Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Активные формы кислорода 10
1.1.1. Общая характеристика и свойства 10
1.1.2. Локализация образования активного кислорода в клетке 21
1.2. Антиоксидантная система растительной клетки 27
1.2.1. Антиоксидантные ферменты 28
1.2.2. Низкомолекулярные антиоксиданты 34
1.2.2.1. Биогенные полиамины 38
2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Объект исследования 50
2.2. Условия выращивания Mesembryanthemum crystallimim L 50
2.3. Постановка опыта 54
2.4. Методика анализов 56
2.4.1. Определение титруемой кислотности клеточного сока 56
2.4.2. Определение активности пероксидазы 57
2.4.3. Определение активности супероксиддисмутазы 59
2.4.4. Определение содержания малонового диалвдегида 60
2.4.5. Определение изо ферментного спектра СОД 60
2.4.6. Определение содержания перекиси водорода 62
2.4.7. Определение содержания супероксидного анион-радикала...63
2.4.8. Оценка уровня экспрессии гена Cu/Zn СОД 63
2.4.9. Выделение ДНК 69
2.4.10. Математическая обработка результатов 70
3. Результаты и их обсуждение 71
3.1. Физиологическая характеристика опытных растений хрустальной травки 71
3.2. Возрастные и межорганные особенности функционирования антиоксидантных ферментов в растениях хрустальной травки 72
3.3. Действие засоления на активность антиоксидантных ферментов хрустальной травки двух возрастных групп 77
3.4. Влияние кадаверина на окислительный статус растений хрустальной травки двух возрастных групп 84
3.5. Влияние кадаверина на экспрессию гена супероксиддисмутазы 91
3.6. Возможная роль полиаминов как ловушек активных форм кислорода 99
Заключение 102
Выводы 103
Цитированная литература 104
- Локализация образования активного кислорода в клетке
- Низкомолекулярные антиоксиданты
- Возрастные и межорганные особенности функционирования антиоксидантных ферментов в растениях хрустальной травки
- Влияние кадаверина на окислительный статус растений хрустальной травки двух возрастных групп
Введение к работе
Исследование механизмов адаптации растений к повреждающему действию абиотических факторов занимает ключевое положение в современной науке о растениях.
Усиленное образование активных форм кислорода (АФК) является одной из ранних реакций растений на повреждающие воздействия. Эти соединения высокореакционноспособны и могут неконтролируемо реагировать с белками, липидами, нуклеиновыми кислотами, изменяя их структуру и функции (Владимиров, 1987; Пескин, 1997). Клетки растений постоянно поддерживают определенный баланс образования и разрушения АФК. В нормальных условиях существования их концентрация находится на низком, но отличном от нуля уровне (Скулачев, 1998). Этот конститутивный уровень активного кислорода необходим для лигнификации клеточных стенок, передачи стрессорного сигнала и формирования иммунного ответа, для процессов старения и программируемой гибели клеток. Ухудшение условий существования сдвигает этот баланс в сторону повышенного образования АФК и накопления перекисных повреждений. Это явление получило название окислительного стресса и сопровождает большинство биотических и абиотических стрессоров.
В растениях существует многоступенчатая система защиты от чрезмерного образования АФК. Первой линией защиты являются антиоксидантные (АО) ферменты - супероксидисмутаза (СОД), пероксидаза (ПО), каталаза. Однако в условиях окислительного стресса ферменты быстро инактивируются активным кислородом, и для индукции их синтеза de novo требуется определенное время. Поэтому в этих условиях на первый план выходят низкомолекулярные АО. К неферментативным антиоксидантам относят и полиамины (ПА, путресцин,
спермидин, спермин, кадаверин) (Bors et al., 1989; На et al., 1998). Благодаря поликатионнои природе они способны связываться с отрицательно заряженными группами макромолекул, и защищать структуру биополимеров в условиях окислительного стресса. Кроме того, ПА могут участвовать в "тушении" кислородных радикалов. Рядом исследователей показано, что повышенное содержание ПА коррелирует с повышенной активностью АО ферментов и степенью устойчивости растений к стрессу.
