этого участка спектра на процессы клеточного деления, в то время как зеленый свет (550 нм) равной интенсивности и экспозиции подавлял рост каллусной культуры, с одновременным увеличением объема клеток.
Практическая значимость. Полученные данные по светорегуляторной зависимости морфогенеза клеточных культур Artemisia annua L. могут быть использованы в дальнейшем для интенсификации роста культур in vitro не только этого растения, но и других ценных видов, а также для интенсификации образования вторичных метаболитов, в том числе флавоноидов. Культуры и методики, полученные и разработанные в ходе выполнения этой работы, используются при проведении большого практикума по биотехнологии растений, в лекционных курсах «Клеточная культура растений» и «Физиология растений» для биологов, агрономов и специалистов по защите растений в Томском государственном университете. Получен патент на состав оптимизированной питательной среды для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. Подана заявка на патент по действию селективного света на рост каллусной культуры Centaurea scabiosa L., в материалах которого использованы методы, выработанные в процессе выполнения диссертационной работы.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2007 и 2010), на 9-й международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), на молодежной всероссийской школе-семинаре «Современные фундаментальные
проблемы физиологии и биотехнологии растений и микроорганизмов» (Томск, 2008), на международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010).
Публикации. По теме диссертационной работы публиковано 8 научных работ, среди них 1 статья в журнале рекомендованном ВАК и 1 патент.
Личный вклад. Автор принимал непосредственное участие в постановке задач, проведении экспериментов, в статистической обработке и анализе полученных данных.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы работы изложены на 113 страницах, включающих 44 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 238 наименований, из них 169 на иностранном языке.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю, д.б.н., профессору Карначук Р.А. за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы, д.б.н., профессору Головацкой И.Ф. за помощь в измерении параметров источников света, лаборантам Медведевой Ю.В., Большаковой М.А., к.б.н. Дорофееву В.Ю. за помощь в проведении лабораторных исследований. Особая благодарность к.б.н., с.н.с. Института физиологии растений РАН Кузовкиной И.Н. за предоставленные штаммы Agrobacterium rhizogenes. Также автор искренне признателен к.б.н., доценту Гвоздевой Е.С., к.б.н., старшему преподавателю Ефимовой М.В., д.б.н., профессору Карначук О.В. и д.б.н., профессору Астафуровой Т.П. за помощь в представлении и защите кандидатской диссертации.
