Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Роль адипокинов в норме и патологии .11
1.2. Роль цитокинов в норме и патологии 35
1.3. Роль трефоиловых пептидов в развитии хронических воспалительных заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта41
Глава II. Материалы и методы исследования 51
2.1. Формирование выборки детей для проведения исследования 51
2.2. Методы исследования цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-1Ра, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО- и ТФР 1) в сыворотке крови и слюне у детей с хроническими гастродуоденитами56
2.3. Методы исследования адипокинов (лептина, грелина, адипонектина) в
сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами 57
2.4. Методы исследования трефоиловых пептидов (TFF-1 и TFF-2) в
сыворотке крови и слюне у детей с хроническими гастродуоденитами .59
2.5. Методы статистической обработки полученных результатов 61
Глава III. Клиническая характеристика и цитокиновый профиль крови и слюны детей с хроническими гастродуоденитами61
3.1. Содержание цитокинов в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами 61
3.2. Содержание цитокинов в слюне у детей с хроническими гастродуоденитами65
3.3. Содержание цитокинов в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами 69
3.4. Содержание цитокинов в слюне у детей с хроническими гастродуоденитами 73
Глава IV. Уровень лептина, грелина и адипонектина у детей с хроническими гастродуоденитами80
4.1 Содержание адипокинов в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами 80
4.2. Содержание адипокинов в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами в сочетании83
4.3. Содержание адипокинов в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами в зависимости от типа пищевого поведения 90
4.4. Содержание адипокинов в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами в зависимости от пола и типа пищевого поведения 92
4.5. Содержание адипокинов в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами в зависимости от типа пищевого поведения и морфологического варианта гастродуоденита 95
Глава V. Уровень трефоиловых пептидов у детей с хроническими гастродуоденитами97
5.1. Содержание трефоиловых пептидов (TFF-1 и TFF-2) в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами .97
5.2. Содержание трефоиловых пептидов (TFF-1 и TFF-2) в слюне у детей с хроническими гастродуоденитами .102
5.3. Содержание трефоиловых пептидов (TFF-1 и TFF-2) в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами в зависимости от пола 105
5.4. Содержание трефоиловых пептидов (TFF-1 и TFF-2) в слюне у детей с хроническими гастродуоденитами в зависимости от пола 109
Глава VI. Диагностические критерии хронических гастродуоденитов у детей109
6.1. Диагностическая значимость показателей про- и противовоспалительных цитокинов крови и слюны у детей с хроническими гастродуоденитами 112
6.2. Диагностическая значимость адипокинов в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами 123
6.3. Диагностическая значимость трефоиловых пептидов в сыворотке крови и слюне у детей с хроническими гастродуоденитами 133
Заключение 139
Выводы 144
Практические рекомендации 146
Список литературы 147
- Роль трефоиловых пептидов в развитии хронических воспалительных заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта
- Методы исследования цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-1Ра, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО- и ТФР 1) в сыворотке крови и слюне у детей с хроническими гастродуоденитами
- Содержание цитокинов в слюне у детей с хроническими гастродуоденитами
- Содержание адипокинов в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами в сочетании
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема сохранения и укрепления здоровья в детском возрасте имеет большое медико-социальное значение и с позиции нерешенных задач представляется весьма актуальной.
В структуре заболеваний органов пищеварения устойчиво доминируют
хронические воспалительные заболевания верхних отделов пищеварительного
тракта (ВОПТ), характеризующиеся преимущественным сочетанным
поражением пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки (ДПК) [Баранов
А.А., Щербаков П.Л., 2008; Бельмер С.В., Гасилина Т.В., 2011]. Хронические
заболевания органов пищеварения являются наиболее распространенными в
детском возрасте и по частоте встречаемости достигают своего пика в
подростковом возрасте, характеризующимся наиболее интенсивным ростом и
развитием всех органов и систем [Запруднов А.М., Григорьев К.И., 2011].
Хронический гастродуоденит можно отнести к так называемым
кислотозависимым состояниям, развивающимся при дисбалансе защитных и агрессивных факторов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки [Шкенева Л.Н., 2008].
Расстройства приёма пищи (F50) отнесены в МКБ-10 к поведенческим синдромам, связанным с физиологическими нарушениями и физическими факторами. Расстройства пищевого поведения клинически проявляются в развитии избыточной массы тела и ожирения, распространенность которых среди трудоспособного населения Российской Федерации составляет 30 % и 25 % соответственно [Мельниченко Г. А., 2004].
Ряд исследователей отводят достаточно весомую роль в формировании
метаболических нарушений в организме человека гормонам жировой ткани -
адипокинам, в частности лептину, грелину, адипонектину и др. Нарушение
пищевого поведения и дисбаланс гормонной регуляции пищеварения,
способствуют развитию моторных и секреторных нарушений в органах
пищеварительного тракта и, как следствие, приводят к развитию воспалительных
заболеваний гастродуоденальной зоны [Звенигородская Л.А., 2010]. С другой
стороны, нарушение пищевого поведения пациентов приводит к формированию
ожирения, а жировая ткань, как известно, является источником
провоспалительных факторов, которые в свою очередь могут усугублять течение хронического воспалительного процесса в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта [Karyan G.L., 2004; Ануфриева А.В., 2011].
Кроме того, следует отметить, что ведущая роль в системе защитного слизистого барьера желудочно-кишечного тракта принадлежит поверхностному эпителию [Paul M. et al., 2012]. Анализ литературы демонстрирует тот факт, что в
состав гелеобразного вещества, покрывающего поверхность эпителия, наряду с
муцинами (MUC) входят и трефоиловые пептиды (TFF), повышающие барьерные
свойства слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта [Julia M. еt al., 2009]
Комбинация эффектов трефоиловых факторов и муцина усиливает защиту
слизистой оболочки против ульцерогенных агентов и препятствует
проникновению протонов через слизь, повышая ее вязкость [Thim, L. et al., 2002].
