Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Микроклональное размножение и хранение растений в культуре in vitro 10
1.2. Влияние изменения интенсивности освещения на рост и развитие растительных организмов 16
1.3. Влияние низких температур на рост и развитие растительных организмов 17
1.3.1. Стрессовое воздействие внешних факторов на растения 17
1.3.2. Неблагоприятное воздействие температуры на растения 19
1.3.3. Влияние охлаждения на развитие растений 19
1.3.4. Устойчивые и неустойчивые к холоду виды растений 20
1.3.5. Молекулярные механизмы процессов, индуцируемых холодом 21
1.3.6. Рецепция и трансдукция холодового сигнала 21
1.3.6.1. Роль ионов Са+ в трансдукции холодового сигнала 22
1.3.6.2. Роль МАР-киназ в трансдукции холодового сигнала 23
1.3.6.3. Гены и белки, отвечающие за холодоустойчивость 24
1.3.7. Изменение содержания пролина при стрессовых воздействиях 27
1.3.8. Роль жирных кислот мембранных липидов
в холодоустойчивости растений 30
1.3.9. Изменение углеводного обмена при воздействии холода 33
1.3.10. Механизмы процессов, происходящих во время акклиматизации растений к холоду 34
1.4. Механические повреждения и устойчивость к ним 35
1.4.1. Тигмотропизм, тигмонастии и тигмоморфогенез 35
1.4.2. Ответы на механическое воздействие на клеточном уровне 38
1.4.3. Роль ионов Са как вторичного посредника в передаче сигнала механического воздействия 39
1.4.4. Участие этилена, системина и жасмоновой кислоты в ответных реакциях при механическом повреждении растений 39
1.5. Оксидативный стресс 42
1.5.1. Активные формы кислорода 42
1.5.2. Пероксид водорода 44
1.5.3. Пероксидазы 46
1.5.4. Антиоксиданти 49
1.5.4.1. Аскорбиновая кислота 49
1.6. Изменчивость генома при культивировании in vitro изолированных клеток, тканей, органов растений 53
1.6.1. Причины и механизмы сомаклональной изменчивости 53
6.1.1. Факторы, влияющие на сомаклоналъную изменчивость 57
6.1.2. Выявление сомаклональных вариантов 59
6.1.3. Изменчивость растений в системе микроклоналъного размножения 60
2. Материалы и методы исследования 63
2.1. Объект исследования 63
2.2. Методы исследования 63
2.2.1. Микроклональное размножение растений 63
2.2.2. Длительное беспересадочное хранение in vitro и измерение морфофизиологических показателей микрорастений 65
2.2.3. Измерение биохимических показателей растений
ежевики при длительном хранении in vitro 65
2.2.3.1. Определение содержания хлорофиллов 66
2.2.3.2. Определение содержания свободного пролина 66
2.2.3.3. Определение содержания пероксида водорода 67
2.2.3.4. Выделение легкорастворимых и ионосвязанных пероксидаз и определение их активности 68
2.2.3.5. Определение содержания аскорбиновой кислоты 69
2.2.4. RAPD анализ растений малины и ежевики 69
2.3. Статистическая обработка результатов 74
3. Результаты и обсуждение 75
3.1. Изучение динамики морфологических показателей микрорастений ежевики, малины и земляники, сохраняемых в условиях длительного хранения in vitro 75
3.1.1. Клональное микроразмножение растений 75
3.1.2. Рост и развитие пробирочных растений ежевики, малины и земляники в условиях длительного хранения in vitro 78
3.1.3. Рост и развитие микрорастений ежевики, сохраняемых при +22С 86
3.2. Динамика биохимических показателей микрорастений ежевики в условиях длительного хранения in vitro 90
3.2.1. Динамика содержания хлорофиллов аиЪ в процессе длительного низкотемпературного хранения in vitro 90
3.2.2. Динамика содержания свободного пролина в процессе длительного низкотемпературного хранения in vitro 92
3.2.3. Динамика содержания пероксида водорода у растений ежевики в процессе длительного низкотемпературного хранения in vitro 94
3.2.4. Динамика активности пероксидаз у растений еоісевики в процессе длительного низкотемпературного хранения in vitro 96
3.2.5. Динамика содержания аскорбиновой кислоты у растений ежевики в процессе длительного низкотемпературного хранения in vitro 100
3.3. Молекулярный анализ микрорастений ежевики и малины с помощью RAPD-метода после длительного низкотемпературного хранения in vitro 101
3.3.1. Модификация методики выделения и очистки ДНК малины и ежевики 102
3.3.2.Подбор праймеров для работы с образцами ДНК малины и ежевики 103
3.3.3. Отбор RAPD праймеров, выявляющих полиморфизм среди сортов, перспективных для генотипирования сортов малины и ежевики 104
3.3.4. Молекулярный анализ микрорастений ежевики и малины с помощью RAPD-метода после длительногонизко температурного хранения in vitro
Заключение
Выводы
Список использованной литературы
- Влияние низких температур на рост и развитие растительных организмов
