Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Сохранение семени при плюсовых температурах 7
2.2. Микрокапсулирование семени быка 23
2.3. Факторы, влияющие на оплодотворяющую способность спермы после осеменения 36
3. Методы и материалы исследований 48
3.1 Разработка синтетической среды 48
3.2. Определение нуклеазной активности семени быка в предложенной синтетической среде 52
3.3. Анаэробное хранение семени в предложенной синтетической среде 52
3.4. Микроинкапсулирование семени быка 53
3.5. Определение механических свойств микрокапсул 54
3.6. Определение времени высвобождения спермиев из алгинат-кальций-хитозановых микрокапсул и активности спермиев после инкапсулирования (in vitro тест) 55
3.7. Изучение оплодотворяющей способности семени инкапсулированного в предложенной среде в алгинат-кальций -хитозановые микрокапсулы 55
4. Результаты исследований 57
4.1. Среда для сохранения семени быка при температуре 35-37С 57
4.2. Механические свойства алгинат-хитозановых микрокапсул 65
4.3. Проверка оплодотворяющей способности микроинкапсулированного семени 70
5. Обсуждение результатов 72
6. Выводы 84
7. Практические предложения 86
Список цитируемой литературы 89
- Сохранение семени при плюсовых температурах
- Разработка синтетической среды
- Изучение оплодотворяющей способности семени инкапсулированного в предложенной среде в алгинат-кальций -хитозановые микрокапсулы
- Механические свойства алгинат-хитозановых микрокапсул
Введение к работе
Актуальность темы
На современном этапе развития искусственного осеменения, когда сперму хранят неограниченное время при температуре жидкого азота (при -196° С), ставить такой вопрос как хранение спермы при температуре тела, по крайней мере, несколько странно. Дело в том, что после оттаивания при температуре тела период живучести семени резко сокращается. Следовательно, для достижения положительного результата необходимо наладить мониторинг состояния полового цикла коров, определение сроков овуляции и оптимального срока осеменения, что практически невозможно выполнить в мясном скотоводстве. Однако, прогресс в генетическом улучшении скота в этой области крайне необходим.
Идеально, было бы добиться хранения спермы в половом тракте коровы в специальных капсулах, которые бы открывались в период овуляции и выделяли порцию семени для оплодотворения яйцеклетки. Такой метод хранения семени в половом тракте самки получил в литературе название «инкапсулирования спермы» (Nebel R.L. et al., 1985, 1993, 1996).
Ученые центра тропического животноводства в Австралии приступили к практическому исполнению идеи по разработке метода хранения семени при 37°С и получили первые результаты по использованию инкапсулированного семени быка в искусственном осеменении (D Occhio М., 1993). В нашей стране с 60-х годов этому вопросу не уделяли должного внимания, глубокое замораживание захватило умы исследователей.
Особый интерес микроинкапсулирование спермы представляет для двух областей метода искусственного осеменения -это программы суперовуляция у коров-доноров и синхронизация охоты у самок сельскохозяйственных животных. В указанных ситуациях овуляция наступает в течение более длительного периода времени, и микрокапсулы могут быть доступны в течение всего периода. Таким образом, благодаря микроинкапсулированию снижается важность определения оптимального срока осеменения. Известный ученый США Вольфганг Иохле, который 40 лет своей жизни посвятил разработке методов синхронизации охоты у самок сельскохозяйственных животных, считает, что способность использовать микроинкапсулированную сперму с долгим сроком жизни предпочтительнее инъекций простагландина F2. При этом отпадет необходимость учитывать время охоты и овуляции, что позволит методу искусственного осеменения утвердиться в мясном скотоводстве (Jochle W., 1993).
Определение оптимального времени осеменения в искусственном осеменении крупного рогатого скота это критическая точка в указанном методе, потому что существует вариабельность времени овуляции относительно установленной охоты и трудность в установлении точного времени прихода коровы в охоту, особенно в мясном скотоводстве (Foote R. et al., 1993).
Вышеизложенное позволяет заключить, что исследования, посвященные разработке способа хранения семени быка при температуре тела в капсулах, является актуальным не только в практическом, но и в теоретическом плане.