Несмотря на успехи в этой области, появляющиеся данные зачастую носят противоречивый характер, и конкретные механизмы взаимодействия полиаминов с АФК и АО ферментами до сих пор не ясны. В настоящее время практически нет работ, посвященных участию ПА в адаптации растений экстремальных мест обитания, в то время как именно их адаптивные реакции наиболее показательны. Поэтому в качестве объекта исследований нами был выбран факультативный галофит Mesembryanthemum crystallinum L. (хрустальная травка). Это растение позволяет исследовать формирование защитных систем в двух состояниях - в неадаптированном (молодые растения с С3 фотосинтезом, обладающие чертами гликофита) и адаптированном (взрослые растения с САМ типом метаболизма).
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы было выяснить характер формирования антиоксидантной защиты у растений хрустальной травки при действии NaCl, а также роль полиаминов в процессах окислительного стресса, индуцированного засолением.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать онтогенетические изменения антиоксидантной
активности листьев и корней хрустальной травки в норме и при
действии засоления.
Исследовать влияние диамина кадаверина (Кад) на окислительный статус растений хрустальной травки в Сз и САМ состоянии.
Исследовать влияние Кад и спермина (Спм) на активность СОД в системе in vitro.
Выяснить, влияют ли ПА на активность генов антиоксидантных ферментов, на примере гена Cu/Zn-СОД.
Определить, какова роль ПА в стресс-индуцированных окислительных процессах, идущих в апопласте.
Выяснить, способны ли свободные ПА к «тушению» АФК и защите ДНК от действия свободных радикалов.
Научная новизна. Впервые установлены онтогенетические и органспецифичные различия в АО активности растений хрустальной травки: в период функционирования САМ фотосинтеза листья и особенно корни характеризуются значительно более высокой активностью АО ферментов. Показано, что корни хрустальной травки отличаются от листьев изоферментным спектром СОД: в них впервые обнаружена дополнительная "корневая" Mn-СОД И.
Установлено, что при засолении изменения АО активности у Сз растений носили индуцибельный характер, тогда как САМ растения поддерживали окислительный гомеостаз благодаря конститутивно высокому АО потенциалу.
Впервые установлено двойственное действие экзогенного Кад на окислительные процессы, идущие в корнях растений хрустальной травки: антиоксидантное в низких концентрациях (<1 мМ) и прооксидантное в высоких (>1 мМ).
Впервые установлено, что Кад и перекись водорода индуцируют экспрессию гена Cu/Zn-СОД в корнях молодых растений хрустальной травки. В корнях САМ-растений индуцирующий эффект менее выражен.
Предложен возможный механизм регуляции образования су пер о кс ид но го анион-радикала в корнях хрустальной травки путем накопления Кад, перекиси водорода и защелачивания апопластного пространства.
В системе in vitro впервые показана способность ПА эффективно защищать хромосомную ДНК от окислительных повреждений гидроксильными радикалами.
Практическая значимость. Полученные данные об участии ПА в процессах окислительного стресса и АО защите имеют большое значение для понимания формирования адаптивных процессов у галофитов и могут быть использованы при создании трансгенных растений, обладающих повышенной устойчивостью к неблагоприятным воздействиям. Полученные данные и сделанные на их основе теоретические обобщения могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических факультетов.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на VII международном симпозиуме «Проблемы физиологии растений и генетики на рубеже третьего тысячелетия» (Киев, 2000), на всероссийском симпозиуме «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2003), на V съезде ОФР России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на XX всероссийской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2004), на 14 съезде Федерации европейских обществ физиологов растений (Краков, Польша, 2004), на VI международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2005), на Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано и
направлено в печать 10 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (192 наименования, в т.ч. 162 иностранных). Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 3 таблицы и 26 рисунков.
Локализация образования активного кислорода в клетке
Часть кислорода в этом случае может образовываться в виде активного синглетного кислорода. Донором электронов в реакции (13) кроме супер оксидного радикала могут выступать фенольные соединения клеточной стенки (например, кофейная, феруловая кислоты), и их добавление значительно усиливает эти процессы. Несмотря на кажущуюся опасность образующихся соединений - ОН, 02 — этот путь разложения озона оказывается более предпочтительным для растения, так как эти вещества гораздо быстрее разлагаются аскорбатом, по сравнению с самим озоном. Константа скорости реакции взаимодействия озона с аскорбатом — 2,1 10 М" с" , тогда как синглетный кислород и гидроксил-радикал реагируют с аскорбиновой кислотой с km=l,6 10 и km=7,2 10 , соответственно. Было установлено, что если бы преобладала реакция (12), то разрушалось бы 50-70% озона, а в случае преимущественного протекания реакций (13) и (14) разлагается около 90% озона даже в молодой клеточной стенке (Moldau, 1998).