Вместе с тем, остаются нерешенными вопросы особенностей содержания этих факторов у детей с различными вариантами гастродуоденитов и остается неясной диагностическая значимость этих показателей и перспектива их исследования в педиатрии.
Таким образом, цель исследования – установить взаимосвязь между содержанием адипокинов, трефоиловых пептидов и цитокиновым профилем в крови и слюне с характером поражения слизистой оболочки верхних отделов желудочно-кишечного тракта у детей с хроническими гастродуоденитами.
В соответствии с целью были определены задачи исследования:
-
Определить содержание про- и противовоспалительных цитокинов крови и слюны у детей с хроническими гастродуоденитами.
-
Исследовать содержание адипокинов (лептина, грелина и адипонектина) в сыворотке крови пациентов с различными морфологическими вариантами хронических гастродуоденитов.
-
Оценить влияние гендерного фактора на изменение адипокинового профиля у детей с различными морфологическими вариантами хронических гастродуоденитов.
-
Определить особенности адипокинового профиля у детей с хроническими гастродуоденитами при различных типах пищевого поведения.
-
Исследовать уровень трефоиловых факторов (TFF-1 и TFF-2) в сыворотке крови и слюне у детей с различными морфологическими вариантами хронических гастродуоденитов.
-
Оценить диагностическую значимость определения содержания цитокинов, адипокинов и трефоиловых пептидов у детей с хроническими гастродуоденитами.
Научная новизна исследования
Выявлены особенности цитокинового профиля в регуляции про- и противовоспалительных реакций у детей с хроническими гастродуоденитами с формированием провоспалительной направленности.
Полученные в ходе исследования данные расширяют представления о роли жировой ткани у детей с хроническими гастродуоденитами.
Впервые показана взаимосвязь продукции адипокинов: лептина, грелина и адипонектина с морфологическим вариантом заболевания и формированием
ограничительного типа пищевого поведения у детей с хроническими гастродуоденитами.
Впервые определен механизм формирования ограничительного типа пищевого поведения у детей с хроническими гастродуоденитами.
Впервые определен характер адипокинового профиля у детей с хроническими гастродуоденитами в зависимости от гендерного фактора.
Впервые определены особенности изменения содержания трефоиловых пептидов (TFF-1 и TFF-2) в сыворотке крови и слюне у детей с хроническими гастродуоденитами в зависимости от характера поражения слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.
Практическая значимость
Определен диапазон содержания про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови и слюне у детей с хроническими гастродуоденитами.
Определен диапазон содержания адипокинов у детей с хроническими гастродуоденитами.
Определен механизм формирования ограничительного типа пищевого поведения у детей с хроническими гастродуоденитами.
Определен диапазон содержания трефоиловых пептидов (TFF-1 и TFF-2) в сыворотке крови и слюне у детей с хроническими гастродуоденитами.
Определена диагностическая значимость уровня трефоиловых пептидов в сыворотке крови и слюне у детей с хроническими гастродуоденитами в зависимости от характера поражения слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.
На основании проведенных исследований, установлены диагностические
критерии, позволяющие усовершенствовать диагностику эрозивных
гастродуоденитов у детей.
Личный вклад автора в получение результатов. Автором самостоятельно проанализирована медицинская документация, проведено обследование пациентов, на основе которого сформирована база данных первичного материала. Проведены биохимические исследования, статистическая обработка полученных данных и внедрение результатов в практическую медицину.
Положения, выносимые на защиту
-
Хронические гастродуодениты у детей сопровождаются изменением цитокинового профиля крови и слюны, степень выраженности которых зависит от морфологического варианта заболевания.
-
Уровень адипокинов у детей с хроническими гастродуоденитами зависит от гендерного фактора, морфологического варианта заболевания и типа пищевого поведения.
3. Содержание трефоиловых пептидов является диагностическим критерием оценки различных морфологических вариантов хронических гастродуоденитов у детей.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы представлены на Первой
Международной научно-практической конференции «Высокие технологии,
фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине»
(Санкт-Петербург, 2010), XVIII Российской Гастроэнтерологической Неделе
(Москва, 2012), XVI Форуме Общероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2012).
Внедрение результатов
Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры общей и клинической биохимии №2 с курсом общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО «РостГМУ» Минздрава России, а также в практику консультативно-диагностической лаборатории «НАУКА» и в практику МБУЗ «ГБ №1 им. Н.А. Семашко города Ростова-на-Дону».
Публикации результатов исследования
По теме диссертационного исследования опубликовано 10 печатных работ,
в том числе 7 статей в периодических журналах из перечня ведущих
рецензируемых журналов, рекомендованных Высшей аттестационной
комиссией Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 175 страницах и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, заключение, выводы, список литературы, включающий 13 отечественный и 214 зарубежный источник. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 40 рисунками.