- Участие этилена, системина и жасмоновой кислоты в ответных реакциях при механическом повреждении растений
- Длительное беспересадочное хранение in vitro и измерение морфофизиологических показателей микрорастений
- Рост и развитие пробирочных растений ежевики, малины и земляники в условиях длительного хранения in vitro
Введение к работе
Актуальность. Одной из наиболее актуальных задач биологической науки является сохранение биоразнообразия, важным компонентом которого является генетическое разнообразие культурных и дикорастущих видов растений. Полевые коллекции вегетативно размножаемых растений, сохраняемые в генбанках традиционным способом, несут значительные потери из-за воздействия экстремальных факторов внешней среды, заболеваний и вредителей. Преимущества метода хранения in vitro заключаются в возможности сохранять коллекции в контролируемых условиях среды, в компактности коллекций, возможности массового и ускоренного размножения независимо от времени года и в возможности оздоровления растений от инфекций. В коллекциях in vitro хранится не более 10% образцов полевых коллекций. Это связано с тем, что на сегодняшний день методы хранения in vitro разработаны лишь для ограниченного числа видов, фактически отсутствуют методы мониторинга жизнеспособности микрорастений, недостаточно разработаны методы оценки генетической стабильности in vitro растений, не определены сроки беспересадочного хранения in vitro. Например, полевые коллекции ценных ягодных культур земляники, малины, ежевики в ВИР включают около 1800 образцов, собранных научными экспедициями в различных странах мира, а в условиях in vitro хранится только около 200 образцов (Гавриленко и др., Существует несколько способов хранения in vitro, самым распространенным является депонирование пробирочных растений в условиях низких положительных температур (Reed, 1992; Высоцкая, 1994; Дунаева, Гавриленко, 2007). С другой стороны, условия длительного хранения in vitro при низких положительных температурах могут воздействовать на растения как стрессовый фактор. В связи с этим раскрытие механизмов устойчивости и выявление физиолого-биохимических признаков, коррелирующих с устойчивостью растений к воздействиям условий хранения in vitro, приобретают особую актуальность.
Поскольку условия хранения in vitro могут оказывать на растения стрессовое воздействие, предполагается, что во время хранения при пониженной температуре в растительном организме включается система ответных реакций на стрессоры. Как правило, большинство различных стрессовых воздействий вызывает в организме также и окислительный стресс. Известно, что в ответ на многие стрессовые факторы у растений может происходить образование активных форм кислорода (АФК) (Foyer, Noctor, 2005). Накопление АФК в клетках может приводить к окислительному повреждению макромолекул, в том числе и к нарушениям структуры ДНК. Одним из важных элементов в системе окислительновосстановительных реакций клеток является аскорбиновая кислота (Pignocchi, Foyer, 2003). Аскорбиновая кислота как антиоксидант также играет важную роль при утилизации пероксида водорода, который является одной из активных форм кислорода. В ответных реакциях на окислительный стресс огромную роль также играют пероксидазы - ферменты, которые катализируют реакцию окисления разных субстратов, используя в качестве окислителя пероксид водорода (Fujiyama et al., 1995; Шарова, 2004).
Во многих исследованиях показана осморегуляторная роль пролина, содержание которого возрастает в десятки и сотни раз при действии на растения неблагоприятных факторов внешней среды (Goring, 1979; Rui et al., 1980). Заметное увеличение содержания свободного пролина в различных органах растений при стрессах вызывает интерес многих исследователей в связи с возможностью использования этого показателя в качестве биохимического маркера в защитных реакциях растений. Однако до сих пор еще не изучена его динамика в процессе длительного хранения растений in vitro при низких положительных температурах.
Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей микроразмножения и длительного хранения в условиях in vitro различных сортов ежевики, малины и земляники, а также анализ динамики морфофизиологических и биохимических показателей сохраняемых микрорастений.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить меж-, внутривидовую изменчивость по способности к клональному микроразмножению и способность различных сортов малины, ежевики, земляники к длительному хранению in vitro.
