Содержание к диссертации
Введение
1. Аспекты созревания и прорастания зерна ржи и других зерновых культур
1.1. Превращение углеводов при созревании зерна . 8
1.2. Ферменты при созревании и прорастании зерна... 13
1.3. Гормональные процессы при созревании зерна... 22
1.4. Методы оценки устойчивости сортов озимой рай к прорастанию зерна в колосе 33
2. Условия проведения опытов, материал и методы
2.1. Объект исследования 35
2.2. Метеорологические условия в период созревания зерна 38
2.3. Методы биохимических исследований 38
3. Углеводный комплекс созревающего зерна озимой ржи
3.1. Состав и содержание спирте- и водорастворимых углеводов 44
3.2. Динамика накопления крахмала, амилозы и ами-лопектина 56
3.3. Размер крахмальных зерен зерна полной спелости 58
4. Ферменты созревающего и прорастающего зерна озимой ржи
4.1. Активность протеолитических ферментов созревающего зерна 65
4.2. Активность амилолитических ферментов в процессе созревания зерна 67
4.3. Динамика активности амилолитических ферментов при прорастании зерна 77
4.4. Изучение внутрисортовой изменчивости по изоферментному составу амилаз 82
5. Гормональные особенности созревающего зерна озимой реи
5.1. Гиббереллиновая и ингибиторная активность 94
5.2. Ауксиновая активность 101
5.3. Изменение соотношений различных групп регуляторов роста 107
6. Биологические особенности различных сортов озимой ржи 116
7. Обсуждение результатов 122
Выводы 127
Практические рекомендации 129
Литература 130
Приложение 153
- Методы оценки устойчивости сортов озимой рай к прорастанию зерна в колосе
- Состав и содержание спирте- и водорастворимых углеводов
- Динамика активности амилолитических ферментов при прорастании зерна
- Изменение соотношений различных групп регуляторов роста
Методы оценки устойчивости сортов озимой рай к прорастанию зерна в колосе
Для изучения физиолого-биохимических особенностей зерна было отобрано 10 сортов озимой ржи с различной устойчивостью к прорастанию в колосе (на корню). Степень устойчивости каждого сорта предварительно определялась по методике o.Tedin и E.Persson (1963) (см. стр. 33 ). Сорта относительно устойчивые к прорастанию имели 1-2 недельный период покоя семян (Вятка 2, Камалинская 13, Отелло, Monuruvesi, Kirsciies stahler ), у сортов неустойчивых к прорастанию в колосе (местные к-9700 из Пермской обл., к-8432 из Тюменской обл., к-8495 из Читинской обл., к-8523 из Якутской АССР, Чишминская 3) зерно не имело выраженного периода покоя.
Посев проводили чистосортными семенами на полях Пушкинских лабораторий ВИР (под Ленинградом) в 1973/74 и 1974/75 гг, на р делянках площадью 4 м в 3-х повторностях. При выращивании сортов изоляцию не применяли, т.к. было показано (Ракитина А.Н., 1969), что межсортовое опыление (в год опыления) ржи существенно не влияет на состояние углеводно-амилазного комплекса, содержание белка и технологические качества, тогда как зерно, выращенное под искусственным изолятором, формируясь в других микроклиматических условиях, обладает иными биохимическими и технологическими свойствами. При изучении изоферментного состава амилаз брали зерно,полученное из производственных посевов урожая 1978 года. Вятка-2 (к-9441) -. стандартный сорт, выведен в научно-исследовательском институте сельского хозяйства из сорта Вятка. Относится к северорусской экологической группе. Зерно удлиненно-овальное серо-зеленое с примесью желтого, крупное (масса 1000 семян 26-30 г). Содержание белка 10-13%, стекловидность 15-35%. Соломина высокая (140-190 