Роль трефоиловых пептидов в развитии хронических воспалительных заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта
Поверхность слизистой оболочки желудка составляет 526-825 см2, толщина – 0,25-1,0 мм, объем 16-45 см3, она содержит 4-25 млн. желез [Tetsuya T. et al., 2012]. Слизистая оболочка кишечника, выстилающая желудочно-кишечный тракт, представляет собой одну из крупнейших площадей, которые подвергаются постоянному воздействию со стороны факторов внешней среды. Микроскопически, в слизистой оболочке желудка различают следующие зоны: кардиальную, фундальную и пилорическую (антральную) [Worthley D. L. et al., 2012]. Каждая зона занята характерными для нее железами. [Robert E. et al., 2012]. Вся слизистая оболочка желудка выстлана высоким столбчатым эпителием, имеющим сходный вид во всех отделах [Katherine S. et al., 2012 ]. Похожий эпителий выстилает желудочные ямки, в которых открываются устья ветвящихся трубчатых желез. В желудке около 3,5 млн. ямок и около 15 млн. желез. Высота поверхностного эпителия составляет около 30 мкм. Эта большая по своим размерам поверхность, выполняет двойную функциональность, с одной стороны она участвует в переваривании и всасывании питательных веществ поступающих с пищей, и с другой стороны является важной составляющей врожденного и адаптивного иммунитета [Salim S.Y. et al., 2011]. Следует отметить, что поверхностному эпителию принадлежит ведущая роль в системе защитного слизистого барьера желудка [Paul M. et al., 2012]. Cлизь, секретируемая поверхностным эпителием образует слой толщиной около 0,5 мм, обладающий свойствами геля. Способность поддерживать тонкий баланс между поглощением необходимых питательных веществ, при этом предотвращая попадание вредных, и формирует основу мукозального барьера. Ряд компонентов, составляющих мукозальный барьер слизистой оболочки кишечника, включает в себя толстый слой слизи, наружная поверхность которого представлена комменсальными бактериями, образующими защитную зону [William H. A. et al., 2011]. Среди эпителиальных клеток располагаются бокаловидные клетки, клетки Панета, М-клетки и др. Клеточные элементы, расположенные в собственной пластинке представлены клетками врожденного и адаптивного иммунитета, такими как Т и В-лимфоциты, эозинофилы, тучные клетки, дендритные клетки, макрофаги. В состав гелеобразного вещества (или слизи), покрывающего поверхность эпителиальных тканей у млекопитающих, входят муцины (MUC) и трефоиловые пептиды [Julia M. еt al., 2009]. Мукоциты, являясь мультифункциональными клетками, наряду с муцинами синтезируют и трефоиловые пептиды, обладающие способностью стимулировать миграцию клеток и реэпителизацию. Семейство трефоиловых факторов представляет собой группу пептидов, синтезирующихся и выделяющихся эпителием слизистых оболочек [Lin Xue et al., 2011]. Трефоиловые факторы имеют небольшую молекулярную массу [Katoh M. 2003]. Все три группы трефоиловых факторов обнаруживаются в составе гранул слизи, секретируемой слизеобразующими клетками и предположительно, связываясь с муцинами, обеспечивают основу для образования защитного геля на поверхности мукозального эпителия [Clyne M., et al., 2004]. У человека определены три разновидности трефоиловых факторов: TFF-1 (или PS2), TFF-2 (или спазмолитический полипептид SP) и TFF-3 (или кишечный полипептид ITF) [Dolores Ortiz-Masi et al., 2010]. Локализация TFF-1 главным образом определяется в поверхностных клетках слизистого слоя желудка, преимущественно антрального отдела, в то время как местонахождение TFF-2 определяется в основном в слизи, содержащейся в шейке желез, которая вырабатывается как клетками слизистой желудка, так и железами двенадцатиперстной кишки – клетками Бруннера.
Преимущественная локализация TFF-3 в тонком и толстом кишечнике, где он вырабатывается бокаловидными клетками [Lin Xue et al., 2010]. Установлено, что шеечные мукоциты являются одним из главных продуцентов простогландинов в желудке, поскольку в них была обнаружена самая высокая концентрация циклооксигеназы-1 среди всех клеток слизистой оболочки желудка. Функция шеечных мукоцитов очень важна, т.к. они обеспечивают клеточное обновление. Их высокий пролиферативный потенциал подтверждается экспрессией Ki-67, а их высокая способность к миграции – экспрессией на базальной мембране -2 и -3 цепей ламинина [Giuseppe G. et al., 2012]. Кроме того, интересен тот факт, что наряду с муцинами (MUC 5 AC) слизеобразующие клетки поверхностного эпителия экспрессируют TFF-1, тогда как шеечные мукоциты, локализация которых определяется в более глубоких слоях мукозального эпителия, наряду с муцинами (MUC 6) экспрессируют TFF-2 [Ota H. et al., 2011]. Мукозальный эпителий пищеварительного тракта является ключевым элементом в барьерной функции слизистой оболочки к широкому спектру повреждающих факторов, включая патогенные микроорганизмы, продукты секреции желудочно-кишечного тракта, различные агрессивные компоненты пищи и лекарства. Кроме того, барьерная функция слизистой оболочки может быть нарушена в результате различных заболеваний органов пищеварительного тракта, прежде всего, воспалительного генеза. Однако, целостность поверхностного эпителия способна быстро восстанавливаться даже после массивного повреждения, благодаря эпителиальной реституции, включающей индукцию клеточной пролиферации, дифференцировки и миграции. Процесс реституции эпителия модулируется различными факторами, среди которых обнаруживается широкий спектр регуляторных пептидов, определяемых как факторы роста или цитокины. Часть из них действует через TGF--зависимый механизм на базолатеральную поверхность эпителиального слоя. В отличие от этого, трефоиловые факторы (TFF-пептиды) стимулируют эпителиальную реституцию в комбинации с гликопротеинами – муцинами через TGF-1-независимый механизм, действуя на апикальную поверхность эпителиального слоя. Наряду с этим, ряд других пептидных молекул межклеточного матрикса и факторы свертывания крови, а также небелковые молекулы, в том числе – фосфолипиды, короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA), адениловые нуклеотиды, микроэлементы и фармакопрепараты могут модулировать репаративные процессы эпителия. Многократно повторяющееся повреждение слизистой оболочки является ключевым механизмом патогенеза большинства заболеваний органов желудочно-кишечного тракта, в том числе – воспалительных, что требует постоянного восстановления функциональной и анатомической целостности эпителия. Изучение особенностей протекания репаративных механизмов, стимулируемых регуляторными пептидами, могут обеспечить в будущем разработку принципиально новых подходов в диагностике и лечении большинства заболеваний пищеварительного тракта.
