Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние биохимической проблемы резистентности 13
1.1. Исследование механизмов резистентности к пиретроидам 13
1.1.1. Развитие резистентности к пиретроидным инсектицидам 18
1.1.2. Развитие резистентности у колорадского жука 21
1.1.3. Развитие резистентности у тараканов 27
1.1.4. Развитие резистентности у других членистоногих 33
1.2. Ферментативные механизмы резистентности 46
1.2.1. Оксидоредуктазы широкого спектра действия 46
1.2.2. Трансферазные механизмы резистентности 54
1.2.3. Гидролитические механизмы резистентности 58
Глава 2. Материалы и методы исследования 62
2.1. Материал для исследования 62
2.2. Приготовление экстрактов растворимых белков 63
2.3. Электрофоретические методы определения активности ферментов 64
2.3.1. Малатдегидрогеназа 64
2.3.2. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа 65
2.3.3. Сукцинатдегидрогеназа 65
2.3.4. Эстеразный комплекс ферментов 66
2.3.4.1. Спектрофотометрический метод измерения эстеразной активности 66
2.3.5. Щелочная фосфатаза 67
2.3.6. Активность кислых фосфатаз 67
2.4. Обработка полученных данных 68
2.4.1. Определение активности множественных форм ферментов, расчёт денситограмм 68
2.4.2. Определение и расчёт относительной электрофоретической подвижности белковых фракций 68
2.4.3. Статистическая обработка полученных данных 68
Глава 3. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана 70
3.1. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного - комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана 71
3.2. Сравнительное исследование активности эстеразного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана 78
3.3. Сравнительное исследование активности фосфатазного комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана 91
Глава 4. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов у трёх популяций колорадского жука 96
4.1. Сравнительное исследование активности дегидрогеназного комплекса ферментов общего гомогената у чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука 99
4.2. Сравнительное исследование активности эстеразного комплекса ферментов общего гомогената у чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука 101
4.3. Сравнительное исследование активности фосфатазного комплексаферментов общего гомогената у чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука 105
4.4. Сравнительный анализ активности ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана и колорадского жука 109
4.4.1. Сопоставление суммарной активности дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов у высокорезистентных к перметрину и резистентных к циперметрину популяций колорадского жука 110
4.4.2. Сравнительный анализ суммарной активности дегидрогеназ,эстераз и фосфатаз у чувтвительных и резистентных к перметринупопуляций рыжего таракана и колорадского жука 112
Заключение 115
Выводы 123
Литература 125
Приложение 146
- Исследование механизмов резистентности к пиретроидам
- Гидролитические механизмы резистентности
- Сравнительное исследование активности дегидрогеназного - комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана
- Сравнительное исследование активности эстеразного комплекса ферментов общего гомогената у чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука
Введение к работе
Актуальность темы.
Резистентность вредных организмов к инсектоакарицидам, фунгицидам и гербицидам является глобальной проблемой. В настоящее время борьба с резистентностью или предотвращение её возникновения включает химические, агротехнические, биологические и биотехнологические мероприятия. Резистентность динамический феномен, развивающийся в весьма различных пределах у разных видов и даже у одного и того же вида при различном давлении отбора (Рославцева, 2003). Интенсивное применение химических средств борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур привело к возникновению у них резистентности к пестицидам, что является причиной резкого снижения их эффективности в настоящее время. Отмечают, что более половины всех резистентных видов вредителей сельскохозяйственных культур сформировали устойчивые популяции к
* 2-м или более инсектицидам, принадлежащим к пяти основным их
группам (хлорорганические инсектициды, пиретроиды, карбаматы,
фосфорорганические, регуляторы роста насекомых гормональной и
антигормональной природы). Для того чтобы противостоять
катастрофической перспективе потери чувствительности основных
вредителей растений к пестицидам необходимо знать, каким образом
возникают механизмы резистентности. Основным стратегическим
методом в борьбе с резистентностью является ротация пестицидов,
^ имеющих различные механизмы действия, открытие новых классов
инсектицидов, а также разработка смесевых композиций (инсектицид -синергист) и внедрение их в практику сельского хозяйства наряду с уже используемыми препаратами.
