Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Общие аспекты патогенеза сахарного диабета 10
1.1.1. Особенности протекания биохимических процессов при аллоксановом диабете 11
1.2. Физиолого-биохимические особенности печени 11
1.3. Общая схема трансформации основных запасающих веществ в животном организме 14
1.4. Биохимические аспекты процессов, ведущих к интенсификации глюконеогенеза 22
1.4.1. Трансформация липидов в гликоген у высших животных 29
1.4.2. Ультраструктурные изменения клеток животных при патологических процессах 29
1.4.3. Роль глюконеогенетических ферментов и интермедиатов в эмбриогенезе и при экспериментальном диабете 32
1.5. Роль глиоксилатного цикла в трансформации жиров в углеводы у организмов разных таксонов 35
1.5.1. Глиоксилатный цикл - определяющий этап глюконеогенеза 35
1.5.2. Распространение глиоксилатного цикла 36
1.5.2.1. Функционирование глиоксилатного цикла у микроорганизмов...36
1.5.2.1.1. Экспрессия маркерных ферментов глиоксилатного цикла у патогенных микроорганизмов 38
1.5.2.2. Функционирование глиоксилатного цикла у растений и грибов
1.5.2.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных 43
1.5.3. Характеристика маркерных ферментов глиоксилатного цикла 47
1.5.3.1. Структура гена и белка изоцитратлиазы 48
1.5.3.2. Структура гена и белка малатсинтазы 49
1.5.4. Физико-химические характеристики изоцитратлиазы 50
1.5.5. Кинетические и регуляторные свойства изоцитратлиазы 52
1.5.6. Регуляция экспрессионной активности ключевых ферментов глиоксилатного цикла 55
1.5.7. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла 60
Экспериментальная часть
2.1. Цель и задачи 62
2.2. Объекты и методы исследования 63
2.2.1. Объекты исследования 63
2.2.2. Методы исследования 63
2.2.2.1. Создание модели аллоксанового диабета у крыс Rattus Rattus L...63
2.2.2.2. Выращивание эмбрионов птиц Gallus domesticus L 63
2.2.2.3. Получение экстрактов различных тканей 63
2.2.2.4. Дифференциальное центрифугирование 64
2.2.2.5. Определение активности ферментов 64
2.2.2.6. Определение концентрации метаболитов углеводного обмена 65
2.2.2.7. Определение количества белка 65
2.2.2.8. Выделение и очистка ферментов 67
2.2.2.9. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 67
2.2.2.10. Гель-фильтрация и ионообменная хроматография 68
2.2.2.11. Определение молекулярной массы фермента 68
2.2.2.12. Электрофоретические исследования белков 69
2.2.2.13. Определение массы субъединиц фермента 70
2.2.2.14. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов 70
2.2.2.15. Экстракция суммарной РНК 70
2.2.2.16. Проведение обратной транскрипции мРНК и полимсразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) 71
2.2.2.17. Определение количества РНК и ДНК 72
2.2.2.18. Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей
2.2.2.19. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 73
2.2.2.20. Статистическая обработка данных 73
2.3. Полученные результаты и их обсуждение 74
2.3.1. Разработка модели экспериментального диабета 74
2.3.2. Динамика содержания основных субстратов и метаболитов в печени крыс при экспериментальном диабете и в печени эмбрионов птиц 75
2.3.3. Динамика активности ферментов основных метаболических путей в печени крыс с экспериментальным диабетом и в печени эмбрионов птиц 77
2.3.3.1. Индукция ферментов глиоксилатного цикла у крыс при
экспериментальном диабете и у птиц в ходе онтогенеза 87
2.3.4. Изучение субклеточной локализации глиоксилатного цикла в
животных тканях 89
2.3.5. Очистка изоцитратлиазы из печени крыс с аллоксановым диабетом и изучение ее свойств 94
2.3.6. Очистка и изучение свойств изоцитратлиазы из печени эмбрионов птиц 104
2.3.7. Сравнение свойств ИЦЛ из печени крыс и эмбрионов птиц 113
2.4. Характеристика экспрессии ИЦЛ в печени эмбрионов птиц и в печени
крыс, страдающих аллоксановым диабетотм 115
2.4.1. Разработка праймеров для идентификации гена изоцитратлиазы в геномах животных различных таксономических групп 119
2.4.2. Проведение ПЦР для обнаружения гена ИЦЛ в геномах животных.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 126
ВЫВОДЫ 132
ЛИТЕРАТУРА 134
- Общая схема трансформации основных запасающих веществ в животном организме
- Экспрессия маркерных ферментов глиоксилатного цикла у патогенных микроорганизмов
- Динамика активности ферментов основных метаболических путей в печени крыс с экспериментальным диабетом и в печени эмбрионов птиц
- Очистка и изучение свойств изоцитратлиазы из печени эмбрионов птиц
Введение к работе
Актуальность проблемы. Возможность конверсии жиров в углеводы у млекопитающих и птиц всё ещё подвергается сомнению (Holmes, 1993; Jones, 1999). Считается, что окисление липидов может приводить к образованию кетоновых тел и их последующему вовлечению в энергетический обмен. Наличие ферментов Р - окисления жирных кислот в животных пероксисомах и феномен ресинтеза гликогена в печени крыс при глубоком голодании (Лебкова, 1984) позволяют предположить возможность индукции ферментов глиоксилатного цикла (ГЦ), способных конденсировать две молекулы ацетил-КоА, образующегося при р-окислении, в сукцинат, как это происходит в растительной и бактериальной клетках. Правильное решение данного вопроса важно для понимания механизма патологии и поиска способов профилактики и лечения многих заболеваний, в частности, обменного характера. Определение наличия глиоксилатного цикла в животных тканях имеет исключительно важное практическое значение. Современные исследования показали, что вирулентность патогенных бактерий и грибов, способных поддерживать хроническую инфекцию, определяется экспрессией ферментов ГЦ (McKinney et al., 2000; Lorenz et al., 2001).
