Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы
1Л. Распределение ацетилхолинэстеразы 9
1.2. Функции ацетилхолинэстеразы 10
1.3. Молекулярные формы ацетилхолинэстеразы 12
1.4. Структура ацетилхолинэстеразы 15
1.5. Механизм действия 22
1.6. Субстратная зависимость ацетилхолинэстеразы 25
1.7. Влияние ингибиторов на ацетилхолинэстеразу 28
1.8. Температурная зависимость активности ацетилхолинэстеразы 30
ГЛАВА П. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 37
2.2. Постановка опытов 37
2.2.1. Способ достижения глубокой гипотермии у крыс 37
2.2.2. Способ вызывания зимней спячки у сусликов 37
2.3. Препаративные методы исследования 38
2.3.1. Выделение синаптических мембран 38
2.4. Диализ рекомбинантной ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека 40
2.4.1. Определение активности АХЭ 40
2.4.2. Определение кинетических характеристик АХЭ 40
2.5. Статистическая обработка эксперементальных данных 41
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований
3.1. Температурная зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом 42
3.1.1. Исследование температурной зависимости кинетических кинетитических характеристик ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом коры головного мозга крыс 42
3.1.2. Влияние глицерина на кинетику АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс 49
3.2. Температурная зависимость кинетических характеристик рекомбинантной АХЭ 56
3.2.1. Температурная зависимость кинетических характеристик рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека 56
3.2.2. Исследование температурной зависимости кинетических характеристик рекомбинантной ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека в присутствии глицерина ..65
3.3. Температурная зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга при гипотермических состояниях 72
З.ЗЛ.Влияние гипотермии на температурную зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс 72
3.3.2. Влияние зимней спячки на температурную зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга сусликов 19
Заключение 88
Выводы 106
Список литературы 108
- Структура ацетилхолинэстеразы
- Выделение синаптических мембран
- Исследование температурной зависимости кинетических кинетитических характеристик ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом коры головного мозга крыс
- Температурная зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга при гипотермических состояниях
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ацетилхолинэстераза - это ключевой фермент холинэргической нейро-медиаторноЙ передачи импульсов (Venturino et al., 2002). Холинэргические синапсы распределены по всему мозгу, в том числе и коре больших полушарий, и играют важную роль в регуляции активности мозга (Brzinetal., 1983).
Основная функция ацетилхолинэстеразы (АХЭ) заключается в гидролизе ацетилхолина, поступающего в синаптическую щель в ответ на приходящий в терминаль импульс, с образованием ацетата и холина (Taylor, Brown, 1999). Активность фермента непосредственно влияет на ход физиологического процесса, занимающего несколько миллисекунд (Куффлер, Николе, 1979). Интегри-рованность химической реакции в быстрый физиологический процесс определила кинетические особенности АХЭ: высокая специфичность, наличие двух мест связывания ацетилхолина и эффекта субстратного ингибирования (Mallen-deretal.,2000).
АХЭ - это эктофермент, который, в основном локализован на внешней стороне постсинаптической мембраны, рядом с холинорецептором, и прикреплен к мембране синапсов с помощью «якорной» субъединицы, в качестве которой выступает фосфатидилинозитол (Haas et al, 1996). Известно, что фос-фолипидный и жирнокислотный состав оказывают влияние на фазово-структурное состояние мембраны, от которого зависисят активность и кинетические характеристики АХЭ (Frenkel et al., 1980; Bloi et al, 1974). Одним из факторов, определяющих фазово-структурное состояние мембран является и температура (Крепе, 1981). Вместе с тем неизвестно, как физико-химическое состояние подложки влияет на кинетические свойства АХЭ. Сравнительное исследование мембранносвязанного и солюбилизилированного фермента, возможно, позволит выяснить роль мембраны в функционировании АХЭ.
Установлено, что изменение температуры тела приводит к изменению электрической активности мозга (Deboer, 1998), основой которой является хо-линэргическая передача импульсов. Снижение температуры тела при искусст-
5 венной и естественной гипотермии (зимняя спячка) сопровождается снижением частоты электроэнцефалограмм (Wang, Lee, 1996; Deboer, Tobler, 1995). Такое падение импульсной активности мозга сопровождается соответствующими изменениями во всех звеньях синаптической передачи, в том числе и в ферментативном. В связи с этим исследование ключевого фермента нейромедиаторной системы мозга - ацетилхолинэстеразы представляет несомненный интерес.