Пиретроиды - синтетические аналоги природного пиретрина, занимают в настоящее время одно из первых мест по масштабам производства и применения химических средств защиты растений. Основной мишенью действия пиретроидов являются натриевые каналы мембран нервных клеток. Характер и скорость метаболизма зависит от структуры пиретроида, его пространственного строения и отличается у разных видов и популяций насекомых (Филиппович и др. 1988; Рославцева, 2003). Применение пиретроидов, как и других препаратов, как правило, приводит к формированию у насекомых резистентности к инсектицидам. Явление резистентности характеризуется комплексом отдельных физико-химических, физиологических и биохимических показателей.
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что
наибольший вклад в метаболизм инсектицидов и механизм
формирования устойчивых к ним популяций членистоногих вносят
монооксигеназы, эстеразы и глутатион-8-трансферазы (Баканова, 1993;
Рославцева, 1997, 2003). Деградация ксенобиотиков, осуществляемая, в
основном, тремя отмеченными путями - окислительно-
восстановительным, гидролитическим и трансфертным, играет важную роль на определенной стадии развития организмов, тесно взаимосвязана со структурными особенностями применяемых соединений и видом насекомых.
Универсальным способом обезвреживания токсинов и
ксенобиотиков в организме животных является их окислительное
разрушение микросомальными оксигеназами. Повышение
каталитической активности оксигеназ у резистентных членистоногих связывают с изменением соотношения отдельных множественных молекулярных форм цитохрома Р-450, индуцируемого генами-
регуляторами, или с увеличением общего количества содержания цитохрома Р-450 вследствие амплификации структурных генов, детерминирующих его синтез (Agosin, 1985; 1984; Rose, Walbant, 1986).
При сравнительном исследовании активности
монофенолмонооксигеназы (тирозиназы) у чувствительных и резистентных рас комнатных мух, селектируемых карбаматами и пиретроидами, показано участие этого фермента в развитии устойчивости и формировании у них видоизмененных покровов и сдвигов в содержании медиаторов в нервной системе (Животенко, 1989).
Более специализированный эстеразный комплекс ферментов может участвовать в метаболизме всех трех наиболее используемых в настоящее время классов инсектицидов - фосфорорганических соединений, карбаматов и пиретроидов (Еремина и др., 1992, 1996; Рославцева, 1997,2003). Молекулы этих соединений содержат сложноэфирные связи, которые могут быть гидролизованы эстеразами. Показано, что детоксикация пиретроидов с помощью эстераз носит видо- и тканеспецифичный характер.
Сравнительное исследование активности АТФазного комплекса ферментов у чувствительной и резистентных к ФОС, карбаматам и пиретроидам рас комнатных мух продемонстрировало существенную активацию Na+, К+ - АТФазы на фоне ингибирования других АТФаз, что позволило сделать заключение автору об универсальности влияния инсектицидов разных групп на ферменты АТФазного комплекса насекомых и, следовательно, о сходстве механизмов их действия, а также об участии отдельных АТФаз в формировании резистентсности у изученного тест-объекта (Козлова, 1991). Важнейшим механизмом регуляции ферментных систем в клетке, является существование у ферментов множественных форм, отличающихся по физико -химическим свойствам, что обеспечивает пластичность обменных
процессов, детерминирует адаптационные возможности
организма, популяций и вида в целом и, таким образом, представляет собой один из основополагающих принципов регуляции жизнедеятельности животных организмов. Детальное исследование роли кислых фосфатаз дегидрогеназного комплекса ферментов американского и рыжего таракана в выработке устойчивости к перметрину позволило сделать заключение о существовании в тканях этого вида насекомого молекулярных форм тестируемых ферментов, реагирующих на воздействие этого инсектицида (Кометиани, 1995; Сёмина, 2000). Установленный усиленный синтез определённых форм испытанных энзимов определяет степень устойчивости рыжего таракана к пиретроидам и тесно взаимосвязан с формированием ферментативных механизмов резистентности.