см), полегает значительно. Сорт среднепоздний, зимостойкий, устойчив к вьшреванию и вымоканию, засухоустойчивость средняя. Поражаемость бурой и стеблевой ржавчиной ниже среднего, снежной плесенью слабая. Хлебопекарные качества хорошие. Сорт высокоурожайный (23-34 ц/га), районирован в 13 областях. Камалинская 13 (к-10225). Красноярский край. Продуктивность ниже стандарта. Растения высокие (160-189), склонен к полеганию. Поражается мучнистой росой. Зимует хорошо. Масса 1000 зерен 17-22 г. Содержание белка 19,2-19,9%, лизина в зерне 403-660 мг/ 100 г и 3,1-3,5% в белке. Отелло (к-10394) Швеция. Зимует хорошо. Поражается мучнистой росой. Растения невысокие (134-153 см), устойчивы к полеганию. Урожай ниже стандарта. Масса 1000 зерен 28 г. Monuravesi (к-9345) Финляндия. Продуктивность ниже стандарта. Вызревает почти одновременно со стандартом. Зимует хорошо. Поражается мучнистой росой. Растения высокие (165-193 см), неустойчив к полеганию. Масса Ї000 зерен 21-28 г. Содержание белка в зерне 9,5-12,9%, лизина в белке 4,2-5,5$, в муке 452-593 мг/ 100 г, стекловидность 26-41%. Хлебопекарные качества отличные. Kirschea. stabler (к-4570) ГДР. Урожайность ниже стандарта, созревание на 3-4 дня позже стандарта. Зимостойкость от низкой до высокой (45-95%). Поражается снежной плесенью, мучнистой росой. Высокорослый (174-188), неустойчив к полеганию. Зерно средней и выше средней крупности (масса 1000 зерен 23-28 г). Содержание белка 10,7-12,4%, лизина 440-486 мг/ЮО г зерна и 4,1-4,4 в белке. Хлебопекарные качества отличные, стекловидность 32-37%. б) Неустойчивые к прорастанию в колосе МЕСТНЫЙ ИЗ ПЕРМСКОЙ ОБЛ. (к-9700). Перезимовка хорошая, поражается мучнистой росой, растения высокие (172 см), полегают. Урожайность ниже стандарта, масса 1000 зерен 24 г. Содержание белка 19-22%, лизина в белке 3,2-3,6%, в зерне 410-507 мг/ЮО г. МЕСТНЫЙ ИЗ ТЮМЕНСКОЙ ОБЛ. (к-8432). Урожайность ниже стандарта. Зимостойкость колеблется (67-96%). Поражается снежной плесенью, ржавчиной и мучнистой росой. Высокорослые (162-178 см), неустойчив к полеганию. Масса 1000 зерен 21-25 г. Содержание белка 17-20%, лизина в белке 2,8-3,2%, в зерне 450-600 мг/ЮО г. МЕСТНЫЙ ИЗ ЧИТИНСКОЙ ОБЛ. (к-8495). Урожайность ниже стандарта. Зимостойкость низкая и высокая (57-93$), поражаемость снежной плесенью до 75%. Растения средней высоты и высокие (139-185 см). Устойчивость к полеганию средняя. Зерно мелкое (масса 1000 зерен - 18-23 г). МЕСТНЫЙ ИЗ ЯКУТСКОЙ АССР (к-8523). Урожайность изменчива и может превышать стандарт. Зимостойкость колеблется (67-98%). Растения высокие (145-176 см), полегают. Поражается мучнистой росой и снежной плесенью. Масса 1000 зерен 21-24 г, содержание белка 19,8-20,8%, лизина в белке 2,8-3,3%, в белке 364-632 мг/ЮОг. чишмшская 3 (к-10372). Выведен Башкирским НИИ сельского хозяйства методом отбора. Растения низкорослые с прочной соломиной, неполегают. Зерно средней крупности, овальное, желто-зеленое. Хлебопекарные качества удовлетворительные. Созревают одновременно со стандартом, зимостойкий. К бурой ржавчине устойчив средне. Районирован в 1971 году в Тюменской области. Метеорологические условия в годы проведения опытов существен но различались. Эти данные для периода налива и созревания зерна за 1974-75 гг (июнь, июль, август) приведены на рис. 2.1 и табл. I (Приложение). В течение этого времени (июнь-август) в г. Пушкине выпало в 1974 году 344,1 мм, а в 1975 году 210,1 мм осадков (среднее многолетнее количество осадков составляет 220 мм).