Цели и задачи исследования. Целью нашей работы явилось сравнительное изучение температурной зависимости кинетических характеристик, а также термодинамических параметров АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга и солюбилизированной (рекомбинантной) АХЭ мембран эритроцитов человека в норме и гипотермических состояниях. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать температурную зависимость кинетических характеристик и термодинамические параметры АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс.
Исследовать температурную зависимость кинетических характеристик и термодинамические параметры рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека.
Изучить влияние разных концентраций глицерина на концентрационную и температурную зависимость активности мембранносвязанной и рекомбинантной АХЭ
Исследовать особенности температурной зависимости кинетических характеристик и термодинамические параметры АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга гомойо- и гетеротермных животных при искусственной гипотермии и зимней спячке.
Основные положения, выносимые на защиту. 1.Температурные зависимости кинетических параметров (Km, Vm, пн) мембранносвязанной (мембраны синаптосом) и солюбилизированной (мембраны эритроцитов) АХЭ существенно различаются. Степень субстратного ингибирования АХЭ из разных ис-
6 точников снижается при снижении температуры инкубации. Температурная зависимость активности АХЭ определяется концентрацией субстрата.
Глицерин оказывает существенное влияние на кинетические характеристики и термодинамические параметры АХЭ, однако его эффекты на мембран-носвязанную и солюбилизированную (рекомбинантную) формы фермента различаются.
Глубокая (20) гипотермия крыс и зимняя спячка сусликов оказывают различные эффекты на кинетические характеристики и термодинамические параметры АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга, несмотря на то, что все эти эффекты преследует общую цель - снижение электрической активности мозга.
Научная новизна. В настоящей работе впервые в сравнительном аспекте исследованы температурные зависимости кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс и рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека. Установлено, что Km, Vm, Пн и степень субстратного ингибирования являются температурнозависимыми величинами.
Обнаружено, что характер температурной зависимости фермента и соответствующие ей термодинамические параметры зависят от концентрации субстрата.
Новыми являются данные по влиянию глицерина на температурную и концентрационную зависимость мембрацносвязанной и рекомбинантной форм АХЭ. Для обеих форм фермента глицерин при высокий температуре (37 С) смещает точку оптимума на концентрационной кривой в сторону высоких концентраций и снижает субстратное ингибирование; смещает позицию перегиба на кривой температурной зависимости в область низких температур и снижает эффективные энергии активации. Однако имеется и существенные различия в эффектах глицерина: если при низких концентрациях ацитилтиохолина активность рекомбинантиной АХЭ в среде с глицерином выше таковой контроля, то у мембранносвязанной, наоборот, существенно ниже его.
Получены новые результаты по температурной зависимости кинетических характеристик и по термодинамическим параметрам АХЭ мембран си-наптосом крыс при глубокой гипотермии (20) и сусликов при гибернации и спонтанном пробуждении. Показано, что глубокая гипотермия приводит к падению величин Vm, Пн и степени субстратного ингибирования фермента при всех температурах инкубации, термодинамические параметры при этом не претерпевают изменений. При гибернации же, наоборот, повышаются Vm, пн и степень субстратного ингибирования фермента почти при всех исследованных в работе температурах инкубации. Существенные изменения претерпевают термодинамические параметры АХЭ: температура излома смещается в сторону низких температур, повышаются эффективные энергии активации как выше, так и ниже точки излома.
Теоретическое и практическое значение результатов работы. Полученные в работе данные о температурной зависимости кинетических характеристик и об изменении термодинамических параметров мембранносвязанной и со-любилизированной АХЭ расширяют представления о молекулярных механизмах функционирования фермента.
Результаты исследования представляют интерес для понимания механизмов формирования патогенеза холодового повреждения, компенсаторно-приспособительных и адаптивных реакций при снижении температуры тела гомой-отермных и гетеротермных животных. Решение указанных теоретических проблем, может иметь большое практическое значение для различных медико-биологических приложений.
Полученные в диссертации результаты используются при чтении курсов «Биофизика», «Кинетика ферментативных реакций», «Молекулярная биофизика» в Дагестанском Государственном Университете.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава ДГУ, Всероссийской научно-практической конференции (Махачкала, 2001), XVIII двухгодичном съезде Международного нейрохимического общества (Буйенес-
8 Айрес, 2001), 6-й Пущинской школе-конференции (Пущино, 2002), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).
Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 5 работ, одна работа находится в печати.
Структура ацетилхолинэстеразы
Революционным поворотом в идентификации структуры АХЭ стал рен-геноструктурный анализ фермента из электрических органов ската Torpedo cali-fornica (Sussman et al., 1991). На данный момент наряду с АХЭ Torpedo califor-nica хорошо изученными являются АХЭ человека (Kryger et al., 1998, 2000), мыши (Bourne et al., 1999) и электрического угря (Bourne et al., 1995). Трехмерные (ЗД) структуры АХЭ всех этих видов животных обладают поразительной гомологией с ферментом из Torpedo californica. АХЭ Torpedo californica - это гомодимер, мономер которого представлен а/р белком, состоящим из 587 аминокислот. Молекула имеет эллипсовидную форму размером « 45 А х 65 А, состоит из 12 В-складчатых структур, окруженных а-спиралями. Первая и последняя пара складок формируют р-шпилочные петли, которые свободно связаны водородными связями с восмью центральными суперспирализованными скрученными складками. Рассматриваемая вдоль оси полоса изгибается на 180, в то же время, если рассматривать перпендикулярно, то первая и последняя складки пересекают друг друга на 90 (Sussman et al., 1991). Из 14 а-спирапеЙ 2 наиболее длинные, названные aF и ссН, наклонены близко к своим внутриспиральным дисульфидным мостикам, a-спирали занимают 30% общей массы, а Р - 15%.
Цельная структура АХЭ замечательно сходна с диенолактоновой гидро-лазой (ДЛГ) и пшеничной сериновой карбоксипептидазой-П (Ollis et al., 1992). Как и все холинэстеразы, АХЭ содержит в активном центре каталитическую триаду: серии, гистидйн и глутамат вместо аспартата сериновых протеаз. Однако трехмерная структура АХЭ имеет множество неожиданных черт.
Активный центр глубоко спрятан на некоторой глубине от поверхности каталитической субъединицы, на дне длинной и узкой полости. Эту полость называют «каталитическим ущельем» или, поскольку 60% ее поверхности выстроено рядом 14 неконсервативных ароматических остатков, - «ароматическим ущельем» (Alexsen et аі., 1994; Ariel et al., 1998). Глубина ущелья составляет 20А, ширина его наиболее узкого участка - 4,4А, а ширина входа - 0,8А (Massoulie et al., 1993). Условно ущелье можно поделить на верхнюю и нижнюю части с помощью суженной части, формированной тирозином 121 и фени-лаланином 330 (Bourne et al., 1999). Ущелье пронизывает фермент почти до середины и расширяется ближе к основанию.
АХЭ подобно другим а/р гидролазам содержит со-петлю от остатка цис-теина 67 по остаток цистеина 94. Остаток от аспартата 70 через валин 84 в этой петле протянут вдоль одного места ущелья от горловины (периферическое место) до основания (ацилирующий участок) (Mallender et al., 2000). На дне ущелья, у самого основания, находится активный центр, образующийся в результате конформационных укладок третичной структуры белка (Sussman et al., 1991). Активный центр включает две группировки: анионную (связывающую четвертичный атом азота ацетилхолина) и и эстеразную (функциональную, гидролизующую сложноэфирную связь ацетилхолина) группировки (Чернышевская, 1983). Расстояние между двумя сайтами 2,5-6,0А (Harel etal., 1993).
Особенностью АХЭ является наличие еще одного анионного места, специфически связывающего бисчетвертичные анионные компоненты (Karelson et al., 1984; Reiner et al., 1993). Это место находится при входе в ущелье и названо периферическим местом (Al-Jafari, Kamal,1998; Elcock et al., 1999; Simone et al., 1999). Молекула АХЭ может содержать несколько периферических мест связывания. С помощью метода флуоресцентного анализа было обнаружено, что они, в основном, образованы ароматическими аминокислотами (триптофан 279, тирозин 280 и фенилаланин 280) (Radic, Tayrol, 2001).
Мутация ароматических групп в периферическом месте значительно снижает сродство к периферическому месту лигандов, таких как пропидиум, фасцикулин (Harel et al., 1992; Radic et al., 1993; Radic et al., 1994). Например, мутация этих групп у мыши приводит к снижению связывания фасцикулина в 10 раз, со сродством равнозначным бутирилхолинэстеразе, которая лишена периферического места (Harel et al., 1995).
