Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Проблема сохранения биоразнообразия 8
1.2. Краткая характеристика видов - объектов исследования (олень, суслик, лабораторная мышь) 11
1.3. Сезонные изменения сперматогенеза и криорезистентности спермы 15
1.4. Характеристика сперматозоидов из разных участков полового пути 22
1.5. Выживание сперматозоидов в половых органах после смерти животного и возможные сроки их использования для криоконсервации 28
1.6. Особенности эпидидимальной и эякулированной спермы и оценка значения различий при криоконсервации 33
1.7. Криоконсервация семени 37
Глава 2. Материалы и методы 46
Глава 3. Результаты исследования 55
3.1. Криоконсервация эпидидимального семени животных с непрерывным годовым сперматогенезом (мышь, Mus musculus)... 55
3.1.1. Влияние длительности хранения тушки мыши при + 4С на качество нативного и замороженно-оттаянного семени 55
3.1.2. Оптимизация методов криоконсервации семени позднего постмортального периода 68
3.2. Криоконсервация эпидидимального семени животных с фотозависимым годовым ритмом сперматогенеза (олени Cervus nippon и С. elaphus) 79
3.2.1. Качество и криорезистентность эпидидимального семени оленей после окончания гона 79
3.2.2. Качество сперматозоидов оленя в зависимости от продолжительности хранения семенников после отстрела 83
3.3. Криоконсервация эпидидимального семени животных с эндогенной регуляцией годовых циклов сперматогенеза (азиатский длиннохвостый суслик, Citellus undulatus) 86
3.3.1. Характеристика семени суслика в весенний сезон и его криоконсервация 86
3.3.2. Изменчивость криорезистентности эпидидимальных сперматозоидов суслика 96
3.4. Обсуждение результатов 99
Выводы 109
Практические предложения 110
Список использованной литературы 111
- Краткая характеристика видов - объектов исследования (олень, суслик, лабораторная мышь)
- Характеристика сперматозоидов из разных участков полового пути
- Криоконсервация эпидидимального семени животных с непрерывным годовым сперматогенезом (мышь, Mus musculus)...
- Качество и криорезистентность эпидидимального семени оленей после окончания гона
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Криоконсервация сперматозоидов, выделенных из половых органов павших животных, является важным источником генетического материала для криоколлекций, поддерживающих биоразнообразие, и последней возможностью сохранить генофонд ценных особей при их неожиданной гибели.
Еще в начале XX века русский ученый И.И. Иванов обратил внимание на тот факт, что в изолированном эпидидимисе сельскохозяйственных животных живые, активные сперматозоиды сохраняются не менее 5-7 дней (Иванов, 1889, 1907, цитируется по Иванов, 1970). Именно Иванов первый высказал мысль, что жизнеспособные сперматозоиды, выделенные из половых органов павших животных можно использовать для спасения наследственности ценных особей.
После открытия в 1947 г возможности сохранения оплодотворяющей способности семени животных при замораживании (Соколовская, 1947), болшое значение приобрело сохранения генофонда животных с помощью криоконсервации спермы.
Но только в 80-х и 90х годах появился ряд работ по криоконсервации эпидидимальнои спермы млекопитающих постмортального периода (Шайдулин, Ролдугин,1986; Сипко и др., 1993; Эрнст и др., 1998; Krzyvinski, 1981; Miles et al., 1992; Marks et al., 1994; Jewgenow et al., 1997; Ponce et al., 1998; Lambrechts et al., 1999; Blash et al, 2000; и др.). В этих работах семя использовались в течение 1-4 часов после смерти животных.
Однако в отличие от плановых отстрелов, при неожиданной гибели практически невозможно произвести выделение и обработку семени в столь сжатые сроки. В конце 90х — начале 2000 годов был опубликован ряд работ доказывающих сохранение оплодотворяющей способности эпидидимальных сперматозоидов в течение нескольких дней после гибели организма (Songsasen et al., 1998; Kikuchi et al., 1998; Kishikawa et al., 1999; Yu, Leibo,
2002).