Состав и содержание спирте- и водорастворимых углеводов
В значительно большем количестве в спиртовом экстракте содержатся ди- триса-хариды и фруктозаны. Содержание моносахаров у различных сортов подвержено значительным колебаниям. Так, в зерне урожая 1974 г. у сорта Отелло количество фруктозы, глюкозы и галактозы на этом этапе составляет 12,97% от суммы всех Сахаров, а у сорта Кама-линская 13 - 19,95%, т.е. на 7% больше. В зерне урожая 1975 г. эти различия менее выражены и составляют 15,37% у сорта Отелло и 19,17% у сорта Камалинская 13. Из имеющихся моносахаридов в количественном отношении преобладает фруктоза, наименьшую часть составляет глюкоза. Выращивание сортов в различные годы показало, что фруктоза больше, чем другие моносахары подвержена колебаниям под влиянием условий выращивания. Так, в 1974 г. содержание ее в различных сортах составляло - 0,65-1,12%, а в 1975 г. 1,0-1,7%. Ди- и трисахариды (сахароза и рафиноза) в фазу молочной спелости содержатся в зерне данных сортов в значительной концентрации. Содержание сахарозы в сортах составляет 0,85-1,35% в зерне урожая 1974 г. и 1,0-2,90% в зерне урожая 1975 г., рафи-нозы - соответственно 1,20-2,60% и 1,02-2,75%. Интересно отметить, что трисахарид рафиноза, у устойчивых сортов (Камалинская 13 и Отелло) содержится в большем количестве по сравнению с неустойчивыми (местный из Якутской АССР и Чишминская 3) в оба года исследования. Содержание фруктозанов составляет самый большой процент у всех сортов. Сравнительные данные показали, что у устойчивых сортов их значительно меньше, чем у неустойчивых. Эти различия особенно видны в зерне урожая 1975 г. Большая концентрация Сахаров в зерне 1975 года, по видимому, связана с метеорологическими условиями. К наступлению молочной спелости (как отмечалось в гл. 2) в 1975 году осадков вообще не было, а отсутствие или выпадение незначительного количества осадков способствует более интенсивному накоплению Сахаров.
В восковой спелости семян сахара представлены сахарозой, ра-финозой и фруктозамами, моносахариды отсутствуют. По сравнению с молочной спелостью у устойчивых сортов происходит снижение содержания сахарозы (исключение составил сорт Камалинская ІЗ, в 1974 ) и рафинозы (концентрация рафинозы уменьшалась почти вдвое), тогда как у неустойчивых сортов такое изменение в содержании Сахаров или совсем не наблюдается (урожай 1974 г.), или снижение Сахаров происходит, но незначительное (урожай 1975). Содержание фруктозанов уменьшается у всех сортов.
При переходе от восковой к полной спелости качественный состав Сахаров не меняется, но наблюдается снижение их концентрации у всех сортов в зерне 1974 года. В зерне 1975 года концентрация рафинозы снижается (за исключением сорта Камалинская 13), а концентрация сахарозы увеличивается кроме сорта Отелло, у которого количество этого сахара вдвое снизилось.
Содержание Сахаров в мг на 100 семян показывает (табл.3.3), что количество фруктозанов также снижается в ходе созревания зерна у всех сортов, а количество сахарозы и рафинозы повышается к восковой спелости, а затем изменяется в зависимости от сорта и условий выращивания. Так, у Камалинской 13 содержание рафинозы в зерне урожая 1974 г. уменьшается от молочной к полной спелости с ЗО до ІЗ мг, у остальных трех сортов при переходе от молочной к восковой фазе созревания количество этого сахара увеличивается, а к наступлению полной спелости снижается. В зерне урожая 1975 года количество рафинозы наоборот увеличивается по мере созревания зерна. Максимальное количество сахарозы в 1974 году было в фазу восковой спелости, а в 1975 г. - в восковой и полной.
