Введение к работе
Актуальность проблемы. Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота занимают одно из ведущих мест в общей заболеваемости сельскохозяйственных животных, уступая лишь желудочно-кишечным заболеваниям (Аликаев В.А., 1986; Абрамов С.С., 1989; Красочко П.А., 1997; Грибко С.М., 1998 и др.) и наносят огромный ущерб сельскохозяйственному производству, являясь одной из причин высоких затрат на лечение, снижения продуктивности, вынужденного убоя и падежа телят (Красочко П.А., 1997; Шахов А.Г. с соавт., 2000; Пахмутов В.М. с соавт., 2006 и др.).
Структурные изменения в органах дыхательной системы, сопровождающие развитие респираторной патологии, предваряются изменением интенсивности биохимических процессов, в частности, свободнорадикального окисления, представляющего собой универсальное неспецифическое звено развития патологии органов дыхания (Зенков Н.К. с соавт., 2001; Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2001; Wood L.G. et al., 2003).
При респираторных заболеваниях, сопровождающихся воспалением бронхов и паренхимы легких, изменяются биохимические свойства бронхоальвеолярной жидкости, которая содержит в своем составе, как нелетучие, так и более 200 испаряющихся веществ (Гельцер Б.И. с соавт., 2000; Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2002), определение которых используется в медицине для ранней диагностики и прогнозирования развития респираторных заболеваний, а также для слежения за динамикой их течения (Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2001; Mutlu G.M. et al., 2001).
Состав конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) отражает изменения, которые происходят в составе бронхоальвеолярной жидкости (Бестужева С.В., 1985; Яковлева О.А., 1990; Гельцер Б.И. с соавт., 2000; Mutlu G.M. et al., 2001; Hunt J., 2002). Поэтому большинство маркеров респираторных заболеваний, определяемых в бронхоальвеолярной жидкости, могут быть идентифицированы и в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ), исследование которого в настоящее время все шире используется в медицине для оценки функционального состояния дыхательной системы, диагностики респираторных заболеваний и оценки эффективности проводимого лечения (Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2006; Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2001).
Однако на сегодняшний день данных о биохимическом исследовании конденсата выдыхаемого воздуха у сельскохозяйственных животных крайне мало (Reinhold P. et al., 1999, 2000), а в отечественной ветеринарной медицине подобные исследования практически не проводились, отсутствуют и сведения о возможности использования КВВ для ранней диагностики респираторной патологии у продуктивных животных.
Это и определило общую направленность работы, выбор методологических подходов и экспериментальных моделей.
Цель и задачи исследований. Основной целью данного исследования являлось изучение биохимического состава конденсата выдыхаемого воздуха, определение биохимических показателей, пригодных для диагностики и раннего прогнозирования патологии респираторного тракта и разработка метода ранней диагностики бронхолегочной патологии у телят.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
– изучить показатели, характеризующие метаболический и оксидантно-антиоксидантный статус здоровых телят и телят, больных субклиническим трахеобронхитом;
– изучить влияние внутривенного введения раствора пероксида водорода на функциональное состояние респираторной системы, метаболический и оксидантно-антиоксидантный статус телят.
– разработать способ ранней диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят при субклиническом течении респираторных заболеваний;
– разработать устройство и способ получения конденсата выдыхаемого воздуха и изучить возрастную динамику биохимического состава КВВ у телят;
– изучить биохимические параметры КВВ телят, больных субклиническим трахеобронхитом;
– провести сравнительное изучение биохимических параметров конденсата выдыхаемого воздуха у здоровых и телят с клинически выраженной респираторной патологией;
– изучить показатели конденсата выдыхаемого воздуха и крови, характеризующие метаболический и оксидантно-антиоксидантный статус телят при субклиническом трахеобронхите;
– определить наиболее информативные биохимические показатели конденсата выдыхаемого воздуха, пригодные для ранней диагностики и прогнозирования респираторных заболеваний у телят.
Научная новизна. Впервые в отечественной ветеринарной медицине разработана методика получения конденсата выдыхаемого воздуха у телят и изучена возрастная динамика его биохимического состава. Показана взаимосвязь показателей пероксидного окисления липидов, антиоксидантной системы и системы оксида азота в крови и КВВ телят в норме и при патологии респираторной системы. Даны качественные и количественные характеристики ряда соединений, отражающих повреждение дыхательных путей, воспалительные изменения и нарушения тканевых биохимических процессов. Впервые проведено исследование конденсата выдыхаемого воздуха у телят при субклиническом трахеобронхите и определены наиболее информативные показатели КВВ для диагностики респираторной патологии. Разработан способ определения воспалительного процесса в органах дыхания у телят для выявления субклинического течения трахеобронхита, основанный на внутривенном применении раствора пероксида водорода. Новизна проведенных исследований подтверждена положительным решением о выдачи патента РФ на изобретение «Способ ранней диагностики трахеобронхита у телят» по заявке № 2008124214/13(029363) от 08.07.2009.
Практическая значимость. На основе анализа конденсата выдыхаемого воздуха определены и предложены критерии оценки состояния дыхательной системы и раннего прогнозирования возможности развития респираторных заболеваний у телят. Разработан способ, позволяющий диагностировать наличие воспалительного процесса в трахее и бронхах у телят на самых начальных стадиях, еще до клинического проявления трахеобронхита, что может быть использовано в ветеринарной практике для ранней диагностики и прогнозирования риска развития респираторной патологии у молодняка крупного рогатого скота.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Первом съезде ветеринарных фармакологов России (Воронеж, 2007), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2008); XII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2008); Международной научно-практической конференции «Образование, наука, практика: инновационный аспект» (Пенза, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ: 6 статей и 2 тезиса докладов, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 203 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Список использованной литературы содержит 445 источников, из них 144 отечественных и 301 иностранных. Иллюстративный материал включает 7 рисунков, 2 фотографии и 22 таблицы.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Состояние оксидантно-антиоксидантного статуса и системы оксида азота у телят при субклиническом трахеобронхите.