Влияние трефоиловых пептидов на миграцию и инвазию эпителиальных клеток Миграция эпителиальных клеток со здоровых тканей на раневую поверхность – процесс, необходимый для эпителиальной реституции. Реституция имеет решающее значение для восстановления целостности тканей и поддержания, таким образом нормального функционирования желудочно-кишечного тракта, так как постоянно происходит травмирование слизистой оболочки. В целях предотвращения развития воспаления по месту повреждения эпителия (в результате воздействия микроорганизмов и иммуннокомпетентных клеток собственной пластинки слизистой оболочки (lamina propria) кишечника) такие травмы требуют включения оперативных репарационных процессов [Podolsky D.K. et al., 1999]. Все три типа трефоиловых факторов усиливают миграцию эпителиальных клеток, тем самым активно участвуя в механизме реституции [Dignass A. et al., 1994; Playford R. J. et al., 1995; McKenzie C. et al., 1997; FitzGerald A. J. et al., 2004] Данный эффект TFF-пептидов основан на стимуляции образования комплексов E-кадгерин/-катенин в межклеточном веществе [Efstathiou J.A. et al., 1999]. Формирование межклеточных контактов в эпителиальном слое опосредуется E-кадгерином, взаимодействие которого с -катенином приводит к дестабилизации межклеточных связей и возможности миграции клеток [Liu D. et al., 1997]. Однако индукция миграции клеток под влиянием TFF3 опосредуется также через MAP-киназу (MAPK) независимо от активности эпителиального ростового фактора (EGF-R), тогда как антиапоптотические свойства TFF3 зависят именно от активации EGF-R [Kinoshita K. et al., 2000]. Следует заметить и тот факт, что стимулируемая TFF3-пептидом ассоциация Е-кадгерина с -катенином (который связывает Е-кадгерин с актином цитоскелета) приводит к инвазии рака толстого кишечника в через серозную оболочку в брюшную полость [Emami S. et al., 2001]. Кроме того, TFF3 усиливает экспрессию матрикс-металлопротеиназы-9, повышая инвазивность неопухолевых фибробластов [Chan V.Y. et al., 2005]. Таким образом, конститутивная активность гена TFF1 придает клеткам инвазивный фенотип, и гиперэкспрессия TFF1, например, в язва-ассоциированных клеточных линиях (UACL) или в ситуации опухолевой прогрессии может иметь патофизиологическое значение, способствуя аутокринной миграции и стимуляции инвазивных свойств эпителиальных клеток [Emami S. et al., 2001; Rodrigues S. et al., 2001]. Влияние трефоиловых пептидов на пролиферацию и апоптоз В первоначальных исследованиях указывалось, что TFF2 напрямую усиливает пролиферацию клеток толстого кишечника [Hoosein N. M. et al., 1989], что, однако, не подтвердилось в последующих экспериментальных работах [Dignass A. et al., 1994; Chinery R. et al., 1995; Otto W.R. et al., 1996; Marchbank T. et al., 2001; Goke M.N. et al., 2001]. Напротив, отмечено даже снижение пролиферации клеток желудочно-кишечного тракта под влиянием hTFF3 или TFF1 [Uchino H. et al., 2000, Bossenmeyer-Pourie C. et al., 2002]. Антиапоптотический эффект трефоиловых пептидов подтвержден некоторыми авторами [Kinoshita K., 2000; Bossenmeyer-Pourie C. et al., 2002; Lalani E.N. et al., 1999; Taupin D.R. et al., 2000], и у мышей с дефицитом TFF3 отмечено увеличение числа апоптотических клеток в криптах кишечника [Taupin D.R. et al., 2000]. Следует отметить, что антиапоптотическая устойчивость клетки является решающим фактором в отношении эпителиальной реституции – восстановления деятельности обратимо поврежденных структур, когда субстрат-зависимые клетки эпителия (anchorage-dependent epithelial cells) мигрируют в поврежденные области слизистой оболочки. В этих условиях, когда клетка не прикреплена к матриксу, она уязвима для апоптоза (аноикис) [Frisch S.M. et al., 2001]. Было установлено, что TFF3 оказывает выраженный антиапоптотический (аноикис-резистентный) эффект на энтероциты через активацию NFk [ChenY.H. et al., 2000] и эпидермальный фактор роста (EGF) [Dornonville De La Cour C., 2004].
Методы исследования цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-1Ра, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО- и ТФР 1) в сыворотке крови и слюне у детей с хроническими гастродуоденитами
Определение содержания ИЛ-1, РА-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО- и ТФР-і определяли в сыворотке крови и слюне методом иммуноферментного анализа (ИФА) (ELISA) наборами фирмы «Вектор Бест» (Россия).
Забор венозной крови осуществлялся утром натощак при помощи закрытой вакуумной системы «Vacutainer» для проведения исследований. После завершения процесса свертывания крови, пробирки с целью ускорения ретракции сгустка центрифугировали в течение 10 минут при скорости в 3000 G оборотов. После центрифугирования, отделившуюся сыворотку аккуратно отбирали дозаторами и разливали в эппендорфы. Отобранные образцы помещали в морозильную камеру на хранение при температуре -70С.