Маллендер с соав. (Mallender et al., 2000) определили остаток аспартата 74 как наиболее важный компонент периферического места. Кристаллическая структура показала, что аспартат 74 немного глубже в ущелье ответственен за прямые контакты с фасцикулином - специфическим ингибитором периферического места.
Предположительно, периферический участок способствует повышению концентрации ацетилхолина перед активным центром, а так же облегчает прохождение молекул субстрата через узкий проход по направлении ко дну (Pang et al., 1996; Mallender et al., 1999). Это обусловлено тем, что у периферического места сродство к субстрату (и к четвертичным ингибиторам) намного выше, чем у глубоколежащего активного центра (Nunesavares et al., 2002).
Было предположено, что связывание субстрата к периферическому участку приводит к небольшим конформационным перестройкам в активном центре, способствующим ускорению гидролиза ацетилхолина при его низких концентрациях (Вагас et al., 1995). При высоких же концентрациях ацетилхолина, вследствии «стерической» блокады (Szegletes et al., 1999), перекрывающей проход молекул субстрата к активному центру и выход продукта из ущелья, скорость гидролиза сильно снижается. Возможно, что блокирование избытком субстрата доступа к каталитическому механизму может вызвать изменение движения субстрата (Haas et al., 1992).
Имеются доказательства включения периферического места в функционирование, отличное от катализа. Обнаружено, что периферическое место АХЭ принимает участие в процессах регенерации и роста нейритов (Srivatson, Peters, 1997), а также роста и дифференцировки моторных нейронов (Batailee et al., 1998).
Прежде чем связаться с периферическим местом субстрат должен пройти стерически «узкое» место, «горло» ущелья при входе (botlneck) (Gilson et al., 1994). Радиус «узкого горла» определяется радиусом сферических лигандов, которые могут проходить в ущелье и достигать активного центра, кроме того, величина радиуса варьирует во времени, т.е. «узкое горло» претерпевает флук-турации (Wlodeck et al., 1997).
Выделение синаптических мембран
Животных забивали декапитацией, быстро извлекали головной мозг. На холоде отделяли кору больших полушарий головного мозга и методом низкоскоростного ультроцентрифугирования (Hajos, 1975) выделяли синаптосомы.
Для этого из коры больших полушарий мозга на 0,32 М сахарозе готовили 10% гомогенат в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Полученный гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин для осаждения не разрушенных кусочков ткани, кровеносных сосудов, ядер клеток. Супернатант сливали в стоящую во льду пробирку. К осадку добавляли среду выделения до прежнего объема и после суспендирования с помощью пипетки, центрифугировали при 10000 об./мин в течение 20 мин на центрифуге К-24 (Германия). Супернатант сливали. Осадок представляет собой «грубую» мито-хондриальную фракцию, в которую входят митохондрии, синаптосомы, миелин.
В каждой пробирке полученный осадок суспендировали в 1 мл 0,32 М сахарозы, а затем их объединяли. 2 мл суспензии «грубых» митохондрий наносили на 6 мл 0,8 М сахарозы и центрифугировали при 10000 об/мин в течении 25 мин. После центрифугирования фракции распределялись следующим образом: а) белый слой миелина на границе 0,3-0,8 М сахарозы; б) легкие синаптосомы -частицы, взвешенные по всему объему 0,8 М сахарозы; в) митохондрии и тяжелые синаптосомы (на дне пробирки).
Сначала отбирали фракцию миелина и тщательно вытирали фильтровальной бумагой стенки пробирки. Затем осторожно сливали в стоящую во льду бюкс фракцию синаптосом и разбавляли ее до концентрации сахарозы 0,30-0,35 М Для этого отобранную фракцию синаптосом осторожно, в избежания шока, разводили 0,15 М сахарозой.
Синаптосомы осаждали при 14000 об/мин в течение 25 мин. Для получения мембран у синаптосом вызывали гипоосмотический шок: прибавляли к осадку 3 мл холодной воды и выдерживали в течение 30 минут. Мембраны осаждали при 14000 об/мин в течение 30 мин. Полученные мембраны суспендировали в 1 мл холодной воды, отбирали аликвоту для определения белка, а оставшуюся суспензию замораживали и хранили при -20С.
Рекомбинантная АХЭ мембран эритроцитов человека была любезно предоставлена профессором Терренэ Розенберри из Майо-Клиник (Флорида, США).