Несмотря на вышеперечисленные материалы, в проблеме криоконсервации постмортального семени животных остается очень много неясного. До сих пор не определенадлительность функциональной активности эпидидимальных сперматозоидов после смерти животных и границы возможного использования этих клеток для криоконсервации. Для подавляющего большинства диких видов, имеющих ярко-выраженную сезонность размножения, не определены сезонные сроки, при которых возможно извлечение и криоконсервация постмортального семени. Кроме того, для криоконсервации постмортального эпидидимального семени в основном используют методы, разработанные для эякулята. Между тем, физиология эякулированных и эпидидимальных сперматозоидов имеет ряд отличий, которые могут сказаться на оптимизации методов криоконсервации.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить возможности криоконсервации эпидидимального семени млекопитающих с сезонным и непрерывным сперматогенезом в разные сроки постмортального периода на примере оленя, суслика и лабораторной мыши. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать физиологическое состояние жизнеспособных сперматозоидов в эпидидимисе в разные сроки после смерти животного.
Изучить устойчивость эпидидимальных сперматозоидов, выделенных в разные сроки после смерти, к процессу криоконсервации
Оптимизировать криопротектирующую среду для криоконсервации сперматозоидов позднего постмортального периода.
Сравнить жизнеспособность эпидидимального семени при хранении целых тушек или изолированных семенников.
Исследовать возможность криоконсервации эпидидимальной спермы вне периода гона для животных с ярко-выраженной сезонностью размножения.
Научная новизна. Впервые криоконсервировано эпидидимальное семя оленя вне периода гона (в охотничий сезон, до 4 месяцев после окончания гона). Показана возможность криоконсервации сперматозоидов до 6 суток после отстрела оленей.
Впервые получены жизнеспособные замороженно-оттаянные сперматозоиды азиатского длиннохвостого суслика, относящегося к зимоспящим млекопитающим.
Показана возможность криоконсервации эпидидимальных сперматозоидов мыши до 5 суток после смерти организма. Обнаружено, что в постмортальный период (до 5 суток) сперматозоиды мыши снижают поступательную подвижность, но при этом сохраняют целостность клеточных мембран.
Выявлено положительное воздействие антиоксидантов в составе криозащитных сред на сохранность клеточных мембран замороженно-оттаянных сперматозоидов мыши, выделенных и замороженных через сутки после смерти животного.
Научно-практическая ценность. Работа имеет как теоретическую, так и практическую значимость. Данные о сроках выживания и физиологических изменениях эпидидимальных сперматозоидов после смерти животных при холодовом (+4 С) хранении расширяют знания по физиологии эпидидимальных сперматозоидов, и могут внести вклад в понимание механизмов деградации клеток в условиях холодовой ишемии.
Результаты работы позволяют существенно увеличить интервал времени между гибелью животных и криоконсервацией постмортального семени без потери жизнеспособности сперматозоидов.
Показано, что период, при котором в половых органах обнаруживаются пригодные для криоконсервации сперматозоиды, превышает сезон гона, по крайней мере для двух представителей разных систематических групп млекопитающих с сезонным размножением (благородный олень, азиатский длиннохвостый суслик). Это существенно расширяет грашщыч использования эпидидимального семени постмортального периода для криоконсервации, и способствует увеличению роли данного метода в сохранении генетических ресурсов. » Результаты настоящего исследования могут быть использованы в работах по дальнейшему усовершенствованию методов криоконсервации эпидидимального семени млекопитающих для создания генетических низкотемпературных коллекций.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на ежегодных отчетах лаборатории криоконсервации генетических ресурсов ИБК в 1998 - 2005 гг; на научно-практической # конференции «Зоокультура и биологические ресурсы» 4-6 февраля 2004 г.
Москва; на Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов», Санкт-Петербург, 19-22 октября 2004 г.; на научно-практической конференции «Сохранение разнообразия животных и охотничье хозяйство России» 24-25 февраля 2005 г. Москва.
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на семинаре лаборатории криоконсервации генетических ** ресурсов Института биофизики клетки РАН (апрель, 2006) и на научной конференции отдела биологии воспроизводства и трансплантации эмбрионов с.-х. животных им. академика В.К. Милованова (апрель, 2006).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в т.ч. 2 в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих
Краткая характеристика видов - объектов исследования (олень, суслик, лабораторная мышь)
Сохранение разнообразия живых существ на Земле представляет собой одну из глобальных экологических проблем, решение которых жизненно важно для существования человечества (Вепринцев, Ротт, 1991; Карнаухов, 1994; Розанов, 1994; Gakhova, 1998; Holt, 2001).