Исходя из изложенного, представляется возможным в качестве биохимического критерия оценки развития резистентности у насекомых к инсектицидам использовать показатель, как суммарной активности ферментов, так и активности их отдельных молекулярных форм. Цели и задачи исследования:
Основной целью нашего исследования явилось сравнительное изучение ферментативных механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам у двух видов насекомых с полным и неполным превращением (колорадский жук и рыжий таракан), равно как и выяснение роли эстераз, фосфатаз и дегидрогеназ в выработке устойчивости к перметрину и циперметрину.
Для достижения этой цели были поставлены следующие основные задачи:
1. Исследовать активность дегидрогеназного, фосфатазного и эстеразного комплекса ферментов в общем гомогенате, грудных мышцах
и жировом теле чувствительных и резистентных к перметрину популяций рыжего таракана.
Изучить в сравнительном аспекте активность дегидрогеназ, фосфатаз и эстераз у трёх популяций колорадского жука: чувствительных и устойчивых к перметрину и циперметрину, отличающихся биологическим показателем резистентности к испытанным инсектицидам.
Провести сравнительный анализа суммарной активности тестируемых ферментов, а также активности их молекулярных форм в общем гомогенате двух видов насекомых, представителей разных отрядов - колорадского жука (отряд Coleoptera) и рыжего таракана (отряд Blattodea), с целью выяснения роли малатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, эстеразного комплекса ферментов, щелочных и кислых фосфатаз в выработке устойчивости к пиретроидным инсектицидам.
Установить корреляционные отношения между исследованными биохимическими характеристиками различных популяций рыжего таракана и колорадского жука и биологическим показателем резистентности к пиретроидам, а также разработать предложения по применению ферментативных методов тестирования резистентности у представителей различных отрядов насекомых.
Научная новизна работы;
Впервые получены комплексные экспериментальные данные, демонстрирующие участие дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов в формировании ферментативных механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам у колорадского жука. Впервые проведён сравнительный анализ ферментативного механизма устойчивости к перметрину у двух представителей различных отрядов - Coleoptera -колорадского жука и
11 Blattodea - рыжего таракана. Показано, что имаго колорадского
жука более устойчивы к действию пиретроидов по сравнению с
тараканами. Обнаружено, что детоксикация перметрина с помощью
эстераз носит видо - и тканеспецифический характер. Анализ
отзывчивости отдельных эстераз к действию перметрина позволил
установить участие в формировании резистентности контрастных по
подвижности ацетилхолинэстераз и карбоксилэстераз.
Практическое значение работы:
Осуществлено детальное изучение ферментативных
механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам у
колорадского жука и рыжего таракана и проведено сопоставление
полученных биохимических показателей с биологическим уровнем
устойчивости у исследованных насекомых. Знание биохимических
механизмов резистентности необходимо учитывать при ротации
пестицидов, а также при подборе ингибиторов ферментов,
ответственных за её развитие. Исходя из различий в уровне суммарной
активности тестируемых ферментов, а также активности их
молекулярных форм у чувствительных и устойчивых популяций
насекомых и корреляции биохимических показателей с уровнем
резистентности, предложен энзиматический способ тестирования её
развития. Полученные данные вносят значительный вклад в развитие
концепции биохимических механизмов действия пиретроидных
инсектицидов и формирование к ним устойчивости у насекомых,
особенно колорадского жука и могут быть использованы в ВНИИ
защиты растений при скрининге инсектицидов. Результаты
исследований включены в лекционные курсы кафедры органической и
биологической химии, а также применяются при проведении
семинарских занятий, спецкурсов студентов биолого-химического
факультета МПГУ.