Активный центр рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека для предотвращения денатурации фермента был блокирован с помощью ингибитора - декаметониума. Перед работой фермент освобождали от ингибитора путем диализа. Для этого 0,3 мл исходного раствора фермента (1,75 мг/мл) доводили до 3 мл бидистиллированной водой, помещали в диализный мешок, который затем погружался в стакан с 20 мМ фосфатным буфером (рН 8,0). Буфер в стакане меняли 2 раза в день в течение 3-х дней. Полученный диализат хранили в холодильнике при температуре 1-2С. t
Активность АХЭ определяли методом Эллмана (Ellman et al., 1951) в модификации М.М. Маслова и Л.В. Резника (1976).
Инкубационная среда для определения активности фермента содержала 1,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН-8,0) и 0,1 мл 0,071 мМ ДТНБ. Для учета спонтанного гидролиза АТХ ставили контрольную пробу, в которую сразу же добавляли 0,01 мл ингибитора холинэстераз - прозерина (0,05% раствор). Затем в пробы вносили 0,05 мл суспензии исследуемых мембран (25 мкг белка) или раствора рекомбинантной АХЭ (0,0044 мкг белка).
Реакцию начинали добавлением в опытные и контрольные пробы ОД мл АТХ. После тщательного перемешивания пробы инкубировали от 5 до 15 минут. По окончании инкубации гидролиз АТХ в опытных пробах останавливали добавлением 0,01 мл 0,05% прозерина.
Определяли интенсивность желтой окраски аниона - 5 тио-2-нитробензоата при длине волны 412 нм.
Количество тиохолина находили по калибровочной кривой. Активность АХЭ выражали в мкМ тиохолина / мг белка ч, которую вычисляли по следующей формуле:
Л = Д.?\ст.С-247Л
где АЕ- разность значения экстинкции в опыте и контроле; t - коэффициент пересчета на 1 ч; Е значение экстинкции, соответствующее 1 мкг тиохолина, находили по калибровочной кривой; 247,1 - молекулярный вес тиохолина; С - содержание белка в пробе, мкг.
Для определения максимальной скорости (Vm), константы Михаэлиса (Кт) и коэффициента кооперативности Хилла (пн), измеряли скорость ферментативной реакции в диапазоне концентраций АТХ 1,56-10"5 - 8-Ю"3 мМ в отсутствии и присутствии в среде инкубации 1-2% глицерина. Затем строили линейные анаморфозы в координатах Лайнуиверо-Берка и Хилла и находили соответствующие кинетические характеристики.
Для определения температурной зависимость активности АХЭ скорость гидролиза измеряли в диапазоне температур 5-37С при концентрации АТХ 0,2; 0,5 и 2,0 мМ, а также в присутствии глицерина. Затем по графикам в Аррениу-совских координатах вычисляли положение точки излома и энергии активации выше и ниже точки излома.
Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).
Для каждого животного измеряли концентрационную зависимость скорости гидролиза АТХ и вычисляли соответствующие кинетические и термодинамические характеристики. Для каждой серии опытов находили среднее и ошибки средней. Достоверность различия средних определяли с помощью t-критерия Стьюдента (Кокунин и др., 1975). Различие считалось достоверным при уровне значимости Р 0,05.
Исследование температурной зависимости кинетических кинетитических характеристик ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом коры головного мозга крыс
Была исследована концентрационная зависимость активности АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс при различных температурах инкубации. На табл. 1 и рис. 1 представлены зависимости скорости катализа от концентрации субстрата в диапазоне 0,0156 - 8,00 мМ при различных температурах инкубации.
Видно, что кривые зависимости имеют колоколообразную форму: т.е. скорость гидролиза растет до определенного оптимального значения концентрации субстрата (Sopt), затем, по мере дальнейшего увеличения концентрации АТХ, падает.
Таким образом, кинетика реакции характеризуется наличием субстратного ингибирования, что согласуется с литературными данными (Barak et al., 1995; Ordentlich et al., 1998; Botti et al., 1999; Greenblatt et al., 2000).
При 37 С инкубации Sopt соответствует значению 0,5 мМ АТХ. Концентрационные кривые, снятые при различных температурах инкубации, имеют сходные характер и значение Sopt (» 0,5 мМ).
Из рис. 1 видно, что повышение температуры инкубации повышает скорость реакции во всем диапазоне исследованных концентраций. Обращает на себя внимание тот факт, что крутизна правого (ингибиторного) склона концентрационной кривой увеличивается с повышением температуры инкубации, т.е. степень субстратного ингибирования при высокой температуре выше, чем при низкой.