Еще одной важной формой активированного кислорода является радикал оксида азота(І) - NO , интерес к нему особенно вырос в последнее время, так как за ним признан целый ряд регуляторных функций и его, наряду с перекисью водорода, относят к сигнальным молекулам. У растений известно два основных источника NO — восстановление из нитрата нитратредуктазой и синтез из L-аргинина с помощью NO-синтазы. Кроме того, возможно неферментативное образование N0 при взаимодействии нитрита и аскорбата или из диоксида азота на свету с участием каротиноидов (Neill et el., 2002). Будучи радикалом NO может взаимодействовать с супероксидом, образуя высоко активное соединение — пероксинитрит (ONOO"), которое может окислять нуклеиновые кислоты, липиды, тиоловые и FeS-группы белков, приводя к нарушению функций ферментов и клеточным повреждениям. NO может реагировать с глутатионом, образуя S-нитрозоглутатион, который является запасным депо окиси азота в клетке. К настоящему времени показано участие радикала окиси азота в росте листьев и корней, созревании семян, процессах старения и др. (Vranova et al., 2002). Сигнальные пути, с помощью которых NO может влиять на ход этих процессов, различны. Во-первых, это может быть прямое нитрозилирование белков, сопровождающееся изменением их функций. Показано, что таким образом NO- ингибирует активность аконитазы - FeS-белка, который регулирует содержание железа. Таким образом, N0 участвует в метаболизме железа. Таким же образом окись азота ингибирует активность каталазы и аскорбатпероксидазы. Во-вторых, NO может активировать МАПкиназый и гуанилатциклазный сигнальные пути, индуцируя экспрессию определенных генов. В частности, через гуанилатциклазный путь происходит индукция экспрессии генов глутатионтрансферазы, фенилаланинаммонийлиазы (фермента участвующего в синтезе защитных соединений), PR-1 -гена (pathogen-related gene), NO -индуцированный апоптоз, также опосредован циклической ГМФ. Также NO активирует ряд МАПкиназ, причем эти МАПкиназы помимо NO активируются также перекисью водорода, и, таким образом, представляют собой точку схождения Н202 и NO -сигнальных путей.
Большинство клеточных органелл потенциально могут быть источниками активного кислорода (рис. 2). В зависимости от условий, стадии развития и физиологического состояния окислительные процессы могут преобладать в тех или иных компартментах, однако, в настоящее время считается общепризнанным, что хлороппасты являются наиболее мощным источником АФК в растительной клетке. При избыточном освещении часть молекул антенного хлорофилла и хлорофилла реакционных центров переходит в триплетное состояние и может генерировать синглетный кислород (Красновский мл., 1994). Основной источник синглетного кислорода в ФСІ это хлорофилл Р7оо в ФСІІ - хлорофилл Peso- Кроме синглетного кислорода в хлоропластах также образуется супероксидный анион-радикал. Его образование происходит следующим образом: солнечная энергия поглощается хлорофиллом антенн и передается по ЭТЦ на конечный акцептор электронов — НАДФ+. Восстановленный НАДФН затем используется в темновых реакциях фиксации углерода. В случаях, когда фиксация углерода затруднена (засуха, солевой стресс, высокая или низкая температура) регенерация НАДФ+ циклом Кальвина уменьшается и возрастает общая восстановленное цепи переноса электронов. Часть электронов в этом случае уходит на молекулярный кислород с образованием супероксида (Vranova et al., 2002). Потенциально, в силу термодинамических свойств, все компоненты акцепторных ветвей ФСІ и II могут окисляться кислородом. Однако экспериментально было показано, что основными восстановителями кислорода в ФСІ являются FeS-белок ферредоксин и терминальная НАДФ+оксидоредуктаза, а в ФСП пластохинон. Кроме того, некоторое количество супероксида образуется при фотоокислении воды в ФСП. Наряду с ЭТЦ активированный кислород может образовываться и в строме хлоропластов с участием Рубиско. При активировании молекулы рибулозо-1,5-бисфосфата образуется супероксидный радикал, который затем используется для расщепления бисфосфата до фосфоглицериновой и фосфогликолевой кислот (Мерзляк, 1989). В неблагоприятных условиях, когда фиксация углерода затруднена, часть фосфогликолата отвлекается из цикла Кальвина и участвует в процессах фотодыхания, снимая, таким образом, избыточную восстановленность ЭТЦ.