*
Апробация работы:
Материалы диссертации докладывались на межвузовской научно - практической конференции «Актуальные проблемы экологии и безопасности жизнедеятельности» (Москва 2003), а также были неоднократно представлены на научных конференциях МПГУ (Москва 2003,2004) и научных семинарах кафедры органической и биологической химии биолого-химического факультета МПГУ (Москва, 2003,2004). Публикации:
По материалам диссертации опубликовано 5 работ и 2 статьи находятся в печати. Структура и объём работы:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Главаї), освещающего степень изученности ферментативных механизмов резистентности к пиретроидам у насекомых; описания объектов и методов исследования (Глава 2);изложения и обсуждения полученных экспериментальных результатов (Главы 3-4); заключения; выводов и списка литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и включает таблицы, рисунки и схемы.
Исследование механизмов резистентности к пиретроидам
Резистентность вредных организмов и инсектоакарицидам, фунгицидам и гербицидам является глобальной проблемой. Свыше 500 видов членистоногих, 70 видов сорняков и 150 видов патогенов имеют в настоящее время резистентные к пестицидам популяции. Резистентность к пестицидам является одной из трёх наиболее важных проблем в сельском хозяйстве наряду с эрозией почв. Только в США потери от резистентности составляют от 400 млн. до 1.4 биллионов долларов ежегодно. В настоящее время борьба с резистентностью или предотвращение её возникновения включает химические, агротехнические, биологические и биотехнологические мероприятия (Рославцева, 2003). Резистентность - динамический феномен, развивающийся в весьма различных пределах у разных видов и даже у одного и того же вида при различном давлении отбора. Наиболее значительным отличием является появление мультирезистентности у нескольких важных переносчиков инфекционных заболеваний. После обнаружения резистентности к ДДТ у москитов Phlebotomus papatasi в штате Бихар, Индия, единственный вид среди важных переносчиков, о котором не поступало сведений о наличии устойчивости - это мухи цеце. Наличие технических и финансовых проблем, с которыми сталкиваются в некоторых программах борьбы с малярией, в основном обусловлены появлением или дальнейшим распространением резистентности к фосфорорганическим инсектицидам у различных видов комаров. Формирование устойчивости к фосфорорганическим инсектицидам у Aedes aegypti порождает целый ряд потенциальных проблем при осуществлении борьбы со вспышками вирусных инфекций. В этой связи перекрёстная резистентность к синтетическим пиретроидам у некоторых ДДТ - резистентных членистоногих, включая A. aegypti, некоторых рас Musca domestica и клещей указывает на необходимость осторожности при оценкие перспектив и создании новых групп химических соединений. Сходная ситуация наблюдается в отношении сельскохозяйственных вредителей. Итенсивное применение химических средств борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур привело к возникновению у них резистентности к пестицидам, что является причиной резкого снижения их эффективности в настоящее время.
Впервые устойчивость у насекомых к инсектицидам была зафиксирована в 1897г. в США к калифорнийской щитовки. Спустя 83 года список резистентных видов насекомых уже насчитывал 428 видов, принадлежащих к 83 семействам и 14 отрядам, что составляло 61% видов членистоногих важных для сельского хозяйства, медицины и ветеринарии. Наибольшее количество видов, резистентных к ФОС, выявлено у двукрылых (60 видов), чешуекрылых (131 видов), равнокрылых (28 видов), жесткокрылых (26 видов), а также у растительноядных и кровососущих клещей (42 вида) (Рославцева, 1997,2003).
Отмечают, что более половины всех резистентных видов вредителей сельскохозяйственных культур сформировали устойчивые популяции к 2-м или более инсектицидам, принадлежащим к 5-ти основным их группам (хлорорганические инсектициды, пиретроиды, карбаматы, фосфорорганические, регуляторы роста насекомых гормональной и антигормональной природы). Для того, чтобы противостоять катастрофической перспективе потери чувствительности основных вредителей растений к пестицидам неоходимо знать, каким образом возникают механизмы резистентности. Основным стратегическим методом в борьбе с резистентностью является ротация пестицидов, имеющих различные механизмы действия, а также открытие новых классов пестицидов и внедрения их в практику сельского хозяйства наряду с уже используемыми препаратами.