Сбор слюны для исследования осуществлялся в утренние часы натощак, после предварительного полоскания ротовой полости физиологическим раствором натрия хлорида 0,9%, путем сплевывания в стерильный пластиковый контейнер в течение 10-15 минут. Далее слюну центрифугировали при 3000 G в течение 10 минут. Надосадочную жидкость аккуратно отбирали и разливали в эппендорфы. Отобранные образцы помещали в морозильную камеру на хранение при температуре - 70с. Иммуноферментный анализ выполняли в слюне и сыворотке крови на автоматическом анализаторе «Alisei» (Италия). С целью подсчета концентраций принимали во внимание фактор разведения. Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» варианте с применением моно- и поликлональных антител к интерлейкинам человека. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизированными антителами. Имеющиеся в образцах интерлейкины связываются с иммобилизированными антителами. Не связавшийся материал удаляется при промывке. Связавшиеся интерлейкины взаимодействуют при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к интерлейкинам человека с биотином). Не связавшийся коньюгат удаляется при промывке. На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействует при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). После третьей отмывки количество связавшегося конъюгата №2 определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – (ТМБ). Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов, находящихся в лунках при длине волны 450 нм. Исследование содержания цитокинов проводили совместно с Шестопаловой М.А. аспирантом кафедры педиатрии с курсом неонатологии ФПК и ППС ГБОУ ВПО «РостГМУ» Минздрава России.
Концентрацию лептина в сыворотке определяли методом ИФА (ELISA) наборами фирмы «DBC» (Канада). В наборе использованы высокоспецифичные моноклональные антитела: моноклональные антитела специфичные к лептину иммобилизованы в лунках микропланшета и другие моноклональные антитела специфичные к другому эпитопу лептина конъюгированы с биотином. Во время первого этапа лептин, присутствующий в образцах и стандартах, связывается с иммобилизованными антителами и с биотинилированными антителами, образуя сэндвич-комплекс. Избыток и не связавшиеся биотинилированные антитела удаляют на этапе промывки. На втором этапе вносят конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена, который специфически связывается с биотинилированными антителами. Затем не связавшийся конъюгат удаляют при промывке. После этого вносят субстрат ТМБ, который в результате ферментативной реакции образует продукт голубого цвета, при этом окраска прямо пропорциональна количеству присутствующего лептина. Ферментативную реакцию останавливают добавлением стоп-реагента, в результате развивается желтое окрашивание. Абсорбция при 450 нм измеряется с помощью микропланшетного спектрофотометра «Alisei». Для построения калибровочной кривой использовали набор стандартов. Концентрацию грелина в сыворотке крови определяли методом «конкурентного» иммуноферментного анализа. Применялись наборы фирмы «PhoenixPharmaceuticals» (США). Принцип метода заключается в следующем: планшет предварительно сорбирован вторыми антителами и обработан реагентом, блокирующим неспецифические сайты связывания. Вторые антитела могут связываться с Fc-фрагментом первичных антител, чей Fab-фрагмент конкурирует за связывание как биотинилированного грелина, так и грелина образцов и стандартов. Биотинилированный грелин связывается с пероксидазой хрена, конъюгированной со стрептавидином, которая катализирует реакцию раствора, содержащего тетраметилбензидин (ТМБ) и перекись водорода, с развитием голубой окраски. Фермент-субстратная реакция останавливается добавлением соляной кислоты в качестве стоп-раствора. Раствор меняет цвет на желтый. Интенсивность развивающейся окраски пропорциональна количеству биотинилированного грелина, связавшегося с иммобилизованными в планшете антителами и обратно пропорциональна концентрации грелина в образце. Определение концентрации адипонектина в сыворотке крови измеряли методом ИФА (ELISA) при помощи наборов производителя «BioVendor» (Чехия). В основе самой методики положен принцип конкурентного анализа. Сначала происходит одновременное связывание молекул адипонектина образцов с иммобилизованными на лунках микропланшета моноклональными антителами к адипонектину. После промывки удаляются остатки несвязанного материала. Затем происходит связывание конъюгированного с пероксидазой хрена стрептавидина с иммобилизованными биотинилированными антителами. Осуществляется промывка для удаления свободного конъюгата и определяется количество связанного коньюгата посредством наблюдения за активностью пероксидазы в присутствии субстрата 3,3 ,5,5 -ТМБ. Активность фермента измеряется на спектрофотометре при повышенной абсорбции при 450 нм – 590 нм после ацидификации продуктов реакции. Увеличение абсорбции прямо пропорционально количеству связанного человеческого адипонектина в образце пациента, последнее может быть получено интерполяцией референс-кривой, полученной в ходе данной постановки анализа на результатах референс-стандартов известных концентраций адипонектина человека.
Содержание цитокинов в слюне у детей с хроническими гастродуоденитами
У 66 детей с ХГД в возрасте от 8 до 15 лет, из них 38 детей с ПГД и 28 детей с ЭГД проведено исследование уровня ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-1Ра в слюне. Группу контроля составили 25 здоровых детей, сопоставимых по возрасту общей клинической группе. В группе контроля провоспалительные цитокины в слюне обнаруживались в следующих концентрациях: содержание ФНО- составило 4,79±0,76 пг/мл, ИЛ-1 - 58,38±11,37 пг/мл, ИЛ-6 - 0,80±0,45 пг/мл и ИЛ-8 -473,56±37,46 пг/мл (табл. 3.3.). Содержание противовоспалительного ИЛ-1Ра составило 1290,80±197,24 пг/мл. В группе контроля выявлены прямые корреляционные связи между содержанием провоспалительных ИЛ-6 и ИЛ-1 (r=0,42), провоспалительного ИЛ-8 и противовоспалительного ИЛ1Ра (r=0,41) слюны, ИЛ-6 слюны и сыворотки крови (r=0,62).