Низкомолекулярные антиоксиданты
Восстановление окисленного глутатиона осуществляет фермент глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2.). Это флавиновый фермент, использующий в качестве кофактора НАДФН, образующийся в световых реакциях фотосинтеза (в хлоропластах) или в пентозофосфатном пути (в цитозоле). Хотя этот фермент высоко специфичен к глутатиону, однако с небольшой скоростью он может восстанавливать и некоторые другие соединения, содержащие дисульфидную связь.
Важными антиоксидантами являются также глутатионтрансферазы (ГТ, КФ 2.5.18), которые восстанавливают органические перекиси, присоединяя молекулу GSH. Это многофункциональный фермент и основная его роль — это защита клеток от ксенобиотиков и продуктов ПОЛ, посредством их восстановления, присоединения молекулы GSH. ГТ не реагируют непосредственно с перекисью водорода, однако они эффективно восстанавливают гидропер оксиды макромолекул -пол и ненасыщенных жирных кислот, фосфолипидов, мононуклеотидов и ДНК, участвуя в их репарации. Токсичные соединения, конъюгированные с глутатионом транспортируются в вакуоль с помощью АТФ-зависимой помпы. Таким образом, ГТ это антиоксиданты, функционирующие на стадии удаления метаболитов, образовавшихся при окислительном стрессе.
В хлоропластах особая роль в защите от продуктов перекисного окисления принадлежит ферментам алкшгидропероксидредуктазам, которые восстанавливают алкилгидроперекиси до спиртов.
В некоторых случаях АО ферменты могут выступать в качестве прооксидантов, служа источниками активного кислорода. Так, СОД способна взаимодействовать с перекисью водорода с образованием гидроксильного и супероксидного радикалов (Меньшикова, Зенков, 1993):
В определенных условиях ПО способна катализировать обратную реакцию образования супероксида из перекиси водорода. Кроме того, небольшая часть кислорода, образующегося при работе ЛО ферментов, может возникать в возбужденном синглетном состоянии.
Из всего вышесказанного следует, что в растениях функционирует мощная многоступенчатая система ферментативной АО защиты. Однако при окислительном стрессе ферменты быстро инактивируются свободными радикалами и для индукции их синтеза de novo требуется определенное время. Поэтому в этих условиях на первый план выходят низком ол екуляр ные антиоксид анты.
Низкомолекулярные антиоксиданты — это соединения самой различной природы и в настоящее время их известно уже несколько тысяч. Характерной особенностью низкомолекулярных АО является нелинейная зависимость между их концентрацией и степенью ингибирования радикальных процессов. При низких концентрациях они оказывают типичное АО действие, снижая концентрацию АФК. Однако значительное увеличение содержания веществ с АО свойствами в определенных условиях может привести к активации побочных реакций с образованием активного кислорода (прооксидантный эффект). Необходимо отметить, что для любого антиоксиданта можно подобрать такие условия или концентрацию, при которых он будет являться прооксидантом. В целом все низкомолекулярные АО можно разделить на водо- и жирорастворимые. Из водорастворимых наиболее хорошо изученными являются глутатион и аскорбиновая кислота. Антиоксидантные свойства аскорбата основаны на функционировании одноэлектронных циклических переходов между дегидро- и семидегидроаскорбатными формами. Защитное действие глутатиона связано с окислением его SH- группы, приводящим к димеризации в дисульфид. Антиоксидантный эффект аскорбиновой кислоты и глутатиона реализуется в основном посредством их участия в работе ферментативных антиоксидантов. Кроме того, они способны и непосредственно улавливать АФК - 02", HOf, R02", НО, 02. Важной функцией этих соединений является их роль в восстановлении других низкомолекулярных АО. Так, клеточный GSH участвует в поддержании пула восстановленного аскорбата, аскорбиновая кислота восстанавливает мембранно-связанный токоферол. Эти соединения обнаружены практически во всех компартментах клетки, но в особенно больших концентрациях обнаруживаются в хлоропластах и в апопласте. Недавно на плазмалемме была обнаружена транспортная система, переносящая преимущественно окисленную форму глутатиона в клетку в протонном симпорте. Транспорт через плазмалемму известен и для аскорбата. Предполагают, что эти вещества играют важную роль в поддержании редокс статуса плазмалеммы и ассоциированных с клеточной стенкой белков. А также участвуют в биогенезе клеточной стенки, стимулируя ее рост и растяжение. К АО липидной фазы относят фенольные токоферолы, убихиноны, витамины Д и К, каротиноиды.