Пиретроиды и ДДТ (дихлордифенилхлорэтан), несмотря на различие химического строения, обладают сходным механизмом действия, вследствие этого при формировании резистентности к этим препаратам много общего. По механизму действия пиретроиды относят к ядам контактно-кишечного действия, токсичность пиретроидов для насекомых определяется не только их нейрофизиологическим действием, сродством к перечисленным мишеням, но и особенностями метаболизми в организме. Характер и скорость метаболизма зависит от структуры пиретроида, его пространственного строения и отличается у разных видов и популяций насекомых. Пиретроиды подразделяют на два типа (см. схему 1). К 1 типу относят пиретрины, биоаллетрин, тетраметрин, ресметрин, кедетрин, фенотрин, перметрин и др. Внешние симптомы отравления пиретроидами 1 типа - гиперактивность, тремор и нокдаун.
Гидролитические механизмы резистентности
Эстеразы насекомых способны участвовать в метаболизме всех трёх наиболее используемых в настоящее время классов инсектицидов - фосфорорганических соединений, карбаматов и пиретроидов (Ерёмина и др., 1992). Молекулы этих соединений содержат сложноэфирные связи, которые могут быть гидролизованы эстеразами. Детоксикация пиретроидов с помощью эстераз носит видо и тканеспецифичный характер. Распределение и свойства гидролизующих перметрин эстераз детально изучен в тканях совки Prodemia eridana. Наивысшие величины эстеразной активности в отношении к транс-перметрину были найдены в кутикуле, кишечнике, жировом теле, при этом в кутикуле и кишечнике сосредоточена к тому же и большая часть эстераз, гидролизующих цис-перметрин. Все ткани гидролизовали транс-перметрин с большей скоростью, чем цис-перметрин. Имеются также данные относительно других механизмов резистентности к ФОИ, а именно - усиление деградации ФОИ вследствие изменения активности эстераз. Проводились исследования на оранжерейной тле (Myzus persicae Sulz), зелёная форма которой была чувствительна к инсектицидам, а жёлтая - толерантна; было показано, что резистентность к ФОИ связана, главным образом, с увеличением к одной из множественных форм карбоксилэстеразы вследствие амплификации генного локуса (Сундуков, и др., 1988). На основании изучения ингибирования эстераз, гидролизующих перметрин у гусениц, было сделано заключение о спектре видов насекомых и тех субстратах, для которых трифенилметановые красители и 1-додецилимидазол могут быть использованы как ингибиторы метаболического разложения инсектицидов (Chang, Jordan, 1983). Участие эстераз в механизме резистентности к синтетическим пиретроидам изучалось колориметрически в гомогенатах гусениц. Фосфатазы относятся к ферментам класса гидролаз. Особенно распространены фосфатазы, действующие на сложные эфиры фосфорной кислоты и углеводов, например, глюкозо-1-фосфата. Действие фосфатаз проявляется в широком спектре рН от 3 до 9. Большинство из них обладают субстратной специфичностью. Особенно важны для регуляции жизнедеятельности протеинфосфатазы, обеспечивающие отщепление фосфата от фосфорилированных белков, вследствие чего изменяется биологическая, в частности, ферментативная активность (Егорова, 1993; Филиппович, 1999; Филиппович, Коничев,1987). В работе Сёминой Н.В. (Сёмина, 2000) было проведено исследование суммарной активности и активности отдельных форм ферментов комплекса кислых фосфатаз жирового тела и грудных мышц у сенситивных и резистентных рас рыжего таракана. Автором установлено, что резистентные и чувствительные особи таракана не отличаются по количеству и электрофоретической подвижности форм кислой фосфатазы, но суммарная активность фермента и активность множественных форм почти в два раза превышает таковые у резистентных популяций. Всестороннее исследование биологических мембран в последние годы, а также появление достаточно перспективной концепции о том, что мембраны принимают участие в адаптации организма, т.