После проведения гидролиза спиртовой вытяжки найдены и определены три сахара: фруктоза, глюкоза и галактоза (табл. 3.1-3.2). Из числа этих Сахаров количественно преобладает - фруктоза. Содержание Сахаров после гидролиза значительно увеличивается за счет гидролитического распада олигосахаридов и фруктозанов.
В фазе молочной спелости концентрация фруктозы составляет в различных сортах 5,24-8,54% в зерне урожая 1974 и 8,15-10,74% в зерне 1975 года, что составляет 62-80% от суммы всех Сахаров. Это является доказательством того, что вещества остающиеся на старте хроматограммы являются фруктозанами. Фруктозами играют в растении роль запасных веществ, легко вовлекаются в обмен, определяют энергетический уровень в процессе хранения семян.
Водная вытяжка, полученная из семян после спиртового извлечения, содержала комплекс веществ, которые не разделялись и оставались на старте. После гидролиза водной вытяжки семян молочной спелости были определены четыре сахарных компонента: фруктоза, глюкоза, арабиноза, и ксилоза, кроме того, на хроматог-рамме проявлялся еще сахар, который нами не был идентифицирован. этого сахара был близок к галактозе, поэтому концентрацию его рассчитали по галактозе. Характер Сахаров, определенных после гидролиза водной вытяжки (табл.3.4), указывает на наличие и накопление слизеобразующих полисахаридов, в состав которых входят фруктоза, глюкоза, арабиноза, ксилоза и неидентифицирован-ный сахар ( Кретович В.Л., Петрова И.О., 1951).
Динамика активности амилолитических ферментов при прорастании зерна
Активность (К -амилазы пересчитанная на 100 семян (рис.4.4) отражает динамику массы семян, концентрации белка и особенности сортов. Характер изменения активности этого фермента в основном такой же как и при расчете на мг белка.
В заключении надо отметить, что полученные результаты показали значительные различия по активности Ж- и 3 -амилаз в ходе созревания зерна озимой ржи. Амилолитическая активность показывает, как правило, прямую зависимость между активностью фермента и массой 100 семян.
Рядом авторов (Дарканбаев Т.Е., 1964; Аистова Л.В., Плешков Б.П., 1975; olered R., 1977) было отмечено, что в процессе созревания семян ржи и пшеницы максимальная активность амилоли-тических ферментов наблюдается в фазу молочной спелости и по мере созревания происходит снижение активности этих ферментов. Нами же показано (Хорева В.И., 1980), что у различных по устойчивости к прорастанию в колосе сортов величина (3 -амилазной активности была высокой на протяжении всего периода созревания, явных различий между устойчивыми и неустойчивыми сортами по этому показателю не наблюдалось. Максимальная активность (3 -амилазы проявлялась в фазу полной спелости в оба года исследования. Уровень d\ -амилазы в ходе созревания различных сортов невелик. У большинства сортов максимальная d\ -амилазная активность также проявлялась в фазу полной спелости, причем во влажном 1974 году в группе неустойчивых сортов ее содержание было большим.
Одним из основных ферментов в обмене веществ в начале прорастания является f\ -амилаза. Известно, что активация амилолитических ферментов при прорастании зерна озимой ргки в одинаковых условиях протекает с различной скоростью, что позволяет выявить различия сортов к прорастанию в колосе.(Ракитина А.Н., 1970). Вместе с тем показано, что корреляцию между активностью амилаз и прорастанием нельзя считать очень строгой (Баранов А.А. и др., 1981; Adam Б. , 1980).
