Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из основных свойств живого является способность к движению, наиболее специализированной формой которого-является мышечное сокращение. Процесс мышечного сокращения обеспечивается за счет скольжения друг относительно друга двух типов нитей: толстых - миозиновых и тонких -актиновых, причем активную роль при таком скольжении играет миозиновая нить, формирующаяся в результате агрегации отдельных молекул миозина.
Молекула миозина состоит из двух тяжелых и четырех легких цепей. Тяжелые цепи образует стержневую часть молекулы ("хвост"), ответственную за образование биполярных миозиновых нитей, и две глобулярные головки , с которыми ассоциированы легкие цепи ("существенные" и "регуляторные" - по две легкие цепи на каждую головку) (Левицкий,1987). Головки являются наиболее важными в функциональном отношении частями миозина: на них расположены активные центры миозиновой АТФаэы и центры связывания актина. Между стержневой частью и головками миозина имеется гибкий шарнирный участок, благодаря которому головки могут перемешаться относительно оси толстой филаменты. При взаимодействии с АТФ и актином молекула миозина претерпевает ряд ответственных за генерацию силы конформациоіпшх изменений. До недавнего времени было принято, что такие «информационные изменения локализованы в шарнирном участі» (Perry,1979). Однако в последнее время появляются данные, заставляющие вносить аувэствеииыэ коррективы в гипотезу о молекулярном механизме мышечного сокращения (Toyoshlma et al.1987) и позволяющие сдавать вывод о том, что участки, ответственные за генерацию движения, находятся внутри головки миозина. В связи с этим особо актуальным представляется исследование структурной организация головки миозина и связанных с ней особенностей формирования и функционирования активных центров.
Накопившиеся к настоящему времени литературные данные звидетельствуют о том, что АТФаэный центр миозіша имеет слод-іую структуру и формируется за счет взаимодействия между собой этдельных доменов тяжелых цепей головки миозина. В структуре ИФагного центра разл;:чают участок связывания полифосфата и 'гидрофобный карман", ответственный за связывание основания
(Audemard et al.1988). Однако остается открытым вопрос о роли и.характере изменении структуры "гидрофобного кармана" АТФаз-ного центра на различных стадиях гидролиза АТФ миозином; до сих пор нет удовлетворительного объяснения механизма действия модифицирующих АТОазу веществ, ее субстратной специфичности и ряда других характеристик.
Другой вопрос, связанный с работой головки, относится к изучению . роли легких цепей миоєина в формировании структуры головки и в регуляции взаимодействия между миозином и актином. Регудяторные легкие цепи в некоторых типах мышц и немышечных клеток принимают непосредственное участие в регуляции взаимодействия миозина с актином. В гладких мышцах позвоночных такая регуляция осуществляется путем фасфоридирования регуляторних легких цепей специфическим ферментом - киназой легких цепей миозина. В поперечно-полосатых мышцах позвоночных Са2+-регуляция сокращения осуществляется иным путем - при помощи тропо-нин-тропомиозиновой системы, ассоциированной с актиновыми ниг тями. В то хе время известно, что аналогичные "регуляторные" легкие цепи миозина скелетных и сердечной мышц (ДТНВ-ЛЦ) также способны связывать Са2+ и фосфоридироваться, однако непосредственного участия в регуляции запуска сокращения мышц они не принимают.
Исходя из вышеизложенного, представляется актуальным получение ответа на вопросы о роли "регуляторних" легких цепей в функционировании миозина скелетных мышц, а именно: влияют ли ДТНБ-легкие цепи на конформацию его головки? Принимает ли они участие в регуляторних механизмах актин-миозйнового взаимодействия? *
Неясными до сих пор остаются и вопросы о том, какую роль играют "существенные" (щелочные) легкие цепи в формировании нативной структуры миозина вообще и функционировании его активных центров в частности.
На некоторые из перечисленных выше вопросов мы попытались ответить в настоящей рабо.те.