Цель работы и задачи исследований
Целью настоящей работы являлось разработка среды для хранения семени быка при температуре 35-37°С и моделирование капсулы с самовытекающим семенем. В связи с этим решали следующие задачи:
1. Разработать новую синтетическую среду для хранения семени быка при 35-37°С с содержанием уже ранее вводимых в разные среды комплексонатов, витаминов, Сахаров, электролитов и органических кислот.
2. Смоделировать in vitro условия придатка семенника за счет насыщения разбавленного средой семени углекислым газом, добавления кислотных инактиваторов (янтарная и сорбиновая кислоты), понижения температуры хранения семени.
3. Смоделировать капсулу, которая обеспечит медленное вытекание семени под влиянием изменений условий среды в шейке матки (38°C t 39°C, 5.3 рН 7.8). 4. Исследовать свойства полученных микрокапсул и их влияние на находящихся в них живчиков быка.
5. Провести экспериментальные исследования проверки результативности осеменения коров инкапсулированным семенем быка с введением его в шейку матки.
Научная новизна исследований состоит в том, что разработана среда для кратковременного хранения семени быка при температуре 35-37°С. Впервые применен высокомолекулярный полимер хитозана в животноводстве для инкапсулирования живчиков. Семя быка инкапсулировано в алгинат-кальций-хитозановые микрокапсулы. Проведена проверка результативности осеменения коров живчиками, инкапсулированными в капсулы.
Практическая ценность работы. Предложена среда для сохранения семени быка в микрокапсулах.
Основные положения, выносимые на защиту:
среда для кратковременного хранения семени быка при температуре 35-37°С;
биологическое обоснование и применение высокомолекулярного полимера хитозана для инкапсулирования;
биологическое обоснование микроинкапсулирования семени быка в животноводстве;
экспериментальные данные по инкапсулированию семени быка в алгинат-кальций-хитозановые микрокапсулы и проверке результативности осеменения коров живчиками, инкапсулированными в эти капсулы.
Апробация работы. Материалы проведенных исследований были доложены, обсуждены и получили положительную оценку:
на ежегодных конференциях аспирантов и молодых ученых «Достижения молодых ученых» (2001, 2002 гг. ВИЖ); на ежегодных международных научно-практических конференциях
«Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (2001, 2002 гг., ФГОУ РАМЖ);
на второй Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (19-20 ноября 2002г., ВИЖ, Дубровицы);
на научной конференции отдела биологии воспроизведения и отдела сертификации и эколого-генетических исследований в животноводстве ВИЖа (14 мая 2003 г.);
Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в отделе биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства (ВИЖ).
Сохранение семени при плюсовых температурах
С развитием программ по искусственному осеменению с-х. животных в 20 веке появилась необходимость доставки семени на значительные расстояния от места взятия до места осеменения и осеменение большого количества самок от одного самца-производителя в течение продолжительного периода или несколько раз в течение года, для решения, которых требовалось сохранение семени в искусственных условиях. Ведущее место в любой программе искусственного осеменения сельскохозяйственных животных занимает проблема сохранения жизнеспособности семени производителей.
Спермин -катаболические клетки, поэтому их жизнь после эякуляции, как in vivo так и in vitro ограничена несколькими часами. Процесс эякуляции безвозвратно изменяет спермин и радикально увеличивает их биоэнергетический «аппетит» (Таблица 1).
8 В процессе семяизвержения жидкость, выделяемая вместе с живчиками из придатка семенника, разбавляется секрецией добавочных половых желез. Появляется возможность начала новых биохимических процессов, которые находят свое видимое выражение в энергичной подвижности живчиков. Разбавление семени до концентрации равной концентрации в эпидидимисе не только не возвращает клетки в неподвижное состояние, но и создает биоэнергетические условия, когда недостаток питательных веществ в суспензии семени приводит к уменьшению объема АТФ и потери жизнеспособности. Расход энергии свежевзятого семени почти в три раза выше, по сравнению с семенем в хвосте придатка; подвижность же живчиков одинакова, но с разными формами волн и схемами движения. Обмен веществ свежевзятого семени и семени в хвосте придатка семенника находятся в прямой зависимости от температуры, показатели которого при 20С составляют 10-20% от показателей при 37С.