Фенольные соединения имеют в своей структуре ароматическое кольцо, связанное с гидроксильными группами, причем электронная плотность в этих группах смещена на кислород, поэтому протон может достаточно легко отрываться с образованием феноксильных радикалов. Эти соединения являются перехватчиками перекисных и алкоксильных радикалов, супероксида, синглетного кислорода, гидроксильного радикала, перекиси водорода (Дмитриев, Верховский, 1990; Shen et al., 1997; Yamasaki et al., 1997). Одни из важнейших АО липидной фазы — каротиноиды. Их главная роль заключается в улавливании синглетного кислорода, но они могут обезвреживать и пероксирадикалы (Кения с сотр., 1993; Капитанов, Пименов, 1997).
Скорость окисления зависит от структурной организации субстрата. Например, чем плотнее упаковка фосфолипидов мембран, тем меньше скорость окисления. Липидные АО (токоферолы, витамин К, убихиноны, каротиноиды) стабилизируют структуру мембран: встраиваясь боковыми цепями между ненасыщенными жирными кислотами мембран, они образуют комплексы с двойными связями.
В настоящее время происходит активный поиск новых АО -природных и синтетических. Обнаружены антиоксидантные свойства низкомолекулярных стероидов - витамина ДЗ и экдистерона (Кузьменко с сотр., 1997), моносахаридов (Аверьянов с сотр., 2000), дипептидов -карнозина, карцинина, L- глутаминилгистамина и др, пролина и бетаина (Hamilton, Heckathorn, 2001). Они способны непосредственно взаимодействовать с активными радикалами, восстанавливать гидроперекиси, изменять структуру субстрата, делая его менее чувствительным к атаке АФК.
Возрастные и межорганные особенности функционирования антиоксидантных ферментов в растениях хрустальной травки
Для более полной экстракции нуклеиновых кислот полученную смесь тщательно перемешивали и помещали на водяную баню t = 42 С на 20 мин, периодически встряхивая. Затем переносили в стерильную стеклянную пробирку и центрифугировали при t 4С 20 мин при 4000 об/мин на центрифуге К-23 (MLW, ГДР).
Для завершения депротеинизации надосадочную жидкость отбирали в стерильную стеклянную пробирку, содержащую 7,5 мл насыщенного фенола и 7,5 мл хлороформа и центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин. Верхнюю фракцию переносили в стерильную пробирку, содержащую 15 мл хлороформа и центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин. Центрифугирование с хлороформом проводили дважды для удаления остатков фенола.
Для осаждения нуклеиновых кислот верхнюю фракцию отбирали в стерильную стеклянную пробирку и добавляли 1/10 объема ЗМ ацетата натрия (рН 5,0) и 2,5 объема 96% этилового спирта. Полученную смесь хорошо перемешивали и помещали на -20С примерно на 12 часов. Все переносы делали на водяной бане, избегая нагревания растворов.
Для полного осаждения нуклеиновых кислот полученную смесь центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в 4 мл холодного 70% этилового спирта. Повторяли центрифугирование и снова ресуспендировали осадок в 4 мл холодного 70% этилового спирта и еще раз центрифугировали.