Наша цивилизация каждый год теряет от 3 до 5 видов позвоночных. А многие из остающихся видов подвергаются существенному обеднению внутривидового генетического разнообразия. По беспозвоночным аналогичные данные привести труднее, но видимо обеднение генофонда беспозвоночных приближаются к потере 1 вида ежедневно (Вепринцев, Ротт, 1991, Гахова, 1994, Uteshev, Gakhova, 2005). Есть опасения, что при потере 20-30% видов животных и растений, геобиологический баланс резко изменится, что может привести к вымиранию одного из доминирующих на сегодня видов — человека. По крайней мере, темпы вымирания видов в последнее столетие на 2 порядка превышают скорость вымирания видов во время палеонтологических биосферных кризисов - пермского и мелового, в результате которых коренным образом поменялся облик Земли и характеристики земной биосферы (Розанов, 1994).
Стратегия сохранения живого на Земле включает три уровня, каждый из которых имеет как достоинства, так и недостатки:
1. Сохранение природных биоценозов наиболее естественно и не вызывает искусственного изменения генофонда видов, но для гарантированного сохранения существующего разнообразия необходимо заповедать и полностью исключить из хозяйственного использования более 30% территории Земли, что в настоящее время вряд ли возможно (Розанов, 1994).
2. Разведение животных «ex situ» (в зоопарках и питомниках) пользуется большой популярностью, но численность популяций в зоопарках, как правило, ограничена и не может сохранить полноценного внутривидового разнообразия. Кроме того, виды, содержащиеся несколько поколений в неволе, подвергаются постепенной доместикации.
3. Криобанки могут хранить практически неограниченный объем генетической информации неизменным в течение долгого времени. Однако, как показал опыт 90х годов, они становятся уязвимыми при экономической и политической нестабильности (Вепринцев, Ротт, 1984; Гахова, 1994).
Очевидно, наиболее рациональным и надежным является совместное использование всех перечисленных стратегий сохранения биоразнообразия. В этом случае, криоколлекции генетического материала будут играть как самостоятельную роль - в качестве страхового фонда генетического материала вида на случай его утраты в «живом» состоянии, так и дополняющую - в качестве вспомогательных коллекций семени, эмбрионов и т.д., использующихся для обогащения генофонда малочисленных популяций в питомниках и зоопарках и для реинтродукции в естественные биоценозы.
Не менее важным элементом биоразнообразия является генофонд одомашненных животных. В частности, в последние десятилетия стала актуальной проблема сохранения генофонда лабораторных животных.
Современные медицинские, генетические и биологические исследования невозможны без использования специализированных животных-моделей (Конюхов, 1991). В качестве таких моделей выступают аутбредные и инбредные линии (в т.ч. конгенные и трансгенные) и мутантные стоки лабораторных животных. В настоящее время число животных-моделей превосходит 2500, но даже это количество признано недостаточным. Специализированные линии и мутантные стоки часто имеют пониженную жизнеспособность, что делает поддержание этих линий и мутаций сложным и дорогостоящим. По свидетельству Малашенко А. (Вепринцев и др., 1991), новые генетические мутации мышей, представляющие ценность, в Российских вивариях чаще всего не выживают и теряются. Такое положение делает весьма актуальным создание генетического криобанка лабораторных животных. Криобанк станет хранилищем резервного генетического фонда наиболее ценных линий, сублиний и стоков. Кроме того даст возможность сохранять редко используемые линии исключительно в криоконсервированном виде, что резко снизит затраты на поддержание необходимого для медико-генетических исследований набора животных-моделей.
Роль криоконсервации семени постмортального периода для сохранения биоразнообразия. Криоконсервация - это способ хранения биологических объектов с сохранением жизнеспособности при низких отрицательных температурах.
Криоконсервация гамет и зародышевых клеток позволяет хранить генетическую информацию практически неограниченное время в неизменном виде, использовать и транспортировать наследственный материал на дальние расстояния (Милованов, 1962; Наук и др., 1991).
В последние годы криоконсервацию репродуктивных клеток все шире используются для сохранения биоразнообразия диких животных (Вепринцев, Ротт, 1984; Розанов, 1994; Gakhova, 1998; Holt, 2001). Создание криобанков редких и исчезающих видов признано одним из трех основных способов сохранения биоразнообразия, наряду с выделением охраняемых территорий и разведением животных в неволе (Wood et al., 2001).