Живучесть спермиев может быть увеличена посредством широкого спектра факторов. Спермин остаются живыми в течение нескольких дней в яйцеводах млекопитающих в период охоты самки и до нескольких месяцев в яйцеводах летучих мышей (Raccey Р.А., 1979). Специализированные железы, так называемые, «хозяева спермиев» в яйцеводах домашних кур и индеек поддерживают жизнеспособность спермиев в течение нескольких недель (AitkenRNC, 1971).
Многочисленные исследования ученых (Милованов В.К., 1962; Жильцов Н.З., 1967; Милованов В.К. и Жильцов Н.З., 1970; Setchell В.Р. et al, 1993) показали, что условия, определяющие длительное сохранение живчиков в придатке семенника, обусловлены следующими факторами: Несколько пониженная температура в мошонке; Слабокислая реакция (рН = 6.7-6.8) и высокая буферность содержимого эпидидимиса; Своеобразие структуры и функции эпидидимиса (секреция, кровообращение, газообмен); Затрудненное снабжение кислородом живчиков и снижение окислительно-восстановительных процессов в хвосте придатка. Продлить же срок хранения семени in vitro можно, применяя методы, которые позволяют снизить или затормозить обменные процессы в живчиках, вплоть до полного прекращения движения или обмена, но при создании необходимых условий живчики вновь приобретают активное движение. В соответствие с этим, исследователи оценивали возможность хранения семени (Милованов В.К., 1962): в жидком (не замороженном) состоянии, применяя пониженные температуры (5-25 С) или другие способы подавления метаболизма; в замороженном состоянии, которое включает замораживание семени двуокисью углерода, жидким кислородом или жидким азотом и хранение семени при температуре ниже 0С; высушивание семени. В течение длительного времени единственным способом хранения семени было глубокое его замораживание при -196С. Этот метод позволяет сохранить семя в течение нескольких лет. Действительно, низкие температуры позволяют свести до минимума процесс обмена в живчиках, затормозить рост и развитие микробов, что предохраняет семя от гнилостного распада и накопления вредных продуктов в среде. Однако при глубоком замораживании погибает большое количество спермиев, наблюдается повреждение мембран и спермии становятся более чувствительными к стрессам окружающей среды (Hammerstedt R. et al., 1990; Parks JE and Graham JK, 1992). Отсюда, улучшение методов, сохраняющих оплодотворяющую способность семени, должно быть направлено на замедление или снижение катаболических процессов при одновременном увеличении устойчивости мембран к температуре и другим влияниям окружающей среды.
Теория искусственного анабиоза семени, разработанная советскими исследователями (Милованов В.К. и Хабибулин Х.Х.), дала возможность изыскания более доступных в любых условиях среды способов хранения семени. Сущность ее заключается в сочетании двух факторов: пониженной температуры и незначительной кислотности среды (в пределах рН 6.3-6.4). Еще в середине 20-х годов 20 века советские ученые К.Н.Кржижковский и Г.П.Павлов доказали, что накопление в семени двуокиси углерода (С02) в результате дыхания живчиков приводит к постепенному снижению их активности до полного прекращения движения. Семя сохранялось в состоянии анабиоза при 10С в течение 6 суток, а затем по мере удаления двуокиси углерода движения живчиков восстанавливались.
Метод хранения семени путем иммобилизации двуокисью углерода получил теоретическое объяснение в работах академика В.К. Милованова (1962). Он показал, что снижение двигательной и биохимической активности живчиков по мере накопления в среде СОг объясняется не специфическим действием этого газа, а слабым раствором угольной кислоты, которая образуется в результате взаимодействия двуокиси углерода и воды.
Угольная кислота обладает двумя важными для данной проблемы особенностями: во-первых, она никогда не достигает состояния кислотной токсичности для живчиков, так как встречается в природе только в виде очень слабых водных растворов и при незначительном подогревании легко распадается на двуокись углерода и воду; во-вторых, угольная кислота имеет малую константу ионизации, в связи с чем, она легко проникает внутрь живчиков и быстро вызывает обратимую инактивацию их при комнатной температуре.