Надосадочную жидкость удаляли, осадок высушивали на воздухе и растворяли в 4 мл холодной ( 5С) бидистиллированной воды, предварительно обработанной ингибитором РНКаз и автоклавированной, к раствору добавляли 1,8 мл 9,6 М хлористого лития для осаждения РНК. Смесь выдерживали на ледяной бане (4 С) в течение 12 часов. Смесь центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин. Осторожно сливали водную фазу, осадок РНК осторожно ресуспендировали в 4 мл холодного 70% этилового спирта и центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин. Промывание спиртом повторяли трижды для удаления остатков хлористого лития.
Полученный осадок высушивали в ламинаре, растворяли на ледяной бане (4С) в 300 мкл бидистиллированной воды, свободной от РНКаз и хранили на - 70С. Концентрацию и чистоту полученной РНК измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 260 (максимум поглощения нуклеиновых кислот) и 280 (максимум поглощения белков) нм
Для удаления следов ДНК 60 мкг РНК обрабатывали ДНКазой, свободной от РНКаз, в присутствии ингибитора РНКаз. Для этого рассчитывали объем пробы, содержащий 60 мкг РНК. В эппендорф вносили би дистиллированную воду, свободную от РНКаз, из расчета Уц2о + VPHK = 79 мкл, 10 мкл 10Х буфера для ДНКазы, 1,5 мкл ингибитора РНКаз (Fermentas), смесь перемешивали и вносили рассчитанный объем РНК и 10 мкл ДНКазы I. Все операции проводили на ледяной бане. Полученную смесь 0,5 часа выдерживали при 37 С. Затем проводили депротеинизацию для освобождения от ДНКазы (2-х кратная обработка фенолом с хлороформом — 1:1, 2-х кратная обработка хлороформом). Надосадочную жидкость отбирали в стерильный эппендорф и добавляли 1/10 объема З М ацетата натрия (рН 5,0) и 2,5 объема 96% этилового спирта. Смесь хорошо перемешивали и ставили на 1 час на -70С. Далее смесь центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин, сливали надосадочную жидкость и трижды промывали осадок 500 мкл 80% этилового спирта. Спирт выливали, а полученный осадок высушивали на воздухе. Затем на холоду осадок растворяли в 30 мкл бидистиллированной воды, свободной от РНКаз и хранили на -70 С. 5 мкл раствора использовали для определения концентрации РНК на СФ-46. Затем 5 мкг РНК использовали для проведения электрофореза в агарозном геле, результаты которого позволяли оценить степень разрушенности РНК,
Обратная транскрипция позволяет из множества внутриклеточной РНК выделить именно матричную, т.е. ту часть генома, которая экспрессируется в данный момент времени. Это становится возможным благодаря полиА концевым последовательностям, которые характерны только для матричной РНК. Мы вносили в реакционную среду комплиментарные полиТ последовательности, которые связывались с мРНК и, соответственно, синтез кДНК начинался только на матричных РНК.
Обратную транскрипцию проводили в соответствии с инструкциями фирмы Fermentas. Пробу, содержащую 5 мкг тотальной РНК, доводили бидистиллятом, свободным от РНКаз, до 12 мкл и добавляли 1 мкл oligo(dT)21VN в качестве затравки синтеза на матричной РНК, поскольку она содержит комплиментарные полиА концевые последовательности. Смесь перемешивали и помещали на баню t = 70С на 10 мин, затем 3 мин охлаждали на водяной бане, центрифугировали 30" для осаждения конденсата, добавляли 2 мкл dNTP и 2 мкл буфера для обратной транскриптазы, перемешивали и ставили на 42С на 2 мин. Добавляли 1 мкл обратной транскриптазы (M-MuLV Revert Transcriptase), перемешивали и держали на бане 42С еще 50 мин и 15 при t 70 С. Затем охлаждали на ледяной бане 10 мин и собирали конденсат центрифугированием. Полученную кДНК хранили при t -20 С.
Влияние кадаверина на окислительный статус растений хрустальной травки двух возрастных групп
Для этой цели был проведен in vitro эксперимент по испытанию прямого действия ПА на активность изоферментов СОД. После проведения нативного электрофореза фракции растворимых белков, обладающих СОД активностью, неокрашенные пластины геля на 0,5 часа погружали в 1 мМ раствор Кад или Спм. После окрашивания не наблюдалось разницы в активности изоферментов СОД между контрольным и опытными вариантами. Это свидетельствовало о том, что ПА не влияли непосредственно на фермент (рис. 20).