Биологические особенности сперматозоидов делают их особенно подходящим материалом для сохранения (Милованов и др., 1962). Плотность упаковки белков и нуклеиновых кислот, малое содержание воды способствуют большей устойчивости сперматозоидов к неблагоприятным воздействиям по сравнению с другими клетками организма (Соколовская, 1947; Наук, 1991). В настоящее время криоконсервация спермы широко применяется в сельском хозяйстве и медицине. Активно развиваются методы замораживания спермы диких животных. В конце 80-х годов список млекопитающих, для которых осуществлена успешная криоконсервация семени, оценивался более чем в сотню видов (Наук и др., 1991; Graham et al., 1987).
Характеристика сперматозоидов из разных участков полового пути
У млекопитающих выделяют три популяции сперматозоидов: тестикулярные, эпидидимальные и эякулированные. Морфологически эти группы отличаются незначительно, но существенно отличаются по физиологическим свойствам.
Тестикулярные сперматозоиды. Сформировавшиеся в семенниках сперматозоиды неподвижны. При искусственном осеменении и осеменении «in vitro» тестикулятные сперматозоиды не способны оплодотворить яйцеклетку. Однако возможно добиться повышения оплодотворяющей способности тестикулярных сперматозоидов обработкой некоторыми биологически активными веществами, стимулирующими созревание. Например, Bracket с соавторами (1978) получил 11% оплодотворенных яйцеклеток кролика при оплодотворении in vitro тестикулярними сперматозоидами, предварительно обработанными кофеином.
Инъекция тестикулярного сперматозоида непосредственно в цитоплазму яйцеклетки позволяет произвести оплодотворение с высокой результативностью и получить нормальные зародыши (Wurfel, 1996). Более того, такой метод оплодотворения позволяет получить полноценные эмбрионы не только при использовании тестикулярных сперматозоидов, но и при инъекции в яйцеклетку их предшественников - сперматид (Horabayashi et al., 2002; Kupker et al., 2002).
Интересно, что есть сообщения об отсутствии существенной разницы в результативности оплодотворения методом внутрицитоплазматической инъекции тестикулярными, эпидидимальными и эякулированными сперматозоидами (Check et al, 1999; Kupker et al., 2002; Van Steirteghem, et. al., 1998). В целом это свидетельствует, что ядра тестикулярных сперматозоидов уже способны к акту слияния с ядром яйцеклетки, а отсутствие способности к оплодотворению прочими методами связанно с недостаточной зрелостью двигательной системы и акросомного аппарата.
Эпидидимальные сперматозоиды. Из семенника сперматозоиды млекопитающих поступают в придаток семенника - эпидидимис. Эпидидимис состоит из Зх частей: головки, тела и хвоста, через которые последовательно проходят сперматозоиды при созревании. Именно в процессе прохождения эпидидимиса сперматозоиды приобретают способность к поступательному движению и оплодотворяющую способность. Сперматозоиды из головки эпидидимиса имеют ограниченную потенцию к подвижности. Активирующие среды вызывают только колебательное или реже манежное движение. Сперматозоиды из хвоста эпидидимиса при помещении в активирующие среды демонстрируют активное поступательное движение.
Несмотря на то, что семя из головки эпидидимиса считается незрелым, оно уже способно к оплодотворению яйцеклеток при помещении в половые пути самки, хотя и с невысокой эффективностью (см. табл. 1).
По мере прохождения эпидидимиса оплодотворяющая способность сперматозоидов повышается, и становится тем выше, чем удаленнее от семенника участок семявыводящего канала (Габер и др., 1983). Считается, что сперматозоиды из наиболее дистального участка тела и из хвоста эпидидимиса уже функционально полноценны (Abou-Haila, Daulat, 2000). В то же время нужно помнить, что любые данные об оплодотворяющей способности эпидидимальных сперматозоидов носят условный характер. Сперматозоиды в придатке неподвижны, и в этом состоянии не могут оплодотворять яйцеклетку. Подвижность сперматозоиды приобретают под воздействием секрета придаточных желез при эякуляции или разбавителей при искусственном выделении. Разбавитель не только влияет на подвижность сперматозоидов, но и может модифицировать оплодотворяющую способность сперматозоидов. Таблица 2 иллюстрирует влияние среды на оплодотворяющую способность сперматозоидов.