Разработка синтетической среды
В работе (Gualtieri R. и Talevi R., 2000) приводятся причины, вызывающие освобождение спермиев от однослойного эпителия яйцевода in vitro. Авторы отмечали, что освобождение спермиев наступало вследствие изменений, происходивших в плазматической мембране, не связанных с акросомной реакции. Если бы освобождение живчиков было связано с началом акросомной реакции, то все бы они имели бы поврежденную акросому, а их наличие среди освободившихся могло бы объяснить тот факт, что акросомная реакция наступала после их отрыва.
Исследования многих ученых показывают, что в сцеплении живчиков с эпителием участвуют специальные лиганды углеводов. Установлено, что фетуин и его конечный продукт сиаловая кислота задерживают связывание спермиев с эпителием при вливании вместе с семенем в яйцеводы хомяков (DeMottRPetal, 1995).
У лошадей присоединение живчиков жеребца к эпителию in vitro блокируется асиалофетуином и его конечным продуктом галактозой (Lefebvre R et al, 1995).
В исследованиях на коровах доказано, что сцепление живчиков спермы быка с эпителием яйцевода происходит с участием фукоидана и его компонента фукозы и при помощи Са -зависимого лектина на поверхности спермия быка (Suarez SS et al, 1998). In vitro фукоза блокирует сцепление спермиев быка с однослойным эпителием. С помощью фукозо-специфичных лектинов было выявлено, что фукоза густо распределена на поверхности эпителия, а предварительная обработка эпителия фукозидазой снижала вероятность сцепления живчиков (Lefebvre R et al, 1997).
R. Lefebvre и SS. Suarez (1996) отмечали в своих исследованиях, что присоединение спермиев быка с эпителием яйцевода значительно снижалось, если при культивировании добавляли гепарин. Известно, что гепарин является возбудителем капацитации и активно используют при оплодотворении in vitro у быков (Talevi R. и Gualtieri R., 2001).
Показано, что сульфатные гликоконьюгаты гепарин и фукоидан сильно тормозили связывание живчиков быка и инициировали их освобождение от культивированных in vitro однослойных эпителиев яйцевода (Talevi R. и Gualtieri R., 2001). Авторы отмечают, что добавление гликоконьюгатов сначала вызывало резкое увеличение частоты биения жгутиков у связанных спермиев, а потом освобождение живчиков наделенных высокой линейной подвижностью.
Установлено, что подобные гепарину глюкозоаминогликаны присутствуют в жидкости яйцевода у коров, причем их концентрация и способность к капацитации изменяется в течение полового цикла, достигая максимума в эструсе (Parrish Л et al, 1989).
S.H. Anderson и GJ. Killian (1994) установили, что in vitro явление капацитации связано с белками, глюкозоаминогликанами и протеогликанами условной среды, количество которых достигало максимума в условной среде тела матки в эстральную фазу цикла и падало во время фолликулярной фазы.
Учитывая, что спермин быка могут находиться в матке до 18 часов до момента оплодотворения, можно предположить, что секреты матки могут играть ведущую роль во время капацитации спермиев in vivo.
На основании вышеизложенного можно предположить следующий сценарий оплодотворения in vivo (Revah I et al, 2000). К моменту попадания в половые пути самки некапацитированные живчики теряют некоторые слои. Эти живчики формируют "хранилище" связываясь с эпителием через фукозо -связывающую молекулу, выступившую на его поверхности. К моменту овуляции эти живчики претерпевают капацитацию, и их способность связываться с эпителием теряется, благодаря удалению или перестройке фукозо -связывющей молекулы. Претерпевшие же капацитацию живчики не могут больше связываться с эпителием и высвобождаются из «хранилища», направляясь к ампуле. В тоже время, участок, связывающийся с маннозой, который был инактивирован, выявляется на поверхности живчика, обеспечивая его привязывание к прозрачной зоне яйца или стимулируя его акросомную реакцию. Возможно, полезнее было бы инактивировать манноза -связывающий участок до последнего момента (до контакта с ооцитом), чтобы предохранить от преждевременной акросомной реакции или случайного прилипания к различным поверхностям половых путей самки.