2. Изучить динамику морфологических показателей микрорастений различных сортов ежевики, малины и земляники, сохраняемых в условиях длительного хранения in vitro.
3. Проанализировать изменения биохимических показателей (уровня хлорофиллов а и Ь, свободного пролина, аскорбиновой кислоты, пероксида ежевики.
4. Провести молекулярный анализ микрорастений различных сортов ежевики и малины после длительного низкотемпературного хранения in vitro и исходных растений аналогичных сортов с помощью RAPD-ысющ!.
Научная новизна. Впервые был проведен комплексный анализ морфофизиологического состояния хранящихся в условиях in vitro при пониженной температуре микрорастений различных сортов ежевики, малины и земляники.
Впервые исследована динамика уровня свободного пролина, хлорофиллов, аскорбиновой кислоты, пероксида водорода и активности пероксидаз в взаимосвязь между изменением содержания пероксида водорода и активностью Полученные в данной работе результаты способствуют пониманию механизмов ответно-приспособительных реакций растительного организма на стрессовые воздействия условий депонирования in vitro растений. Проведен молекулярный анализ микрорастений, сохраняемых в условиях in vitro, и исходных растений; не выявлено различий в их RAPD-ciiQKrpax.
Практическая ценность. Определены физиолого-биохимические параметры растений, которые могут использоваться для выявления более устойчивых к условиям хранения in vitro образцов.
Для оценки выживаемости микрорастений ежевики в условиях низкотемпературного хранения в качестве экпресс-теста предложен мониторинг уровня пероксида водорода.
Модифицирован метод выделения и очистки ДНК растений ежевики и малины.
Апробация работы. Основные положения представлены на конференции молодых ученых и аспирантов в СЗНМЦ РАСХН «Формирование конкурентоспособности молодых ученых» (Пушкин, Санкт-Петербург, 2006), II Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы» (Санкт-Петербург, 2007), Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работ, в том числе 1 статья и 3 тезисов докладов на международных конференциях.
Влияние низких температур на рост и развитие растительных организмов
Хорошо известно, что ответные реакции растений на стрессовые факторы очень сложны, и в них вовлечены различные метаболические пути (Чиркова, 2002). При рассмотрении концепции стресса в целом предполагается, что различные стрессовые воздействия (высокие и, низкие температуры, засуха, отсутствие кислорода, засоление и др.) могут основываться на сходных паттернах адаптационных механизмов (Leshem, 1996; Реагсе, 1999). Этот принцип, который называется общий адаптационный синдром (ОАС), впервые был разработан для млекопитающих Гансом Селье (Селье, 1972). Растительные организмы также могут подвергаться тепловому стрессу днем и отрицательным температурам ночью. Оба эти стресса вызывают обезвоживание, то есть механизмы противодействия растений к высоким и низким температурам могут быть схожими. Именно сходные механизмы устойчивости к различным типам стрессовых воздействий дают растениям большие адаптационные преимущества.
В природе растения подвергаются различным видам стресса одновременно. Засуха и засоление часто связаны между собой, так же, как и жара и обезвоживание. Например, теплый и сухой ветер не повлияет на растительность таким же образом, как теплый воздух с относительной влажностью 90%.
Когда растение подвергается стрессовым воздействиям, запускается некоторая последовательность событий, которые могут быть разделены на четыре фазы: 1. Фаза торможения, соответствующая начальным ответным реакциям на воздействие стрессора, выражающаяся в нарушении структурных и функциональных условий жизнедеятельности. В течение этой фазы снижается жизнеспособность и устойчивость растений, а процессы катаболизма преобладает над анаболизмом. Если стресс слишком силен, наблюдаются серьезные повреждения. В том случае, когда интенсивность стрессовых воздействий умеренна, инициируется постепенное восстановление метаболизма. 2. Фаза адаптации, в течение которой организм приспосабливается к стрессору. 3. Если адаптивный потенциал организма недостаточен для преодоления влияния стрессора, а продолжительность или интенсивность стрессового воздействия слишком значительна, наступает фаза истощения. Во время этой фазы жизнеспособность растения постепенно падает, что приводит к его повреждению или даже гибели, при этом растения становятся более восприимчивыми к патогенам и другим стрессовым факторам. 4. Если стрессорное воздействие прекращается до того, как процессы клеточной гибели становятся доминирующими, наступает фаза регенерации, в течение которой появляются новые адаптивные и компенсаторные механизмы (Larcher, 1995; Leshem, 1996; Renaut, 2004).