Таким образом, предположение о перекись-опосредованном действии ПА частично подтвердилось. Для более полной уверенности необходимо было разделить действие самого Кад и продукта его окисления - перекиси водорода. селективный ингибитор диамин оксидазы, в случае его применения не происходит окисления Кад и образования перекиси водорода. Из рисунка 21 следует, что в корнях обработанных Кад или перекисью водорода активность всех изоформ СОД возрастала. В случае совместной обработки Кад с АГ (образования перекиси в данном случае не происходило), активность Мп- и Fe- СОД снижалась, а активность Cu/Zn- СОД не была обнаружена. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что действие Кад на активность изоферментов СОД в опыте in vivo могло быть опосредовано перекисью водорода в результате окислительной деградации диамина.
Из многочисленных литературных данных известно, что активность многих белков может регулироваться окислением - восстановлением, метилированием или какими-либо другими посттрансляционными модификациями (Danon, 2002). Рядом исследователей показана способность перекиси активировать работу генов множества защитных белков - аскорбатпероксидазы, катал азы, глутатион S-трансферазы; сигнальных белков - МАПкиназ и протеин ф о сфатаз; белков, регулирующих окислительный статус клетки, - НАДФН оксидазы (Levin et al., 1994; Neill et al, 2002; Pellinen et al., 2002). Кроме того, показано, что перекись водорода может непосредственно окислять определенные участки белковых молекул, изменяя их функции. Такое действие перекиси водорода показано для гистидинкиназы, входящей в состав двукомпонентной системы передачи стрессорного сигнала (Desikan et al., 2005) и для так называемого OxyR белка, широко обсуждаемого в литературе последних лет. Это белок - транскрипционный фактор, регулирующий работу генов стрессорного ответа - каталазы, алкилгидропероксидредуктазы, глутатионредуктазы, глутаредоксина и регуляторной РНК (т.н. oxyS-фактор) (Aslund et al., 1999). OxyR фактор связывается с промоторами генов как в окисленном, так и в восстановленном состоянии, но только будучи окисленным перекисью водорода он способен активировать работу генов (Storz et al., 1990).
Судя по полученным нами результатам, можно предположить, что перекись водорода, образующаяся при окислении ПА, может выполнять сигнальную роль, активируя гены, кодирующие синтез изоферментов Необходимо отметить, что любое стрессорное воздействие кроме быстрых первичных реакций, таких как формирование потенциалов действия на мембранах, изменение рН, быстрое образование большого количества активных форм кислорода, известное как окислительный взрыв, включает и более длительные специализированные процессы, направленные на устранение последствий повреждения. Одним из наиболее важных таких процессов является синтез новых белков, необходимых для устранения повреждений и успешного функционирования организма в изменившихся условиях. Известно, что ПА могут проявлять классический «гормональный» эффект, регулируя экспрессию некоторых генов, в том числе генов стрессорного ответа (Bouchereau et al., 1999; Hiraga et al., 2000; Ракова, Романов, 2005).
Приняв во внимание эти факты, мы провели исследование возможности регуляции ПА и перекисью водорода транскрипционного уровня синтеза ферментов. Влияние ПА и перекиси водорода изучали на примере гена цитоплазматической Cu/Zn- СОД. Эта изоформа была выбрана в связи с тем, что она оказалась наиболее чувствительной к обработке Кад. Исследование уровня экспрессии гена Cu/Zn- СОД проводили методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Для опытов использовали растения 2-х возрастных групп.
Экзогенный Кад (1 мМ) вносили в корневую среду. Известно, что кадаверин окисляясь, может образовать большое количество перекиси водорода, которая сама по себе является сигнальной молекулой и может активировать работу генов (см. главу 1.1.). Поэтому необходимо было разделить действие Кад и перекиси водорода. Для этого в отдельных вариантах в корневую среду вносили 1 мМ перекись или Кад совместно с ингибитором его окисления - АГ (50 мкМ). Экспозиция корней с экзогенными добавками составляла 2 часа. Согласно исследованиям М.В. Шориной (2004) концентрация Кад в корне после 2-х часовой обработки диамином составляла 200 нмоль, что было сопоставимо с уровнем его аккумуляции при солевом стрессе.