Глюкозоаминогликаны, выделяемые яйцеводам самки в эструсе могут последовательно регулировать капацитацию спермиев, сначала индуцируя высвобождение спермиев из «хранилища спермиев» в матке, а затем усиливая оплодотворяющую способность живчиков (Talevi R. and Gualtieri R., 2001).
В исследованиях (Boilard М. et al, 2002) установлено, что апикальная плазматическая мембрана эпителиальных клеток яйцевода коров содержит надежно закрепленные белковые факторы, которые способствуют поддержанию подвижности и живучести и, возможно, регулируют капацитацию живчиков быка.
Ota Y. с соавт. (2002) обнаружили, что белок, секреторный ингибитор протеазы лейкоцита (СИПЛ), представляет слой в 12 кДа в матке, ампулле и воронке фаллопиевых труб. СИПЛ предупреждает снижение акросомной реакции через эластазу в дозозависимои манере. В фаллопиевых трубах СИПЛ способствовал взаимодействию ооцит -живчик. Прежде, он был обнаружен в секрете околоушной железы, шеечной/цервикальной слизи, семенной плазме и асците и обозначен потенциальным ингибитором активности эластазы лейкоцита человека.
Обеспечение капацитации и замедление вытекания спермы в половых путях самки актуальные факторы, решение которых, может стать ключом при разработке метода сохранения спермы при температуре тела с использованием специальных сред, микроинкапсулирования и повышения вязкости вводимого семени. Особо важно обеспечить при этом сцепление живчиков с однослойным эпителием шейки, тела матки, матки и яйцеводов перед моментом овуляции, когда практически и начинается процесс капацитации.
Изучение оплодотворяющей способности семени инкапсулированного в предложенной среде в алгинат-кальций -хитозановые микрокапсулы
Анализ литературных данных показывает, что на протяжении длительного времени основным способом замедлить биохимические реакции и продлить живучесть семени, поскольку обмен веществ в живчиках прямо пропорционален абсолютной температуре, было понижение температуры и добавление кислотных инактиваторов при хранении семени (Жильцов Н.З., 1967; Середин В.А., 1985; Hammerstedt R., 1993; Maxwell WM, Salamon S, 1993). А возможно ли сохранение семени при температуре тела?
Известно, что органические кислоты (лимонная, пировиноградная, капроновая кислоты) влияют на хранение семени быка при плюсовых температурах. В ходе исследований было установлено, что лимонная и пировиноградная кислоты при добавлении ( 7 рл/10 мл) к среде ГлЦЖ не удлиняют срок хранения семени при 35-37С. В средах ГлЦЖ с указанными выше кислотами, как и в контроле (ГлЦЖ без кислот), уже через 24 часа наблюдали Еп. В средах же с янтарной и капроновой кислотами дело обстояло иначе. Обе кислоты, при добавлении ( 7 цл /10 мл) к ГлЦЖ, оказывали положительное влияние на увеличение срока хранения живчиков. Однако, в среде ГлЦЖ с янтарной кислотой живчики сохраняли активность на 24 часа дольше, чем в среде с капроновой кислотой. Возможно, эти результаты подтверждают данные Н.З. Жильцова (1967) о том, что капроновая кислота действует как поверхностно-активное вещество. Адсорбируясь живчиками, она проникает в них, вклинивается между молекулами плазмолагена в мембране и смягчает действие холодового удара. При данной же температуре (35-37С) живчики нуждаются в первую очередь в экзогенном субстрате для поддержания установленного уровня дыхания, а капроновая кислота не является источником питания. Можно предположить, что янтарная кислота напротив служит и источником энергии и кислотным инактиватором.
Янтарная (НООС-СН2-СН2-СООН, бутандиовая) кислота обладает химическими свойствами, характерными для дикарбоновых кислот, вступая в реакции с водными растворами щелочей, образует соли, называемые сукцинаты. Как известно, сукцинат является одним из промежуточных продуктов цикла Кребса и при помощи сукцинатдегидрогеназы превращается в фумарат с высвобождением 02 и АТФ. Более того, при окислении янтарная кислота может вступать в реакцию с Н2Ог и в зависимости от условий может образоваться пероксиянтарная (СН2СОООН)г, оксоянтарная или малоновая кислоты.