Наряду со светом и водой, температура является для растений одним из самых критических факторов внешней среды. Температурный стресс разделяют на три категории: заморозки, низкие положительные температуры и температуры, вызывающие тепловой шок (Graham, Patterson, 1982; Guy, 1990; Alberdi, Corcuera, 1991; Iba, 2002).
Понятие оптимальной температуры - фундаментальный принцип биологии. Для каждого вида в конкретной окружающей среде существует свой температурный оптимум (Реагсе, 1999). Этот оптимум часто локализуется в температурном интервале, ограниченном снизу точкой замерзания воды, а сверху - температурой денатурации белков (Chrispeels, Agre, 1994). Под устойчивостью к низким температурам подразумевают холодостойкость и морозоустойчивость, т. е. способность растений выживать в условиях низких положительных температур и при заморозках (Renaut, 2004). Субоптимальные температуры могут серьезно повреждать растения, у которых есть только две стратегии преодоления этих повреждений: избегать их (посредством осуществления своего жизненного цикла в менее стрессирующие периоды) или приспосабливаться к ним (Renaut, 2004). В результате умеренного температурного стресса способность выживать при воздействии температурного стресса повышается (Sung et al., 2003).
В листьях растений, повреждаемых охлаждением, нарушаются процессы фотосинтеза, транспорта ассимилятов, дыхания, синтеза белков. Диапазон повреждающих температур сильно варьирует в зависимости от вида растения. (Renaut, 2004). Однако воздействие низких (но не замораживающих температур) может иметь ряд благоприятных последствий для растений, например таких, как прерывание покоя семян и почек, инициация цветения (вернализация), повышение устойчивости к более сильным холодам (закаливание), дозревание некоторых плодов (например, у Pyrus communis) (Huner, 1998).
Низкие положительные температуры (от 0С до 15С) могут приводить к сильным повреждениям или даже к гибели организма (Steponkus, 1984). Повреждающий эффект будет определяться конкретным видом растения. Воздействие низкой (не замораживающей) температуры зависит от ее величины и длительности воздействия.
Многие злаки и садовые культуры, происходящие из тропических или субтропических областей (рис, томаты, кукуруза, цитрусовые и т. д.) чувствительны к низким температурам в климатических районах, близких к пределам их холодоустойчивости (Graham, Patterson, 1982). Реакция растений на низкие температуры сильно зависит от его видовой принадлежности, стадии развития, времени года и продолжительности воздействия низкой температуры (Alberdi, Corcuera, 1991).
Способность приспосабливаться к стрессовым условиям окружающей среды иногда называют мерой пластичности растения (Olsen, 1997). Выделяют три типа пластичности (Larcher, 1995), отвечающих за адаптацию растений:
1) холодочувствительные растения, которые повреждаются при температурах от0Сдо15С;
2) нечувствительные к холоду растения, которые продолжают расти и развиваться, и могут завершать свой цикл при низких положительных температурах;
3) устойчивые к холоду растения, способные противодействовать охлаждению и выдерживать нарушение метаболизма (Larcher, 1995).
Чувствительность к низкой температуре у растений тканеспецифична. Листья отвечают на холод не так, как почки или корни, и эти различия могут быть также связаны с месторасположением органов в растении (Larcher, 1995).
Участие этилена, системина и жасмоновой кислоты в ответных реакциях при механическом повреждении растений
В ответ на механическое повреждение в клетках растений наблюдается векторное перемещение органоидов. Например, механическое воздействие стеклянного капилляра вызывает направленное перемещение хлоропластов, находящихся на значительном расстоянии от места повреждения (Sato et al., 1999). Механическое воздействие вызывает перемещение ядра по направлению к участку клеточной стенки, нарушенному под воздействием микроиглы (Kennard, Cleary, 1997; Gus-Mayer et al., 1998).
В регуляцию ответных реакций на механические воздействия вовлечены этилен, системин, жасмоновая кислота, внутриклеточный кальций и активные формы кислорода. Однако конкретные механизмы трансдукции механических сигналов в растениях пока еще не понятны (Batiza et al., 1996; Calaghan, White, 1999).