е. являются структурами, которые в первую очередь отвечают на изменение среды приспособительной реакцией, положило начало изучению роли различных мембранных структур в возникновении и поддержании резистентности насекомых к инсектицидам 2-го поколения. Из литературы известно, что различные ксенобиотики (ФОС, карбаматы, хлорорганические соединения и пиретроиды), воздействуя на организм насекомых в той или иной мере затрагивают деятельность ферментов АТФазного комплекса (Филиппович и др1988; Козлова, 1995). С целью выяснения возможной роли Na+, К+-, и др. - АТФаз в механизмах выработки устойчивости насекомых к инсектицидам был проведён сравнительный анализ активности перечисленных АТФаз у чувствительных и резистентных к различным инсектицидам (ФОС, карбаматы и пиретроиды) рас комнатных мух. Сравнительное исследование активности названных -АТФаз у чувствительны и резистентных к ФОС, карбаматам и пиретроидам рас комнатных мух, по данным автора свидетельствует о существенной активации Na+, К+-АТФазы на фоне ингибирования других АТФаз, что позволило сделать заключение об универсальности влияния инсектицидов разных групп на ферменты АТФазного комплекса насекомых и, следовательно, о сходстве механизмов их действия, а также об участии отдельных АТФаз в формировании резистентности у изученного тест-объекта (Козлова, 1995). В целом, суммируя полученные данные, следует отметить, что изученные ферменты кислофосфотазного и дегидрогеназного комплексов у имаго рыжего таракана принимают участие в устойчивости к пиретроидам. Поэтому, представляется возможным в качестве биохимического критерия оценки развития резистентности у насекомых к инсектицидам использовать показатель, как суммарной активности ферментов, так и активности их отдельных молекулярных форм. В принципе, такой подход к тестированию активности ферментов и их множественных форм в ответ на воздействие инсектицидов в процессе развития устойчивости к ним способен обеспечить более глубокое проникновение в сущность этого теоретически и практически важного явления. К числу, безусловно, перспективных, но недостаточно исследованных вопросов, исходя из анализа появления новых множественных форм некоторые ферментов у резистентных популяций насекомых, относится изучение роли ф последних в развитии резистентности и адаптации насекомых к различным факторам среды и, в том числе, антропогенного фактора (инсектицидам, гербицидам и т.д.).
Сравнительное исследование активности дегидрогеназного - комплекса ферментов у чувствительных и резистентных популяций рыжего таракана
Оксидоредуктазы ускоряют реакции окисления - восстановления в живых организмах. Характерной их особенностью является способность образовывать в живой клетке системы или цепи окислительно -восстановительных ферментов, осуществляющих многоступенчатый перенос протонов водорода или электронов от субстратов к конечным акцепторам. Являясь двухкомпонентными ферментами с ограниченным набором коферментов, дегидрогеназы способны ускорять большое число самых разнообразных окислительно восстановительных реакций и способствовать адаптации насекомых к изменению факторов окружающей среды: температуры, пищевым субстратам, ксенобиотикам, в том числе и инсектицидам. Имеются данные осуществовании корреляции между изменениями условий среды и активностью а-глицерофосфатдегидрогеназы и монофенолмонооксигеназы (тирозиназа) (Филиппович, Коничев, 1987). Изучена роль цитохром Р-450 в возрастании устойчивости насекомых к инсектицидам (Филиппович и др., 1988). Установлено, что менее устойчивые насекомые обычно имеют меньшее количество цитохрома Р-450 и монооксигеназная активность микросомальных фракции в этом случае снижена. Автор считает, что в микросомальной фракции насекомых содержится несколько различных форм цитохрома Р-450, отличающихся по каталитической активности. Таким образом, система цитохром Р-450, является необходимой составляющей большинства установленных механизмов резистентности