Количественно степень субстратного ингибирования можно охарактеризовать величиной Q, вычисляемой как отношение скорости гидролиза при оптимальной концентрации субстрата (0,5 мМ) к максимально использованной в работе концентрации (8 мМ). При разных температурах инкубации получены следующие значения Q: 37 С - 2,22; 30 С- 1,89; 27 С - 2,1; 23 С -1,97; 20 С -1,87; 15 С -1,7; 10 С - 1,64. Видно, что Q является температурнозависимой величиной: с повышением температуры инкубации значение Q повышается, а следовательно повышается субстратное ингибирование АХЭ.
Результаты исследования температурной зависимости кинетических параметров АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс приведены в табл. 2 и на рис. 2. Видно, что по мере повышения температуры существенно увеличивается Vm. График Аррениуса для Vm линеен и имеет лишь слабую тенденцию к перегибу при температуре и 23 С (рис. 2 а).
Температурная зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга при гипотермических состояниях
Концентрационные зависимости АХЭ при гипотермии 20 С приведены на рис.14 и табл.20. Исследование показало, что при всех исследованных концентрациях субстрата и температурах инкубации при гипотермии наблюдается снижение скорости гидролиза АТХ относительно контроля (рис. 1). Активность фермента снижается в оптимуме при 37 С на 21 %. Положение точки оптимума при гипотермии не меняется относительно контроля, составляя 0,5 мМ АТХ. При гипотермии по сравнению с контролем уменьшается степень субстратного ингибирования фермента, особенно при 30 и 37 С.
Максимальная скорость фермента (рис. 15а) при гипотермии заметно уменьшается (на 20%), однако характер температурной зависимости Vm при этом не изменяется. Обращает на себя внимание то, что на графике температурной зависимости Vm при гипотермии, так же как и в контроле, нет излома.
Гипотермия 20 С существенно не изменяет значения Кт, однако температурная зависимость этого параметра заметно уменьшается (рис. 156, табл. 21)
Гипотермия 20 С существенно не влияет на температурную зависимость п„ (рис. 15в), однако, в целом степень кооперативности несколько уменьшилась. Как и при нормотермии в диапазоне температур 20 - 30 С наблюдается резкое изменение (увеличение) пн.
При гипотермии, как и в контроле, температурная зависимость скорости ферментативной реакции при концентрации субстрата 0,2 мМ представлена двумя нелинейными участками (рис.16, табл. 22) с точкой пересечения 22,3 С.
Km (б), пн (в): - контроль, о - гипотермия. Таблица 22 Температурная зависимость активности АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс при гипотермии 20 С (концентрация АТХ 0,2 мМ (М + m; n = 3))
В целом график температурной зависимости АХЭ при гипотермии проходит ниже такового при нормотермии: при этом почти не изменяются точка перегиба и углы наклона прямых температурной зависимости относительно контроля. В связи с этим термодинамические характеристики температурной зависимости при гипотермии также не подвергаются значительным изменениям (табл. 23).
Положение точки излома и энергия активации АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс при гипотермии (М + m; п = 3)
. Влияние зимней спячки на температурную зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга сусликов.
Как видно из табл. 24 при зимней спячке активность АХЭ синаптосом, измеренная при температуре 37С и оптимальной концентрации субстрата (0,5 мМ) возрастает на 36 %, в то же время как при спонтанном пробуждении животных активность фермента снижается даже относительно контроля.
Исследование концентрационной зависимости скорости гидролиза АТХ ферментом контрольных сусликов выявило наличие оптимума при концентрации фермента примерно 1 мМ при всех исследованных температурах инкубации (рис. 17, табл. 25). Следует отметить, что при гибернации и спонтанном пробуждении наблюдается сдвиг Sopt в сторону меньших концентраций субстрата. Увеличение концентрации субстрата выше Sop{ снижает скорость гидролиза АТХ при всех исследованных состояниях.
![Психофизиологические особенности клинически здоровых лиц мужского пола и больных артериальной гипертензией в зависимости от индекса массы тела и типа распределения жировой ткани [Электронный ресурс]](/i/i/4429/176970.png "Психофизиологические особенности клинически здоровых лиц мужского пола и больных артериальной гипертензией в зависимости от индекса массы тела и типа распределения жировой ткани [Электронный ресурс] Мартынова Анна Геннадьевна")