В ОКГ детей среди уровней провоспалительных цитокинов статистически значимые различия имели только показатели ФНО- -10,17±1,73 пг/мл и ИЛ-1 - 134,65±11,67 пг/мл, достоверно превышая показатели в группе контроля (p 0,05). Концентрации остальных изучаемых провоспалительных цитокинов в общей клинической группе не отличались значимо от группы контроля и составили для ИЛ-6 - 3,38±1,01 пг/мл и ИЛ-8 -509,51±25,36 пг/мл (табл. 3.3.) Уровень противовоспалительного ИЛ-1Ра в слюне составил 2151,77±146,62 пг/мл, что достоверно превышало этот показатель в группе контроля (p 0,05) (табл. 3.4.).
Аналогичная картина наблюдалась в группе детей с ПГД, где содержание в слюне провоспалительных цитокинов составила: ФНО- 9,70±2,07 пг/мл и ИЛ-1 - 142,20±14,37 пг/мл, что достоверно превышало показатели в сравнении с контрольной группой (p 0,05), но вместе с тем более значимо возрастала концентрация ИЛ-8, которая составила 554,18±25,01 пг/мл, что достоверно превышало показатели в группе контроля. Достоверной разницы концентрации ИЛ-6 (2,04±0,80 пг/мл) в слюне в группе с ПГД в сравнении с контрольной группой выявлено не было (табл. 3.3.). Выявленная ранее закономерность сохранялась и относительно противовоспалительного ИЛ-1Ра, концентрация которого составила 2318,14±186,43 пг/мл (p 0,05), достоверно превышая показатели контрольной группы (табл. 3.4.) В группе детей с ЭГД наблюдалась несколько иная ситуация. Так, повышенная концентрация провоспалительных цитокинов ФНО- (10,91±3,12 пг/мл) (p 0,05) и ИЛ-1 (124,31±19,57 пг/мл) (p 0,05) в сравнении с группой контроля сохранялась. Содержание провоспалительного ИЛ-8 в слюне у детей с ЭГД составило 437,65±49,73 пг/мл, что не имело статистически значимых различий в сравнении с группой контроля, но вместе с тем, существенно снижалось в сравнении с ПГД, что носило статистически значимый характер (р 0,05).
В группе детей с ЭГД достоверно возрастала концентрация другого провоспалительного цитокина - ИЛ-6 (5,39±2,19 пг/мл) достоверно превышая показатели в группе контроля (р 0,05) (табл. 3.3.)- Уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-1Ра в группе детей с ЭГД составил 1895,27±232,27 пг/мл, что достоверно превышало этот показатель в группе контроля (р 0,05).
Таким образом, воспалительные заболевания верхних отделов желудочно-кишечного тракта у детей сопровождались повышением провоспалительных ФНО-, ИЛ-1 и противовоспалительного ИЛ-1Ра, что свидетельствует о дисбалансе в системе цитокинов, характерного для большинства воспалительных заболеваний (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008).
Вместе с тем, цитокиновый профиль детей с ЭГД существенно отличался от контроля и детей с ПГД. При ЭГД отмечалось статистически значимое локальное повышение ИЛ-6 (p 0,05) в слюне. В то же время ИЛ-8 в группе детей с ЭГД повышается значимо только относительно ПГД.
При анализе данных с учетом половой принадлежности детей, выявленная ранее закономерность сохранялась. В группе контроля мальчиков сохранялись прямые корреляционные связи между содержанием ИЛ-6 крови и провоспалительными интерлейкинами слюны: ИЛ-1 (r=0,59), ИЛ-6 (r=0,61), ИЛ-8 (r=0,59) и между ИЛ-8 и ИЛ-1 (r=0,51) слюны. В группе контроля девочек наблюдалась несколько иная ситуация, характеризующаяся наличием прямых корреляционных связей между содержанием провоспалительных ИЛ-8 и ФНО- (r=0,67) слюны, ИЛ-6 слюны и ТФР-1 (r=0,68) крови. Также установлены обратные корреляции между содержанием ФНО- слюны и интерлейкинами ИЛ-1 (r=-0,67), ТФР-1 (r=-0,71) крови, ИЛ-8 и ИЛ-6 слюны (r=-0,55), ИЛ-8 слюны и ТФР-1 (r=-0,69) крови, несвойственные контрольной группе мальчиков. В ОКГ мальчиков отмечалось снижение уровня ИЛ-8 в крови (1,06±0,24 пг/мл) (p 0,05) в сравнении с контрольной группой. Такая же закономерность сохранялась и в ОКГ девочек, где концентрация ИЛ-8 составила 1,56±0,52 пг/мл (p 0,05). При анализе содержания провоспалительного цитокина ИЛ-6 в сыворотке крови мальчиков и девочек ОКГ статистически значимых различий относительно контрольной группы выявлено не было (табл. 3.5.). В ОКГ мальчиков проведенный корреляционный анализ выявил прямые корреляционные связи между содержанием ИЛ-6 в крови с обеими противовоспалительными интерлейкинами слюны ИЛ-1Ра (r=0,46) и крови ТФР-1 (r=0,31), обратную корреляцию (r=-0,41) между ИЛ-8 крови и ФНО- слюны. В ОКГ девочек выявлена прямая корреляционная связь между ИЛ-8 слюны и сыворотки крови (r=0,51). В группе мальчиков и девочек с ПГД уровень провоспалительного цитокина ИЛ-8 составил 0,97±0,21 пг/мл и 1,71±0,76 пг/мл соответственно, что было достоверно ниже относительно группы контроля (p 0,05). Статистически значимых изменений уровня ИЛ-6 у девочек и мальчиков с ПГД выявлено не было (табл. 3.5.). В группе мальчиков с ПГД выявлена прямая корреляционная связь между содержанием провоспалительного ИЛ-6 в крови и слюне (r=0,99), провоспалительных ИЛ-8 слюны и ИЛ-1 слюны (r=0,46), противовоспалительного ИЛ-1Ра слюны и ИЛ-6 как в крови (r=0,52), так и в слюне (r=0,51). Также установлена обратная корреляция в группе мальчиков с ПГД между содержанием ИЛ-8 крови и ФНО- слюны (r=-0,59).