Имеются сведения о том, что механические воздействия приводят к активации механочувствительных ионных каналов и изменению трансмембранных ионных потоков (Falke et al., 1988; Cosgrove, Hedrich, 1991; Ding, Pickard, 1993; Garrill et al., 1994; Kikuyama, Tazawa, 2001). Альтернативная возможность состоит в том, что белки, которые связывают цитоскелет и/или клеточную стенку с плазматической мембраной могут функционировать как механорецепторы подобно к тому, как интегральные белки функционируют в клетках животных (Wayne et al., 1992; Ingber, 1998; Jaffe et al., 2002; Hayashi, Takagi, 2003). Возможно также, что функционирование механочувствительных каналов и трансмембранных белков, взаимосвязаны и совместно воспринимают механические стрессовые воздействия, а мембранные потоки ионов (в первую очередь Са ) служат вторичными посредниками (Mano, Driscoll, 1999; Mobasheri et al., 2002).
При механических воздействиях на растения, также как и при других стрессах (например, как при повреждении патогенами), может иметь место индуцирование программированной клеточной смерти. Здесь большую роль играет оксид азота (Garcts, 2001). Даже небольшого механического воздействия достаточно, чтобы вызвать программированную клеточную смерть. На растениях Kalanchoe diagramontana было показано, что при воздействии на листья силы тяжести 10-50 г в течение 10-60 миігут индуцируется гибель клеток растений (Pedroso, Durzan, 2000).
Внутриклеточный кальций вовлекается как важный вторичный посредник в передаче сигналов, как в растительных, так и в животных клетках. Очень быстрое увеличение внутриклеточного Са обнаружено при механических воздействиях на растения (Batiza et al., 1996; Calaghan, White, 1999). Хорошей моделью для анализа изменений концентрации ионов Са2+ в цитоплазме в ответ на многие стимулы являются трансгенные растения, синтезирующие Са +-зависимый люминесцентный белок акворин (Knight, 2000). В частности, у акворин-трансгенных растений проявляется быстрое увеличение внутриклеточного Са + в ответ на воздействие ветра или на механический контакт (Knight et al., 1991; Knight et al., 1992). Активные формы кислорода (АФК) также являются важными сигналами в морфогенезе растения и ответах на механические стимулы (Mori, Schroeder, 2004). АФК были обнаружены немедленно после механического воздействия (Legendre et al., 1993; Yahraus et al., 1995; Legue et al., 1997; Gus-Mayer et al., 1998). При этом наблюдалось совпадение изменений АФК и Са под действием механических стимулов, что свидетельствуют о том, что АФК могут участвовать в регуляции активности Са-каналов (Mori, Schroeder, 2004).
Этилен может синтезироваться практически во всех частях растительного организма, однако более активно он образуется в меристематических тканях и в зоне узлов. Поскольку синтез этилена индуцируется при стрессовых воздействиях (затопление, охлаждение или высокие температуры, патогены, засуха, механические воздействия), его иногда называют стрессовым гормоном (Braam, 2005).
Очень характерным процессом, который активирует этилен, является ускорение старения листьев. У этиленовых мутантов etrl и ein, которые не реагируют на обработку этим гормоном, задерживаются процессы распада хлорофилла и других компонентов хлоропластов, а общая продолжительность жизни возрастает на 30%. Предполагается, что механизм действия этилена связан не с индукцией программы старения, а, вероятнее всего, с повышением скорости процессов старения растительного организма. Помимо листьев, этилен также ускоряет старение цветков и плодолистиков. Если же цветки обработать ингибиторами синтеза или действия этилена, их цветение будет происходить более длительное время (Braam, 2005).
Важную роль этилен выполняет в процессе прорастания семян двудольных растений. Верхняя часть формирующегося побега этиолированных проростков двудольных растений имеет форму крючка из-за того, что растяжение клеток в его верхней части идет интенсивнее, чем в нижней. Такая форма облегчает продвижение проростка через почву и защищает от повреждения его нежную апикальную меристему. Процесс формирования крючка и поддержания его за счет асимметрического роста контролируется этиленом. Интенсивность синтеза этилена максимальна в зоне изгиба и возрастает при механическом раздражении крючка при продвижении и трении его о почвенные частицы. Как только этиолированный проросток выходит из почвы на свет, происходит быстрое снижение скорости синтеза этилена и крючок распрямляется.
Применение экзогенного этилена может привести к морфологическим и физиологическим изменениям, которые напоминают аспекты тигмоморфогенеза (Goeschl et al., 1966; Brown, Leopold, 1972; Jaffe, Biro, 1979; Erner, Jaffe, 1983; de Jaegher et al., 1987; Telewski, 1995). Образование этилена происходит после механического воздействия на растения (Goeschl et al., 1966; Biro, Jaffe, 1984; Takahashi, Jaffe, 1984). Однако, не смотря на то, что этилен играет очень важную роль в тигмоморфогенезе, регулировать весь спектр ответных реакций растений на механические воздействия этот гормон не способен (Boyer et al., 1983; Biro, Jaffe, 1984; Biddington, 1986; Boyer et al., 1986; Johnson et al., 1998; Braam, 2005).