насекомых к инсектицидам, приводя их к активации или детоксикации. Во многих случаях резистентность обусловлена частично увеличенным содержанием цитохрома Р-450 и связанной с ним повышенной МО активностью. При проведении сравнительного исследования цитохромов у чувствительных и резистентных линий М. domestica к пиретроидам показано, что активность монооксигеназной системы выше в 2 -2.5 раза по сравнению с чувствительными особями (Scott et al., 1990). У рас комнатных мух, селектируемых мекарбенилом (группа карбаматов), а также перметрином и тетраметрином (группа пиретроидов) установлена повышенная активность монофенолмонбоксигеназы (МФМО) по сравнению с чувствительной расой (Животенко, 1989). Сделан вывод, что изменение активности МФМО у резистентных к перечисленным группам инсектицидам рас комнатных мух связано с формированием у них видоизменённых покровов и сдвигом в содержании в организме медиаторов нервной системы. Кроме того, у резистентных насекомых, в эпикутикуле содержалось большее количество жирных кислот, что сказывалось на проницаемости их покровов для различных инсектицидов. Участие а-глицерофосфатдегидрогеназы, маладегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в формировании ферментативных механизмов резистентности к пиретроидным инсектицидам установлено у имаго рыжего таракана (Сёмина,2000). С целью выяснения возможной роли дегидрогеназ в выработке устойчивости к перметрину у рыжего таракана нами проведён сравнительный анализ активности малатдегидрогеназы (МДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (и Г-6-ФДГ) и сукцинатдегидрогеназ (СДГ).
В процессе окисления, одним из главных механизмов которого в клетке является цикл трикарбонатовых кислот (цикл Кребса), происходит разрушение органических молекул клеточного «топлива» и освобождение электронов водорода, передающихся по дыхательной цепи на молекулярный кислород. Подавляющееся большинство реакций цикла Кребса катализируется специфическими ферментами -дегидрогеназами. Вопрос о характере поведения этих ферментов цикла Кребса в митохондриях животных клеток очень важен, т.к. с их помощью осуществляется процесс тканевого дыхания, сопряжённый с окислительным фосфорилированием, в результате чего, запасается значительная часть энергии в форме АТФ, которой принадлежит ведущая роль в регуляции реакции биосинтеза.
Малатдегидрогеназа - один из ферментов цикла Кребса. Малатдегидрогеназа (L-малат: НАД+ " оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.37.относится к первичным дегидрогеназам - переносчикам водорода от окисляемого субстрата на другой субстрат, но не кислород (акцептом водорода является НАД+). НАД+-зависимая малатдегидрогеназа окисляет яблочную кислоту (малат) в щавелевоуксусную (оксалоацетат).
Наряду с этим цикл трикарбоновых кислот выполняет анаболические функции, т.к. он является продуцентом молекул -предшественников для биосинтеза аминокислот, углеводов и жирных кислот. Так, фермент малатдегидрогеназа, имея две изоформы: митохондриальную и цитозольную, участвует в реакциях глюконеогенеза. Этот синтез углеводов осуществляется из соединений неуглеводной природы (пирувата, лактата, некоторых аминокислот, промежуточных метаболитов цикла Кребса, глицерина). Установлено существование изоферментов МДГ и их гетерогенность в тканях различных животных и растений (Филиппович, Коничев 1987).
Сравнительное исследование активности эстеразного комплекса ферментов общего гомогената у чувствительных и резистентных особей имаго колорадского жука
Основные механизмы защиты насекомых от действия инсектицидов представляют собой ряд барьеров, начиная от мембран покровных тканей и заканчивая ферментативными системами, принимающими участие детоксикации этих ксенобиотиков. Не вызывает сомнение тот факт, что в зависимости от вида насекомых, состояние популяций, инсектицидного или антропогенного воздействия, механизм формирования резистентности может быть отличным.