В группе девочек с ПГД выявлены прямые корреляционные связи между содержанием ТФР1 и ИЛ-6 как в крови (r=0,46), так и в слюне (r=0,47), между ИЛ-6 крови и слюны (r=0,91), обратная корреляционная связь между содержанием ИЛ-6 крови и ФНО- слюны (r=-0,52).
Содержание адипокинов в сыворотке крови у детей с хроническими гастродуоденитами в сочетании
При анализе полученных результатов с учетом фактора половой принадлежности, группа детей с ПГД была разделена на две подгруппы: мальчики (16 детей – 46%) и девочки (19 детей – 54%). Группа детей с ЭГД: мальчики (17 детей – 60%) и девочки (11 детей – 40%). Группу контроля составили 25 детей 1 и 2А групп диспансерного наблюдения, из них: мальчики (12 детей – 48%) и девочки (15 детей – 52%) (табл. 4.3., рис.4.2., 4.3., 4.4.)
В контрольной группе девочек отмечалось более высокое содержание уровня лептина (22,05±8,20 нг/мл) и грелина (30,08±5,59 пг/мл) в сравнении с группой мальчиков (p 0,05), уровень адипонектина составил 19,58±3,44 нг/мл, что не имело статистически значимых отличий (табл. 4.3., рис.4.2., 4.3., 4.4.) В контрольной группе девочек выявлена сильная прямая корреляционная связь между содержанием адипонектина в сыворотке крови и TFF-1 (r=0,88) в слюне (табл. 4.3.). В ОКГ мальчиков концентрация грелина составила 29,01±5,23 пг/мл, что достоверно превышало показатели контрольной группы (p 0,05). Уровень лептина в ОКГ группе мальчиков составил 7,58±2,02 нг/мл, адипонектина 19,25±1,62 нг/мл, что не имело статистически значимых отличий от группы контроля (табл. 4.3., рис.4.2., 4.3., 4.4.). В ОКГ группе мальчиков проведенный корреляционный анализ выявил прямую корреляционную связь между адипонектином и провоспалительным ФНО- (r=0,38) в крови, обратные корреляции между адипонектином и ИЛ-8 (r=-0,52) и трефоиловым фактором TFF-2 (r=-0,47).
Примечание: - статистически значимые различия в сравнении с контролем, р 0,05; - статистически значимые различия в сравнении с мальчиками р 0,05; -статистически значимые различия в сравнении с ПГД у девочек (р 0,05) В ОКГ группе девочек концентрация лептина составила 17,36±3,75 нг/мл, что достоверно превышало показатели в группе мальчиков (p 0,05). Достоверных различий в содержании грелина (27,45±5,07 пг/мл) и адипонектина (17,38±1,28 нг/мл) в сыворотке крови в ОКГ группе девочек в сравнении с контролем и ОКГ мальчиков выявлено не было (табл. 4.3., рис.4.2., 4.3., 4.4.).
В ОКГ группе девочек выявлены прямые корреляции между содержанием лептина и адипонектина (r=0,33), грелина и TFF-1 (r=0,35) крови, обратные корреляции между уровнем грелина и ИЛ-6 (r=-0,33) в крови и TFF-2 (r=-0,44) слюны, содержанием лептина и ИЛ-8 (r=-0,57) в крови и TFF-1 (r=-0,50) в слюне, обратная корреляция между адипонектином и ИЛ-6 (r=-0,35) в слюне.
В группе мальчиков с ПГД концентрация грелина составила 24,29±5,00 пг/мл, что достоверно превышало показатели контрольной группы мальчиков (p 0,05). Уровень лептина в группе мальчиков с ПГД составил 8,66±3,40 нг/мл, адипонектина 17,85±2,33 нг/мл, что не имело статистически значимых отличий от группы контроля мальчиков (табл. 4.3., рис.4.2., 4.3., 4.4.).
В группе мальчиков с ПГД корреляционный анализ выявил наличие прямых корреляций между содержанием лептина и грелина (r=0,46) в крови, ИЛ-6 как в крови (r=0,51), так и в слюне (r=0,50), между адипонектином и ФНО- (r=0,42), в слюне, сильную обратную корреляционную связь между адипонектином и ИЛ-8 (r=-0,71), в крови.
В группе девочек с ПГД выявленная ранее закономерность сохранялась, так концентрация лептина составила 21,30±5,59 нг/мл, что достоверно превышало показатели в группе мальчиков (p 0,05). Уровень грелина составил 23,11±6,28 пг/мл, адипонектина 15,36±1,40 нг/мл, что не имело статистически значимых отличий в сравнении с контролем и мальчиками с ПГД (табл. 4.3., рис.4.2., 4.3., 4.4.).