Длительное беспересадочное хранение in vitro и измерение морфофизиологических показателей микрорастений
При изучении динамики биохимических показателей контролем служили исходные микрорастения ежевики, выращенные в условиях in vitro при +22С и фотопериоде короткого дня, не заложенные на низкотемпературное хранение. Динамику изменения биохимических показателей сравнивали у контрольных растений и у микрорастений, хранящихся при температуре +4С. В каждом варианте (контроль и микрорастения после 4, 8 и 12 месяцев хранения) листья микрорастений взвешивали и фиксировали в жидком азоте; замороженную листовую ткань использовали для анализов. У контрольных микрорастений и в вариантах 4, 8 и 12 месяцев хранения анализировали следующие биохимические показатели: содержание пигментов (хлорофиллов а, Ь), свободного пролина, пероксида водорода, аскорбиновой кислоты, а также активность легкорастворимых и ионосвязанных с клеточными стенками пероксидаз.
Содержание хлорофиллов а и Ъ определяли фотометрическим методом (Миллер, Савицкая, 1974). Фиксированные в жидком азоте листья ежевики (10—30 мг) гомогенизировали в фарфоровой ступке с 96%-ным этанолом. Гомогенат фильтровали с использованием стеклянного фильтра Шотта, колбы Бунзена и водоструйного насоса. Осадок в ступке и на фильтре промывали до обесцвечивания небольшими порциями этанола и им же доводили объем раствора в пробирке до 5 мл. Измерение концентрации спиртовых экстрактов хлорофиллов проводили на спектрофотометре (СФ-46; ЛОМО) при длине волны максимального поглощения хлорофиллов а и Ъ (к = 618 нм и X = 664 нм соответственно). Для определения концентрации (С) пигментов в пробе использовали следующие формулы: Схл.я = 9,93 хЕ6б4-0,777 хЕ618; Схл.б — 17,6 х Ебі8 — 2,81 х Евв4, С.а+ь = 7,12 х Еб64 + 16,8 х Е618 (Васильева, 1978). Концентрацию пигментов в тканях листьев ежевики рассчитывали в миллиграммах на 1 г сырой массы.
Для определения содержания свободного пролина использовали методику Бэйтса (Bates et al., 1973). Метод основан на взаимодействии свободного пролина с нингидриновым реактивом, образующим розово-красную окраску.
Навеску листовой ткани ежевики (150-300 мг) гомогенизировали в 10 мл 3%-ного раствора сульфосалициловой кислоты. Гомогенат центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. К 2 мл супернатанта в реакционной пробирке добавляли 2 мл нингидринового реактива и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Пробирки закрывали пробкой с обратным холодильником и выдерживали 1 ч на кипящей водяной бане. Затем пробы охлаждали до комнатной температуры, прибавляли к ним по 4 мл толуола и тщательно перемешивали встряхиванием. Верхний слой толуола, содержащий окрашенный комплекс пролин-нингидрин, отделяли от водной фазы, и колориметрировали на ФЭК-56-М при 490 нм в 3-миллиметровых кюветах.
Содержание свободного пролина определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием растворов пролина в диапазоне концентраций от 50 до 150 мкг/мл, и выражали в микрограммах на 1 г сырой массы.
Определение содержания пероксида водорода Для определения содержания пероксида водорода замороженные листья (10-30 мг) растирали с кварцевым песком в 1 мл 0,4 М НСЮ4, с добавлением 10-20 мг сорбента нерастворимых фенольных соединений поливинилполи-пирролидона. Экстракт отделяли центрифугированием (15 мин при 2000 g) и нейтрализовали добавлением 0,32 мл 1 N КОН. Квоту экстракта (0,5 мл) наносили на колонку объемом 4 мл с анионообменной смолой (Dowex. СГ, 1x2, 50-100 mesh) и элюировали бидистиллированной водой. Первые 2 мл элюата отбрасывали, остальную часть собирали в порции по 1,5 мл, в которых определяли содержание Н2Ог по методу FOX (Jiang et al., 1990; Gay, Gebicki, 2000). Этот метод основан на изменении окраски ксиленового оранжевого при окислении пероксидом водорода Fe2+ в Fe3+ в растворе разбавленной серной кислоты. С Fe3+ связывается краситель ксиленовый оранжевый, образуя комплекс с максимумом поглощения при 560 нм. К пробе (1,5 мл) добавляли равный объем FOX-реагента. Интенсивность окрашивания измеряли через 45 мин при 560 нм на СФ-46 (ЛОМО). Концентрацию пероксида водорода в пробе рассчитывали по калибровочной кривой, построенной с использованием растворов Н202 (10-40 мкМ) в хлорной кислоте, подверженных такой же, как проба, процедуре очистки на анионообменной колонке.