2. Использование внутривенного введения раствора пероксида водорода для выявления субклинического течения респираторных заболеваний у телят.
3. Биохимические параметры конденсата выдыхаемого воздуха и крови, характеризующие метаболический и оксидантно-антиоксидантный статус у здоровых телят и при субклиническом трахеобронхите.
4. Биохимические показатели конденсата выдыхаемого воздуха, наиболее информативные для ранней диагностики и прогнозирования респираторных заболеваний у телят.
Работа выполнена в отделе патобиохимии и патофизиологии Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельскохозакадемии в 2006-2009 гг. в соответствии с планом НИР по теме 08.04.01 «Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных» (№ гос. регистрации 15070.3666026906.06.8.001.2).
Исследования проведены совместно с сотрудниками отдела клинической биохимии А.И. Золотаревым, Г.Н. Близнецовой, Т.Г. Ермоловой, отдела физико-химических методов исследований В.И. Шушлебиным и Г.Г. Чусовой и отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии А.Г. Шаховым и Ю.Н. Бригадировым ГНУ ВНИВИПФиТ РАСХН, за что автор выражает им благодарность.
Таблица 1
Схемы основных опытов
Опыты проведены в производственных условиях животноводческого хозяйства ОАО «Воронежпищепродукт» Новоусманского района Воронежской области на 162 телятах (табл.1).
На протяжении всех опытов за телятами велось постоянное клиническое наблюдение: учитывалось состояние слизистой оболочки, мышечного тонуса, рефлекторной возбудимости, сосательного рефлекса, появление уверенной позы стояния, количество резцов, регистрировалась температура тела, частота сердечных сокращений и дыхательных движений.
Для выявления телят с субклиническим трахеобронхитом применяли пальпацию последнего трахеального кольца (Золотарев А.И. с соавт., 2008) и внутривенное введение 0,6% раствора пероксида водорода на 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 0,4 мл/кг массы тела. При этом регистрировали реакцию телят на введение 0,6% раствора пероксида водорода, определяли температуру тела, количество дыхательных движений, чувствительность гортани и трахеи, наличие или отсутствие одышки, носовых истечений, кашля, хрипов, чувствительности последнего трахеального кольца.
Для исследования использовали стабилизированную гепарином венозную кровь, полученную из яремной вены животных в одинаковые промежутки времени в утренние часы до кормления.
Конденсат выдыхаемого воздуха у животных получали по разработанной нами методике в утренние часы до кормления. Кровь и конденсат выдыхаемого воздуха транспортировали в сосудах с тающим льдом при температуре 0-4 С в течение одного часа после его взятия. При необходимости кровь, сыворотку крови и конденсат выдыхаемого воздуха замораживали и хранили при температуре –20С.
Содержание в сыворотке крови и конденсате выдыхаемого воздуха глюкозы, холестерина, креатинина, мочевины, кальция, неорганического фосфора, активность g-глутамилтрансферазы (g-ГТТ), аспартат- (АсАТ) и аланинтрансферазы (АлАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли на биохимическом анализаторе «Hitachi-902» (Япония), содержание в крови цинка, меди, марганца, железа – на атомно-адсорбционном спектрофотометре «Perkin Elmer» модель 703 (США). В ряде опытов активность g-ГТТ определяли с помощью наборов фирмы «Vital Diagnostic» (Россия).
Для оценки интенсивности процессов пероксидного окисления липидов, состояния системы антиоксидантной защиты и интенсивности синтеза оксида азота у телят в крови и КВВ определяли: содержание малонового диальдегида (мкМ/л), содержание диеновых конъюгатов (ДК) (Е232/Е220) и кетодиенов (Е278/Е220) (Камилов Ф.Х. с соавт.,1999), активность каталазы (мкМ Н2О2/лмин) и глутатионпероксидазы (мМ восстановленного глутатиона/лмин) с использованием в качестве субстрата пероксида водорода, восстановленного глутатиона (мкМ/л) (Бузлама В.С. с соавт., 1997), супероксиддисмутазы (усл.ед./мг Hb) (Сирота Т.В., 1999); содержание стабильных метаболитов оксида азота (мкМ/л) (Близнецова Г.Н. с соавт., 2002), S-нитрозотиолов (нМ/л) (Kubes P. et al., 1999; Moore K.P., Mani A.R., 2002), ферроксидазную активность церулоплазмина (мкМ бензохинона/лмин) (Антонов М. П. с соавт., 1985).
Индекс эндогенной интоксикации (ИЭИ) рассчитывали в усл. ед. по содержанию в сыворотке крови веществ низкой и средней молекулярной массы (Гребнева О.Л. с соавт., 2006). Сорбционную способность эритроцитов (%) определяли по степени поглощения красителя метиленового синего эритроцитарной массой (Тогайбаев А.А. с соавт., 1988).
Каждую пробу исследовали в 3-х аналитических повторностях. Обработку экспериментальных данных проводили методами математической статистики, принятыми в биологии и медицине, с использованием компьютерных прикладных статистических программ «Statistica 5.0» (Stat Soft Inc., 1998) и «Microsoft Excel» на РС IBM «Pentium IV». Достоверность различий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стъюдента. Статистически достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05 (Лакин Г.Ф., 1990; Гельман В.Я., 1999).