Эякулированные сперматозоиды. При эякуляции секрет придатка семенника, содержащий сперматозоиды, смешивается с секретом придаточных половых желез. Под их воздействием в сперматозоидах происходит ряд физиологический изменений. Эякулированные сперматозоиды характеризуются активным движением, и соответствующим ему активным метаболизмом. Оплодотворяющая способность эякулированных сперматозоидов оптимальна. Но при длительном хранении эякулята, оплодотворяющая способность может снижается как за счет энергетического истощения активных сперматозоидов, так и за счет явления «сверхконденсации» хроматина, происходящего под действием факторов семенной плазмы (Габер и др., 1983; Gonzales, 2001)
Источник сперматозоидов при посмертном выделении семени При постмортальной криоконсервации семени, как правило, используют эпидидимальные сперматозоиды, выделяя их из хвоста эпидидимиса {cauda epididimis), иногда дополнительно используют и сперматозоиды, содержащиеся в семяпроводах {ductus deferens). Это наиболее целесообразно, т.к. хвост эпидидимиса служит депо готовых к эякуляции сперматозоидов и содержит не только наиболее функционально зрелые сперматозоиды, но и превосходит другие отделы эпидидимиса по их количеству. В норме около УА эпидидимальных сперматозоидов сосредоточено в хвостовом отделе (Милованов, 62).
Как показано выше, при помощи сперматозоидов из семенников и проксимальных отделов эпидидимиса, так же имеется возможность восстановить генофонд погибших особей. Поэтому, в случае гибели особо ценных особей, возможно, не стоит ограничиваться сохранением семени из хвоста эпидидимиса. Тем более что сперматозоиды из головки эпидидимиса менее чувствительны к холодовому шоку по сравнению со сперматозоидами из хвоста эпидидимиса (White, 1993) и, видимо, должны легче переносить процесс криоконсервации.
Криоконсервация эпидидимального семени животных с непрерывным годовым сперматогенезом (мышь, Mus musculus)...
Нами было предпринято исследование выживаемости и физиологических изменений сперматозоидов после смерти организма с использованием лабораторных мышей.
Исследованы физиологические характеристики нативных и замороженно-оттаянных образцов эпидидимального семени, полученного сразу после забоя животных и через 3.5 — 120 часов хранения тушек мышей при +4С.
Были исследованы физиологические характеристики сперматозоидов: - Подвижность позволяла судить о функциональном состоянии двигательной системы. - Тест на проницаемость клеточной мембраны позволял оценить целостность и физиологическое состояние клеточной мембраны. - Переживаемость сперматозоидов в культуре при 37С, которая зависит от функционирования ряда систем клетки, но в большей степени определяется состоянием энергетической и дыхательной системы сперматозоида. Для замороженно-оттаяных образцов мы также определяли стадию капацитации и состояние акросом, которые важны для оплодотворяющей способности сперматозоидов. Влияние охлаждения тушек на физиологические характеристики нативных и замороженно-оттаянных эпидидимальных сперматозоидов.
Мы хранили тушки забитых животных при температуре +4С с целью замедления негативных изменений в клетках и развития чужеродных микроорганизмов. Но сам факт охлаждения также оказывало воздействие на сперматозоиды. Мы проследили, как влияет охлаждение тушек на состояние эпидидимального семени.
Было проведено сравнение физиологических характеристик нативных и замороженно-оттаянных образцов, выделенных сразу после забоя животного (Контроль) и через 3,5 часа хранения при +4С (3.5 часа - период, в течение которого тушка остывает до температуры +4,2 - +4.3С).
Результаты представлены на диаграммах рис. 5 и 6.
При анализе подвижности (ППД и ОП), переживаемости и целостности клеточных мембран сперматозоидов по методу мечения этидий бромидом (ЭБ), выделенных сразу после забоя и из охлажденных в холодильнике тушек (3,5 часа), не обнаружено достоверной разницы ни по одному из перечисленных показателей (рис. 5).
Предварительное охлаждение тушки мыши перед извлечением и криоконсервацией сперматозоидов не вызвало заметного изменения качества замороженно-оттаянной спермы (рис. 6). Единственный показатель, на который повлияло охлаждение тушек -количество капацитировавших сперматозоидов в замороженно-оттаяных образцах (снижено с 11±3% до 3±1%).
Влияние длительного хранения тушек на физиологические показатели эпидидимальной спермы. При хранении тушки мыши при о +4 С, содержащиеся в придатке семенника сперматозоиды сохраняли жизнеспособность в течение всего периода эксперимента (5 суток). Физиологические характеристики эпидидимальной спермы в течение этого времени изменялись.
Степень влияния длительного постмортального хранения тушек на разные физиологические показатели представлена в таблице 3 и в приложении 1.
Сильнее всего длительное хранение тушек отразилось на способности сперматозоидов к прямолинейному поступательному движению (коэфицент коррелляции количества сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением с длительностью хранения тушки -0,54±0,18).