Активность растворимых и ионосвязанных с клеточными стенками пероксидаз определяли по скорости окисления гваякола по стандартной методике (Lin, Као, 1999). Всю процедуру экстракции пероксидаз проводили при 0-4С. Замороженные в жидком азоте листья ежевики (10-30 мг) растирали с кварцевым песком в 1,5 мл К-фосфат-цитратного буфера (10 мМ, рН 6,0) с добавлением 10-20 мг сорбента фенольных соединений поливинилполипирролидона.
Экстракт, содержащий растворимые, в основном вокуолярные пероксидазы, отделяли центрифугированием (10 мин 2000 g) и очищали от мешающих определению пероксидазной активности низкомолекулярных соединений (смол, аскорбиновой кислоты) пропусканием через колонку сефадекса G-25. Для этого 1 мл экстракта наносили на колонку объемом 4 мл и проводили элюцию экстрагирующим (К-фосфат-цитратным) буферным раствором. Пероксидазы собирали во 2-м и 3-м миллилитрах элюата.
Для выделения ионосвязанных с клеточными стенками пероксидаз осадок промывали 5 мл экстрагирующего буферного раствора, содержащего 0,2% детергента тритона Х-100, очищая клеточные стенки от мембранных компонентов. Супернатант отделяли центрифугированием (10 мин 2000g) и отбрасывали. Затем осадок промывали 5 мл экстрагирующего буферного раствора и центрифугировали при тех же условиях. Ионосвязанные с клеточными стенками пероксидазы экстрагировали из промытого осадка посредством 30-минутной инкубации в 1 мл 1М NaCl, экстракт отделяли центрифугированием (10 мин 4000g).
Активность пероксидаз определяли в реакционной смеси объемом 3 мл, содержащей 2 мл пробы, а также 100 мМ ацетатного буфера с рН 5, 20 мМ гваякола, 4 мМ пероксида водорода. Реакцию проводили при комнатной температуре. Пероксидазную активность оценивали по скорости образования продукта реакции тетрагваякола (є470нм= 0,0266 MKIVT CM-1; величина поглощения тетрагваякола при ее концентрации 0,1 мкМ/см) на линейном участке реакционной кривой (2-ая мин реакции) и относили к 1 г сырой массы, измеряя каждые 0,5 мин интенсивность окраски на спектрофотометре СФ-46, ЛОМО.
Рост и развитие пробирочных растений ежевики, малины и земляники в условиях длительного хранения in vitro
На следующем этапе работы анализировали развитие и выживаемость полученных микрорастений в процессе их длительного хранения при +4±1С (табл. 1-5 приложения; рис. 5-8).
Изучение выживаемости различных сортов ежевики, малины и земляники при +4С показало, что к 4 месяцу хранения все микрорастения всех изученных сортов земляники и ежевики остаются жизнеспособными (рис. 5). Выживаемость сортов малины в среднем снизилась до 88% за счет снижения жизнеспособности 2-х сортов (Ранняя Сладкая и Красноплодный Сеянец - 68% и 73%, соответственно; у остальных 3-х сортов малины выживаемость растений оставалась 100%) (табл. 1 приложения).
После года хранения in vitro выживаемость разных сортов в среднем равнялась 96% у земляники, 98% у ежевики и 83% у малины. Таким образом, в течение года беспересадочного хранения при пониженной температуре большая часть микрорастений у различных сортов ягодных культур остается жизнеспособной (рис. 5).
Через 20 месяцев хранения в этих условиях у всех изученных сортов земляники можно было отобрать жизнеспособные растения; количество выживших растений в среднем составило 52% (рис. 5). За этот период хранения погибли все микрорастения двух сортов малины (Красноплодный Сеянец и Rubin Bulgarski) и одного сорта ежевики (Whitford Thornless), выживаемость оставшихся сортов значительно снизилась и составила в среднем - 10% для малины и 33% для ежевики (табл. 2).