Известно к тому же, что многие растительные ферменты, в том числе амилолитические, обладают гетерогенностью. Изоферментный состав амилаз в процессе прорастания ржи показан в работах ряда исследователей ( Y/agenaar R., Eugtenborg «E.F. 1973; Wilp-R., Buschbeelc R„ , 1978). Для изучения компонентного состава эти авторы использовали гомогенат из семян, тогда как из литературных данных известно, что у перекрестноопыленных культур заметно выражен полиморфизм по многим признакам. (Пенева Т.И., Конарев В.Г., 1978; Артемова Н.В., 1979; Новиков И.Н. и др., 1980). Представляется интересным выяснить, можно ли в какой-то степени объяснить различия в несоответствии между прорастанием семян и активностью амилолитических ферментов их изоферментным составом. В связи с этим мы провели определение активности амилолитических ферментов в разные сроки прорастания и изучили изменчивость изоферментного состава у сортов озимой ржи, различных по устойчивости к прорастанию в колосе (Хорева В.И., Кудрякова Н.В., 1982).
Данные определения Ж- и (Ь -амилаз в разные сроки прорастания пяти устойчивых и пяти неустойчивых к прорастанию сортов ржи представлены на рис. 4.5 и табл. 4.4-4.5. Показано, что в сухом, непроросшем зерне ржи имеется (2 -амилазная активность (от 8 мг г.к./мг белка у сортов Камалинская 13, Kirsches stabler, местный из Якутской АССР до 22 мг г.к./мг белка у сортов Отелло, Monuruvesi , Чишминская 3), которая увеличивается уже в первые сутки почти у всех сортов. В процессе прорастания зерновок самая высокая активность (3 -амилазы была на третьи сутки у сорта местного из Пермской области.
Активность с{ -амилазы в непроросшем зерне отсутствует, (рис. 4.5, табл.4.5), но уже в первые сутки прорастания у всех сортов начинается синтез d\ -амилазы и проявляются некоторые различия по сортам. Самая высокая активность была у устойчивого сорта Kirsehes stabler - 6,9 мг г.к/мг белка. У неустойчивого сорта местного из Якутской АССР активность d -амилазы хотя и ниже, чем у сорта Kirsehes; stabler , но превышает все остальные сорта (2,7 мг г.к/мг белка). На вторые сутки прорастания резкое повышение активности d\ -амилазы по сравнению с первыми наблюдалось у сортов Отелло (в 78 раз) и Чишминская 3 (в 40 раз). У сортов KiXBchea stabler местный из Якутской АССР и Пермской обл., у которых в первые сутки была -амилазная активность выше по сравнению с другими сортами, на вторые сутки увеличилась в меньшей степени - в 5-14 раз. На третьи сутки активность (к -амилазы продолжала повышаться у всех сортов. Четвертые сутки характеризовались максимальным уровнем активности д\ -амилазы у всех сортов. Особенно высокая (к -амилазная активность в этот период прорастания отмечалась у неустойчивых сортов местного из Якутской АССР, из Пермской обл. и Чишминская З (159-125 мг г.к./мг белка).
Изменение соотношений различных групп регуляторов роста
В результате всех этих изменений в группе устойчивых к прорастанию сортов наблюдается преобладание ауксиновой активности над гиббереллиновой во время всего периода созревания, но особенно в фазу молочной и полной спелости, у неустойчивых к прорастанию сортов близкие уровни ауксинов и гиббереллинов в зерне наблюдаются лишь в молочной спелости, а на более поздних этапах развития в их зерне преобладали гиббереллины.
Можно сказать, что полностью созревшее зерно устойчивых к прорастанию сортов ржи отличается от зерна неустойчивых большим уровнем свободных ауксинов, а у неустойчивых к прорастанию сортов ржи зерно было богаче гиббереллинами. Отношение ауксиновой активности к гиббереллиновой в фазу молочной и полной спелости в зерне устойчивых сортов было в 2-3,5 раза выше, чем у неустойчивых, в восковой спелости эти различия между группами несколько меньше ( / 1,5 раза).