Вследствие того, что янтарная кислота абсолютно безвредное вещество (присутствует во всех организмах), обладающее особыми полезными свойствами, она получила широкое применение во многих областях медицины. Известно, что в процессе жизнедеятельности живчиков образуются агрессивные формы кислорода, которые окисляют или разрушают клетки, приводя к неминуемой ее гибели. Янтарная кислота способна эффективно обезвреживать свободные радикалы, тем самым предотвращать опасное для живчиков окисление липидов мембраны. Кроме того, она также обладает мощным антиоксидантным свойством. Все это дает основание предположить, что янтарная кислота является наиболее благоприятным агентом для сохранения семени быка при температуре близкой к температуре тела, при 35-37С. Сорбиновая кислота (СН3СН=СНСН=СНСООН) является типичным представителем ненасыщенных карбоновых кислот. В присутствие кислорода или пероксидов легко окисляется, образуя при полном окислении углекислый газ и воду. Таким образом, она может способствовать созданию анаэробных условий в среде, которые, как известно, замедляют метаболические процессы в живчиках. Было установлено, что сорбиновая кислота при добавлении (7цл/10мл) к предложенной среде способствует сохранению семени быка при данной температуре. Более того, сорбиновая кислота обладает фунгицидными свойствами и низкой токсичностью, поэтому широко используется в пищевой и косметической промышленностях, в качестве природного консерванта, так как впервые в 1859 году была выделена Гофманом из рябинового сока. Следовательно, при хранении семени она может быть использована для предупреждения роста бактерий. Активные молекулы кислорода, вступая в реакции с липи дами, ненасыщенными гидрокарбонатами и жирными кислотами, которые в большом количестве содержатся в мембране, вызывают липидную пероксидацию, ведущую к дестабилизации мембраны, снижению подвижности и оплодотворяющей способности живичиков. Было показано, что при хранении семени хряка в жидком состоянии изменяется соотношение жирных кислот в фосфолипидах мембраны -уменьшается количество полиненасыщенных жирных кислот (С22:6п-3) и увеличивается количество насыщенных жирных кислот (С 18:0). Введение а-токоферола полностью предотвращало окислительное разрушение полиненасыщенных жирных кислот С22:6п-3 и, тем самым, увеличивало живучесть спермиев (Cerolini S et al, 2000). Вероятно, а-токоферол ацетат также как и капроновая кислота является поверхностно-активным веществом. Только в отличие от капроновой кислоты, его молекулы не вклиниваются между молекулами плазмолагена в мембране живчиков, а взаимодействуют с ненасыщенными жирными кислотами по межмолекулярным связям. Более того, за счет отщепления атома водорода от гидроксильной группы он способен образовывать устойчивые свободные радикалы, которые в свою очередь могут вступать во взаимодействие со свободными радикалами, участвующими в образовании пероксидов.
Механические свойства алгинат-хитозановых микрокапсул
Более того, замечено, что толщина мембраны увеличивалась (с 65 до 350 (їм) при увеличении концентрации раствора хитозана (с 0.2 до 1.5%), соответственно.
Проанализировав вышеназванные параметры и протестировав жизнеспособность живчиков при инкубировании гранул с живчиками в растворе хитозана в течение 15 минут, установили оптимальные условия инкубирования -время 10 минут при рН 6.0 в 1% растворе хитозана.