В группе мальчиков с ЭГД уровень грелина составил 35,09±10,11 пг/мл, что достоверно превышало показатели контрольной группы (p 0,05). Уровень лептина в группе мальчиков с ЭГД составил 6,30±1,91 нг/мл, адипонектина 20,87±2,23 нг/мл, что не имело статистически значимых изменений относительно контрольной группы (табл. 4.3., рис.4.2., 4.3., 4.4.). В группе мальчиков с ЭГД были выявлены обратные корреляции между уровнем грелина и ИЛ-8 в крови (r=-0,52), лептином и TFF-2 в слюне (r=-0,65). В группе девочек с ЭГД концентрация лептина составила 10,46±2,55 нг/мл, что достоверно превышало показатели контрольной группы (p 0,05), но было достоверно ниже в сравнении с группой мальчиков с ЭГД (p 0,05). Уровень грелина в группе девочек с ЭГД составил 33,77±8,45 пг/мл, адипонектина 21,42±2,23 нг/мл, что не имело статистически значимых отличий в сравнении с группой контроля. Однако, уровень адипонектина в группе девочек с ЭГД достоверно превышал показатели девочек с ПГД на 28,29% (p 0,05) (табл. 4.3., рис.4.2., 4.3., 4.4.). В группе девочек с ЭГД корреляционный анализ выявил прямые корреляции между содержанием грелина и лептина в крови (r=0,52), ИЛ-1 в слюне (r=0,81), адипонектина и TFF-2 в крови (r=-0,90), обратные корреляции между концентрацией грелина и ИЛ-6 в крови (r=-0,70), лептина и ИЛ-6 в слюне (r=-0,62), адипонектина и ТФР-1 в крови (r=-0,73). Таким образом, уровень грелина у мальчиков с хроническими гастродуоденитами был достоверно повышен во всех исследуемых группах относительно контроля, в то время как у девочек содержание этого адипокина не претерпевало статистически значимых изменений. Существенной разницы в концентрациях адипонектина между группами мальчиков и девочек выявлено не было, однако обращает на себя внимание статистически значимое повышение этого показателя у девочек с ЭГД относительно ПГД, в то время как у мальчиков подобных изменений не наблюдалось .
При анализе полученных результатов с учетом типа пищевого поведения, группа детей с ХГД была разделена на четыре подгруппы: группа без нарушения пищевого поведения (10 детей – 19%); с ограничительным типом пищевого поведения (10 детей – 19%); с эмоциональным типом пищевого поведения (15 детей – 29%) и экстернальным типом пищевого поведения (17 детей – 33%).
Примечание: - различия статистически значимы в сравнении с пациентами без нарушения пищевого поведения, (p 0,05); – различия статистически значимы в сравнении с пациентами с ограничительным типом пищевого поведения, (p 0,05). В группе детей с ограничительным типом пищевого поведения было выявлено достоверное возрастание концентрации лептина в сыворотке крови (33,70±8,3 нг/мл) (p 0,05), ИМТ (23,59±1,47) и толщины кожной складки (29,44±3,40 мм) в сравнении с группой детей без нарушения пищевого поведения. Уровни грелина (23,54±8,48 пг/мл) и адипонектина (19,78±2,38 нг/мл) в этой группе пациентов не отличались от показателей без нарушения пищевого поведения (табл.4.4., рис.4.5.).
В группе детей с эмоциональным типом пищевого поведения отмечалось снижение уровня лептина (4,28±1,30 нг/мл) (p 0,05), ИМТ (17,67±0,56) в сравнении с ограничительным типом пищевого поведения. Также отмечалось достоверное уменьшение толщины кожной складки (12,00±1,18 мм) в сравнении с группой детей без нарушения пищевого поведения и ограничительным типом пищевого поведения. Уровни грелина (31,07±4,89 пг/мл) и адипонектина (19,32±2,17 нг/мл) статистически значимо не отличались от показателей группы детей без нарушения пищевого поведения (табл.4.4., рис.4.5.).
В группе пациентов с экстернальным типом пищевого поведения отмечалось снижение уровня лептина (10,19±2,9 нг/мл), ИМТ (17,76±0,63) и толщины кожной складки (17,41±2,67 мм) в сравнении с группой детей с ограничительным типом пищевого поведения. Уровни грелина (26,40±7,09 пг/мл) и адипонектина (22,58±2,4 нг/мл) статистически значимо не отличались от показателей группы детей без нарушения пищевого поведения (табл.4.4., рис.4.5.).
В группе мальчиков с ограничительным типом пищевого поведения было выявлено достоверное возрастание концентрации лептина в сыворотке крови (28,92±10,81 нг/мл) (p 0,05), ИМТ (27,68±2,87) и толщины кожной складки (36,66±5,33 мм) в сравнении с группой мальчиков без нарушения пищевого поведения. Уровни грелина (11,81±4,58 пг/мл) и адипонектина (23,20±2,20 нг/мл), в этой группе пациентов не отличались от показателей в группе мальчиков без нарушения пищевого поведения.
В группе девочек с ограничительным типом пищевого поведения ИМТ составил (21,54±1,03) (p 0,05) достоверно превышая показатели группы без нарушения пищевого поведения и в группе мальчиков. Уровни лептина (36,89±12,52 нг/мл), грелина (28,24±11,39 нг/мл), адипонектина (18,95±2,90 нг/мл) и толщины кожной складки (25,83±3,78 мм) статистически значимо не отличались от показателей без нарушения пищевого поведения.
В группе мальчиков с эмоциональным типом пищевого поведения отмечалось снижение уровня лептина (3,16±1,60 нг/мл) (p 0,05), грелина (30,99±6,44 пг/мл) (p 0,05), ИМТ (17,50±0,73) (p 0,05) и толщины кожной складки (10,66±0,33 мм) (p 0,05) в сравнении с ограничительным типом пищевого поведения и группы без нарушения пищевого поведения.
В группе девочек с эмоциональным типом пищевого поведения отмечалось снижение уровня лептина (6,31±2,17 пг/мл) (p 0,05) в сравнении с показателями ограничительного типа пищевого поведения и в группе мальчиков.