Таким образом, характерной особенностью сортов устойчивых к прорастанию в колосе являлось высокое содержание ауксинов, особенно, в фазе молочной спелости, где ауксиновая активность в среднем для 5 устойчивых сортов более чем в два раза превышала подобную активность у неустойчивых сортов. Различия между группами сортов по величине отношения ауксиновой активности к гиббе-реллиновой указывают на важную роль баланса гормонов в прорастании зерна.
Специальное исследование функции ауксина было проведено, на зернах ячменя ( MincMn A.., Harmey м. , 1975). В этом исследовании, предпринятом с целью выяснения, может ли природный покой семян ячменя объясняться содержанием индолилуксусной кислоты в зерне, было установлено, что намачивание зерна в ИУК примерно на 8 час. тормозило проявление действия гиббереллина , как известно, сильно стимулирующего прорастание. В течение тех же 8 час. в зерне происходило превращение экзогенной ИУК в неидентифициро-ванное индольное соединение. Высокая способность зерна ячменя включать в обмен ИУК проявлялась очень рано уже через 12 суток после цветения, чем и объяснялось отсутствие ИУК в зерне ячменя. Данные наших исследований показывают достаточно определенную зависимость между устойчивостью зерна к прорастанию и повышенным уровнем ауксинов. Значительно более низкий уровень эндогенных ауксинов в зерне неустойчивых сортов позволяет предполагать, что у них эта способность метаболизировать ауксин проявляется значительно раньше, чем у сортов устойчивых к прорастанию, с чем, вероятно и связано резкое отличающийся уровень ауксинов в фазу молочной спелости в зерне этих двух групп сортов.
Стимулирующее действие гиббереллинов на прорастание является общеизвестным и широко используется на практике - это свойство основано на его способности активировать гидролитические ферменты. Следовательно, избыток гиббереллинов в зрелом зерне должен способствовать легкости прорастания, что и наблюдается в группе неустойчивых к прорастанию сортов ржи. Ингибиторы роста являются в то же время и ингибиторами прорастания семян. Определение динамики этой группы регуляторов роста в ходе созревания зерна твердой пшеницы показало, что они проявляются в зерне лишь в фазу восковой спелости, на более раннем этапе - в фазу молочной спелости их не удавалось обнаружить ( Gtfilli I. et al., , 1975).
Ингибиторы (биопробой с ростом колеоптилей) на этом этапе созревания в зерне устойчивых сортов проявляли слабую активность (исключение составил сорт Kirsches stahler в 1974 г.), в зерне урожая 1975 года у трех из пяти изученных сортов они совсем не были обнаружены, тогда как легкопрорастающие сорта имели довольно значительный уровень этих веществ на всех этапах созревания (рис. 5.6, 5.7, 5.9). Повышенный уровень ингибиторов, наблюдаемый у неустойчивых сортов ржи, отчасти можно объяснить тем, что вещества, ингибирующие рост колеоптиля злаков, не всегда вызывают покой зародышей семян (Турецкая Р.Х., 1969; Черна-вина М.В., 1973).
Данные настоящей работы впервые показали существование сортовых различий в гормональном составе зерна с разной способностью к прорастанию. Легкость прорастания зерна в колосе, создающая опасность ухудшения его качества, оказалась связанной с преобладанием гиббереллинов над ауксинами, которое проявляется при переходе от молочной к восковой спелости. Именно этот этап созревания, когда у зерна появляется способность к прорастанию, был найден критическим для зерна как озимой, так и яровой ржи при изучении динамики ауксинов в ходе созревания, поскольку с ним было связано резкое снижение уровня свободных и повышение относительного содержания связанной форм ауксина (Hatsher Е. , 1945).
Полученные результаты позволяют предположить, что содержание ауксинов играет существенную роль в торможении прорастания зерна ржи. Это открывает новые перспективы как для селекции на повышенную устойчивость к прорастанию на корню путем подбора форм с высоким уровнем ауксинов и низким уровнем гиббереллинов в зерне, особенно на ранних этапах его созревания, так и для разработки приемов повышения устойчивости при воздействии синтетическими регуляторами роста.