У изученных сортов земляники и малины наблюдалась положительная связь между выживаемостью в условиях хранения in vitro при +4С выживаемости на 20-ом месяце хранения при +4С и способностью к микроразмножению (г=0,73 и г=0,68). Так, микрорастения сорта земляники Polka характеризовались наиболее высокими показателями выживаемости и в то же время наибольшими значениями КМР; растения сорта Red Gauntlet имели наименьшую выживаемость и наиболее низкие значения КМР.
Также и среди сортов малины микрорастения сорта Mandarin отличались наибольшими показателями выживаемости и КМР, а микрорастения сорта Красноплодный Сеянец имели наименьшие значения этих показателей (табл. 1 приложения и табл. II).
На рисунке 6 представлены микрорастения ежевики (а) и малины (б), хранящиеся при +4С. В ходе работы анализировали рост (изменение высоты растения, количества зеленых, пожелтевших листьев и корней) и выживаемость пробирочных растений. Оценка динамики роста микрорастений при пониженной температуре +4С показала, что наибольшей интенсивностью роста в этих условиях характеризовались микрорастения земляники (рис. 7).
Можно полагать, что высокая способность сортов к формированию дополнительных побегов повышает вероятность выживания микрорастений в условиях длительного хранения in vitro.
У исследуемых сортов малины и земляники наблюдалась положительная связь между интенсивностью роста и способностью к выживанию при +4С (г=0,75). Среди сортов малины наиболее высокая способность к выживанию на 12-м месяце хранения и интенсивный рост наблюдались у сорта Mandarin (табл. 1 и 2 приложения). Сорта ежевики по способности к выживанию на 12-м месяце хранения при +4С достоверно не отличались между собой.
На рисунке 8 представлена динамика формирования листьев микрорастениями в течение 12 месяцев хранения при пониженной температуре; учитывалось среднее количество зеленых и пожелтевших листьев, а также общее количество листьев на растение. В течение длительного хранения микрорастений происходят два процесса: формирование новых листьев и пожелтение сформированных листьев за счет разрушения фотосинтетического аппарата (в первую очередь пигментов), что, вероятно, связано с включением программы старения и гибели микрорастений. Общее количество листьев (в среднем на микрорастение) увеличивается более чем в 2 раза в течение года хранения. При этом динамика формирования зеленых листьев у всех 3-х культур существенно не отличалась. Однако интенсивность пожелтения листьев была наиболее низкой у сортов земляники, и вдвое выше - у изученных сортов малины и ежевики (рис. 8).
При этом количество листьев возрастало у растений всех исследуемых сортов, однако наиболее интенсивнее - у растений сортов Агавам (ежевики), Rubin Bulgarski (малины) и Polka (земляники) (табл. 3 приложения).
Количество зеленых листьев среди исследуемых сортов малины возрастало интенсивней всех у сорта Mandarin, среди исследуемых сортов земляники у сорта Polka (от 6 до 9) (табл.4 приложения). Однако количество пожелтевших листьев у растений этого сорта также сильно увеличивалось по сравнению с другими сортами (от 0 до 7) (табл. 5 приложения). У 2-х сортов малины (Ранняя Сладкая и Красноплодный Сеянец) количество зеленых листьев снижалось в течение 12 месяцев хранения, а пожелтение листьев происходило интенсивней по сравнению с другими сортами малины.
Помимо взаимосвязи между ростом и жизнеспособностью у растений малины наблюдалась также прямая связь между изменением количества зеленых листьев и способностью к выживанию в условиях длительного хранения in vitro в течение 12 месяцев (г=0,95). А также прямая связь была выявлена между количеством зеленых листьев и ростом микрорастений малины (г=0,75). Как указывалось выше, наивысшая скорость роста и жизнеспособность были характерны для сорта Mandarin, и у этого же сорта наблюдалось наиболее интенсивное формирование зеленых листьев. И, наоборот, у микрорастений сорта Красноплодный Сеянец с наименьшими жизнеспособностью и интенсивностью роста формирование зеленых листьев происходило медленней по сравнению с другими сортами малины.
Полученные нами результаты по различной выживаемости в условиях длительного in vitro хранения сортов малины, ежевики и земляники можно отчасти объяснить биологическими особенностями видов, а также спецификой сорта
В условиях in vitro при периодическом возобновлении питательной среды и культивировании при оптимальных для вида условиях (температура, фотопериод, освещенность) микрорастения не стареют, так как при инициации пазушных почек и развитии дополнительных побегов растения постоянно омолаживаются, и их рост происходит практически неограниченно.