Влияние концентрации поликатиона (поли-Ь-лизина) на толщину мембраны микрокапсул описано и в исследованиях (Nebel R et al, 1993, 1996). При повышении концентрации поликатиона (с 0.025% до 0.1%) получали более толстую мембрану (3.22 цм и 7.44 (їм, соответственно). В последнее время было показано, что одноступенчатый подход (бинарная система образования ПЭК) для формирования мембраны микрокапсулы, основанный на взаимодействии двух противоположнозаряженных полимеров, может значительно облегчить процесс микроинкапсулирования живых клеток. Несомненно, такой способ микроинкапсулирования для практического применения кажется более оптимальным. Однако, при упрощении процесса микроинкапсулирования были получены микрокапсулы с более тонкой мембраной, которая нарушалась через несколько минут от собственного веса после удаления окружающего раствора хитозана, а сама идея микроинкапсулирования живчиков быка теряла всякий смысл. Эти результаты согласуются с ранее полученными данными других исследователей (Gaserod О et al. 1998, 1999). Влияние концентрации и молекулярной массы полианиона на свойства бинарных микрокапсул было описано в исследованиях (Bartkowiak А, 2001). Применяя полианион (алгинат) более высокой молекулярной массы можно получить микрокапсулу с большей механической устойчивостью. При понижении концентрации алгината уменьшается плотность распределения заряда на поверхности полианиона микрокапсулы, что приводит к формированию менее плотной и более проницаемой мембране. Показано, что температура влияет на вязкость полимерных растворов, которая в свою очередь может сказываться на свойствах получаемых микрокапсул (Bartkowiak А, 2001). Более того, это имеет большое значение для реологического поведения полиэлектролитов, обладающих термозависимыми свойствами образования геля, когда изменением температуры при формировании мембраны микрокапсулы, вокруг точки перехода золя в гель, можно смоделировать капсулу с определенной проницаемостью и механической устойчивостью мембраны. Было установлено, что при повышении температуры и времени инкубирования микрокапсул при этой температуре уменьшалась толщина мембраны микрокапсулы. На основании этих данных можно предположить, что эта разница в толщине мембраны связана с рН среды для инкубирования. Так в предложенной среде рН 6.4, в ГлКап рН 6,4, в ЛЦЖ рН 7.0, в ГЦЖ рН 7 Лив 6% глюкоза рН 7.1. Показано, что концентрация хлорида кальция, используемого для инкапсулирования, влияет на время освобождения из мирокапсул живчиков. При применении 0.07М раствора хлорида кальция наблюдалось 100% освободившихся из капсул живчиков уже через 6 часов инкубирования в плазме свиньи при 37С (Torre ML et al, 2000, 2002). Было установлено, что температура инкубирования влияет на время высвобождения живчиков из алгинат/Са2+/хитозановых микрокапсул. В среднем при 37С полное высвобождение (100%) живчиков из микрокапсул наблюдалось уже через 48 часов, тогда как при 18-20С только через 72 часа. Таким образом, изменяя температуру инкубирования микрокапсул можно продлить срок сохранения живчиков в капсулах. Следует отметить, что процесс микроинкапсулирования влияет на активность живчиков. При 18-22С и 35-37С в предложенной среде наблюдалось снижение активности спермиев почти в два раза, по сравнению с активностью неинкапсулированных живчиков, 70% и 35-40% соответственно. Похожие результаты описаны в работах (Torre M.L. et al, 2000) при микроинкапсулировании живчиков хряка в Са2+ -алгинатные капсулы и (Nebel R. et al, 1993) при микроинкапсулировании живчиков быка в алгинат-Са2+-поли-Ь-лизиновые капсулы. На основании этих данных, можно предположить, что это снижение после инкапсулирования связано с иммобилизацией живчиков в полупроницаемой мембране и с действием радикалов ПЭК мембраны.
Успех искусственного осеменения зависит от точного определения момента охоты и от своевременного осеменения коров необходимым количеством жизнеспособных живчиков. В результате животные нуждаются в частом осмотре и контроле. Учитывая, что способностью точно обнаружить охоту обладают не все зоотехники, многие коровы могут быть осеменены в неподходящее время. Искусственное осеменение в срок вместе с режимами синхронизации охоты может преодолеть некоторые из этих проблем, но процент оплодотворений часто не оправдывает ожиданий. Разработка системы, которая снизит труд и мастерство, необходимые для обнаружения охоты без ущерба для оплодотворяемости, вероятно повысит успех искусственного осеменения. Это возможно благодаря технологии инкапсулирования. Теоретически, она может повысить процент оплодотворений за счет искусственного осеменения в срок, поскольку семя будет медленно вытекать и жизнеспособные живчики будут доступны в нужное время для транспорта и оплодотворения.