Качество и криорезистентность эпидидимального семени оленей после окончания гона
Для того чтобы выяснить, насколько пригодно для криоконсервации семя оленей, полученное в зимний период, было исследовано эпидидимальное семя рогачей, отстреленных в течение зимнего охотничьего сезона.
Сбор материалов проводился в Приокско-Террасном заповеднике (Московская обл.) при плановом отстреле избыточного поголовья, в течение декабря - февраля. Для исследований использовались 2 вида оленей с близкой физиологией - благородный (С. elaphus) и пятнистый (С. nippon).
В течение охотничьего сезона нам удалось получить семенники от 7 особей. Данные приведены в таблице 8.
Из таблицы можно видеть, что у большинства самцов в суспензии эпидидимиса обнаружены живые и подвижные сперматозоиды, хотя отстрел был произведен спустя 40-100 суток после окончания гона. Только у одного животного сперматозоиды в семенниках и эпидидимисах отсутствовали. Возможно, это связано с возрастом, именно у данной особи был зафиксирован самый старший возраст среди всех обследованных - 7 лет.
Низкое качество эпидидимального семени (количество вышедших в суспензию сперматозоидов было менее 1 млн/мл) было отмечено для оленя № 7, добытого позднее других - в конце первой декады февраля. Однако более вероятно, что низкие показатели количества сперматозоидов также связаны с возрастом (возраст особи оценен в 2 года). В таблице 9 представлена коррелятивная связь качества семени и длительности времени, прошедшего после окончания гона. На рис. 18 можно видеть, как изменяются показатели в течение зимы.
В течение трех зимних месяцев не было зафиксировано достоверного изменения качества эпидидимального семени. Однако наблюдалась некоторая тенденция к понижению подвижности семени и к снижению общего количества выделенных сперматозоидов к концу сезона, корреляция между временем, прошедщим после окончения случного сезона и подвижностью составила -0,33 ± 0.47 для ГШД и -0,19 ±0.48 для ОП (табл. 9 и рис. 18).
Мы оценивали криорезистентность сперматозоидов по отношению подвижности сперматозоидов до и после криоконсервации. Достоверного изменения криорезистентности семени в течение зимы не наблюдалось. Даже была некоторая тенденция к повышению криорезистентности: связь отношения подвижности сперматозоидов до и после криоконсервации и времени, прошедшего после окончания гона, составила R=0,38 ± 0.46 для ГШД и R=0,39 ± 0.46 для ОП.
Отмечено недостоверное снижение количества заморожено-оттаянных сперматозоидов с неповрежденными акросомами в конце зимы, R= -0,42 ± 0.45 (рис 18).
В результате, можно признать, что эпидидимальная сперма рогачей оленя вполне пригодна для криоконсервации в течение всего зимнего периода. В целом, включая период гона, получение пригодных для криоколлекций образцов семени рогачей возможно не менее 6 месяцев в году, с сентября по февраль.
Зависимость качества сперматозоидов оленя от продолжительности хранения семенников после отстрела представлена в табл. 10 и на рис. 19.
Все образцы семени, независимо от сроков хранения половых органов, содержали сперматозоиды с активным движением, в том числе из придатка с максимальным сроком хранения после смерти животного - 6 суток.
Сперматозоиды, выделенные из эпидидимиса после 3-6 суток хранения, визуально не отличались от выделенных через сутки после отстрела.
Количество сперматозоидов с поступательным прямолинейным движением колебалось от 30 до 80%. Подвижность семени в образце, выделенном из эпидидимиса через 6 суток хранения, составила 35% сперматозоидов с ППД и 43% сперматозоидов с ОП.
Длительное хранение семенников наиболее существенно влияло на общую подвижность нативного семени (коэффицент корреляции - 0,48 ± 0.37, коэффицент регрессии - 3,30 ± 5,75% / сутки хранения).
Все выделенные образцы благополучно перенесли процесс криоконсервации, хотя в целом качество семени в замороженно-оттаянных образцах, обработанных через 3-6 суток после отстрела, было ниже по сравнению с образцами, обработанными через сутки (ППД 16,2±9% и 28±12% соответственно, сохранность акросом 75% и 45±8%.)
Влияние длительности хранения семенников на поступательную подвижность проявилось слабее (коэффицент корреляции - 0,29 ± 0.47, коэффицент регрессии - 3,33 ± 5,49% / сутки хранения).