Сопоставление суммарной активности дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов высокорезистентных к перметрину и резистентных к циперметрину популяций колорадского жука. Проведение сопоставительного анализа суммарной активности дегидрогеназного, эстеразного и фосфатазного комплекса ферментов у популяций колорадского жука, резко отличающихся по биологическому показателю резистентности, позволяет оценить вклад различных детоксицирующих систем в механизм резистентности. В ходе действительного анализа вклада исследованных ферментов в развитие резистентности у колорадского жука было показано, что уровень суммарной активности, за исключением эстеразного комплекса энзимов, значительно выше у высокорезистентных популяций. Из трёх изученных дегидрогеназ, наибольшие изменения под влиянием пиретроидных инсектицидов наблюдаются в активности сукцинатдегидрогеназы и глюкозо-6 фосфатдегидрогеназы. Несмотря на то, что под влиянием циперметрина суммарный эффект равен нулю, активность молекулярной формы с ОЭП 0.33 возрастает на 68% (см. табл. 4.4.). Оценка вклада щелочной и кислой фосфатазы в формирование устойчивости свидетельствует об их участии в развитии резистентности и разном уровне отзывчивости на пиретроидные инсектициды, принадлежащие к разным группам. Максимальные изменения в активности обоих названных ферментов наблюдается у высокомолекулярных форм фосфатаз (ОЭП 0.10 и 0.12). Не представляется возможности установить корреляцию в изменении суммарной активности эстераз с биологическим показателем резистентности у двух популяций колорадского жука, однако зафиксированное повышение почти в три раза активности одной из форм эстеразы с ОЭП 0.50 свидетельствует о её участии в детоксикации перметрина (см.табл.4.2.). Таким образом, полученные результаты подтверждают многообразие путей формирования резистентности у популяций колорадского жука. Спектр и сравнительная активность оксидоредуктаз общего гомогената исследованных методом - электрофореза в ПААГе показывает, что наряду с участием в энергетическом обмене, изученные МДГ, Г-6-ФДГ и СДГ обеспечивают деструкцию или катаболизм пиретроидных инсектицидов. Оценка участия гидролитических ферментов в биохимических механизмах резистентности свидетельствует о том, что помимо суммарной активности энзимов необходимо учитывать вклад отдельных множественных форм фосфатаз индивидуальных эстераз. Кроме того, : при проведении более эффективного тестирования резистентности и установления корреляции биохимических и биологических показателей необходимо учитывать вклад всех детоксицирующих систем, а не отдельных её показателей, и это в какой-то мере позволит решить проблему преодоления устойчивости насекомых к пиретроидным инсектицидам. Сравнительный анализ суммарной активности дегидрогеназ, эстераз и фосфатаз у чувствительных и резистентных к перметрину популяций рыжего таракана и колорадского жука.
Данная работа проведена с целью обнаружения видовых различий чувствительности, модельных ферментов у имаго рыжего таракана и колорадского жука к действию перметрина. Исследованные виды насекомых отличаются по многим параметрам: Во-первых, они относятся к разным отрядам колорадский жук -представитель отряда Coleoptera с полным превращением, а рыжий таракан относится к отряду Blattedea с неполным превращением. Для насекомых с полным превращением {Holometabola) характерны некоторые особенности в цикле постэмбрионального развития, а именно: разовые переходы (личинка - куколка - имаго), котрые сопровождаются быстрыми и закономерными морфологическими перестройками и полным изменением внешнего облика на каждой из фаз развития. У насекомых с неполным превращением {Hemimetabola) из-за отсутствия куколочьной фазы развития морфогенетические процессы проходят постепенно в течение личиночных возрастов, и это своеобразие отражается в динамике обмена веществ. Во-вторых, имаго рыжего таракана мы получали из инсектария Всесоюзного научно-исследовательского института дезинфекции и токсикологии, а особи колорадского жука были собраны сотрудниками этого института в природных условиях Можайского района Московской области.
В-третьих, биологический показатель резитентности СД50 резко различается: у популяций колорадского жука он равен 475, а у рыжего таракана - 10. Однако, несмотря на вышеизложенные отличия, мониторинг формирования устойчивости к перметрину у исследованных тест-объектов свидетельствует о наличии сложных и неоднозначных взаимоотношений между показателем резистентности и вкладом определённых ферментативных систем в её развитие.