Дели и задачи исследования.Работа посвящена игучен'яв роли легких цепей миозина в стабилизации структуры и функционировании головки миозиновой молекулы из быстрых скелетных мышц кролика, а также изучению особенностей организации и функционирования АТСааного центра миозина.
- з -Основное внимание было уделено решению следующих задач:
наладить методы выделения миозина и его протеолитических фрагментов: препаратов тяжелого меромиозина, содержащих полностью фосфоршшрованные или полностью дефосфорилиро-ванные'ДТНБ-легкие цепи; препаратов субфрагмента-і миозина (изолированных головок миозина), содержащих различные наборы легких цепей; препаратов изолированных тяжелых цепей головки миозина;
провести сравнительные исследования АТОазной активности и температурной стабильности препаратов суСфрагмента-1 (С1) миозина, содержащих различные наборы легких цепей, и препаратов изолированных тяжелых цепей С1 миозина;
исследовать влияние связывания Са2+ и фосфорилирования ДТНВ-легких цепей на чувствительность препаратов миозина и тяжелого меромиозина (ТШ) к ограниченному трипсиноли-эу;
проЕестк сравнительное исследование температурной стабильности триптических фрагментов тяжелых цепей С1 миозина;
изучить влияние различных нуклеозидтри- и нукдеозидди-фосфатов (НТФ и НДФ) на температурную стабильность препаратов И миозина.
Научная новизна работы.В настоящей работе впервые показано, что фосфорилирование ДТНБ-легких цепей миозина и связывание ими Са2+ способны вызывать информационные изменения тяжелых цепей головки миозина при его взаимодействии с актином. Такие изменения затрагивают структуру фрагмента тяжелой цепи головки миозина с мол.массой 50кДа (50К), который принимает непосредственное участие в формировании актинсвяэывавдего и АТФаэного центров.
Впервые проведены сравнительные исследования влияния различных нуклеозидтри- и куклеозиддифосфатов на стабильность фрагмента БОК при воздействии на него повышенных температур. На основании полученных результатов сформулирована гипотеза о двух состояниях "гидрофобного кармана" АТФазного центра миозина, реаллзуюзщхся, по-видимому, на различных стадиях гидролиза АТФ миозином. На стадии образования "долгоживущего комплекса" И* АДФ *вн (миозин-АДФ-неорганический фосфат) взаимодействие осуществляется между полярными группами кольца аденина и комп-
- 4 -лементарными группами АТШазнего центра. На стадиях, предшествующих гидролизу ATCD и следующих ва стадией распада "долгожи-вущего комплекса", АГФазньш центр связывает нуклеотид за счет слабых гидрофобных взаимодействий.
Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание тонких механизмов,-лежащих в основе элементарного акта мышечного сокращения и,' следовательно, углубляют понимание физико-химических основ сократительной деятельности мышц в целом. Они могут быть использованы специалистами в области биохимии^ биофизики и молекулярной биологии, занимающимися проблемами биологической подвижности.
Результаты используются при чтении курса лекций "Биофизика мышечного сокращения и клеточной подвижности" на кафедре биофизики Киевского университета им.Тараса Шевченко.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на Б-ом Украинском биохимическом съезде (Киев,1987); 8-ом и 9-ом Всесоюзных симпозиумах "Биофизика и биохимия биологической подвижности (мышечное сокращение)" (Пущино,1987,Тбилиси,1990); 6-ой Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси,1989); XX Европейской конференции по мышечному сокращению.и клеточной подвижности (Великобритания, Оксфорд, 1991). По материалам диссертации опубликовано 20 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методик экспериментов, изложения полученных результатов и их обсуждения, 'Выводов. Работа изложена на 128 страницах, включая 25 рисунков, 1 таблицу и список цитируемой литературы из 204 наименований. МАТЕРИАЛЫ и метода исслвдовлнкя.