В работах, проведённых на нашей кафедре, была показана индукция изоцитратлиазы (ИЦЛ, К.Ф. 4.1.3.1.) и малатсинтазы (МС, К.Ф. 4.1.3.2.) в печени голодающих крыс (Епринцев и др., 2002; Попов и др., 2000; Popov et al., 1998). До настоящего времени ни в одной систематической группе животных, исключая нематод, не идентифицированы гены белков, обладающих изоцитратлиазной и малатсинтазной активностями. Кроме того, не достаточно изучена динамика экспрессионной активности глиоксилатного цикла. Такой пробел значительно затрудняет окончательное доказательство присутствия данного метаболического пути в тканях животных и делает невозможным применение имеющихся знаний о ГЦ в области биомедицины.
Состояние вопроса, цели и задачи. Ферменты глиоксилатного цикла успешно изучались на растениях, микроорганизмах и низших животных. Тип круглые черви, или нематоды, является в настоящее время единственным таксоном животных, в тканях которых убедительно доказано функционирование ГЦ.
Khan и McFadden указывают на присутствие активностей МС и ИЦЛ в период эмбриогенеза нематоды Caenorhabditis elegans. В ранних эмбрионах количество желточных триглицеридов значительно превышают содержание
углеводов и белков. Установлено, что в ходе последующего развития рост
активностей ферментов ГЦ имеет линейную зависимость и коррелирует с ярко
выраженным уменьшением отношения триглицериды/углеводы. Другими
авторами ферменты ГЦ обнаружены в 15-дневной личинке Ascaris suum, в
которой ГЦ также участвует в ресинтезе гликогена из запасных триглицеридов.
Максимальная активность ИЦЛ и МС соответствует периоду наиболее
интенсивного понижения уровня гликогена в тканях. Активности ферментов
ГЦ и новообразующийся гликоген локализованы в задней части нематоды. В
это же время с помощью электронной микроскопии в этой же части тела
установлено наличие многочисленных липидных включений,
предшественников гликогена. Таким образом, ферменты глиоксилатного цикла обнаружены в некоторых Rabdithida: Turbatrix aceti, Caenorhabditis briggsae, Rhabditis anomala, Panagrellus redivivus, Caenorhabdibis elegans. В одной из работ указывается на присутствие ИЦЛ активности в некоторых видах морских моллюсков. Данные о ГЦ у членистоногих немногочисленны. Тем не менее, имеющиеся данные свидетельствуют о работе ГЦ на некоторых этапах онтогенеза этих животных. Так, ИЦЛ была очищена из развивающихся зародышей клеща Hyalomma dromedarii. Данные о распространении ферментов глиоксилатного цикла у насекомых отсутствуют. В 1980 году было установлено наличие в гомогенате мочевого пузыря жабы Bufo marinus активности малатсинтазы и изоцитратлиазы. Активности данных ферментов цитохимически и биохимически обнаруживались в печени цыплят при действии витамина D3. Кроме того, исследования бурого жира, взятого у медведей, находящихся в зимней спячке, показали, чтот эта ткань способна выполнять пероксисомалыюе цианид - нечувствительное окисление жирных кислот и обладает активностью ключевых ферментов ГЦ. Очень интересно отметить, что существуют данные об обнаружении активности маркерных фнрментоов ГЦ в печени человека. Работами последних лет доказано то, что ИЦЛ и МС активности - факторы устойчивости, способные поддерживать хроническую инфекцию Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans и многих других патогенов животных, человека и растений. Однако до сих пор нет единого мнения о возможности функционирования глиоксилатного цикла в тканях высших животных. В большинстве случаев не былы подробно изучены некоторые важные биохимические характеристики ферментов глиоксилатного цикла. Также не достаточно изучена динамика экспрессионной активности глиоксилатного цикла, тем более на молекулярном уровне.
Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии и регуляции изоцитратлиазы у животных организмов.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:
изучить изменение содержания главных субстратов и интермедиатов углеводного обмена в печени эмбрионов птиц G.domesticus и в печени крыс, больных аллоксановым диабетом;
выявить динамику активности ферментов основных метаболических путей у крыс с экспериментальным диабетом и у птиц в ходе эмбриогенеза;
исследовать индукцию изоцитратлиазной активности в печени эмбрионов птиц G.domesticus и в печени крыс, больных аллоксановым диабетом;
получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты ИЦЛ из птиц и печени крыс;
изучить физико-химические свойства и кинетические характеристики ИЦЛ из печени эмбрионов птиц G.domesticus и печени крыс, страдающих аллоксановым диабетом;
сравнить физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики изоцитратлиаз из гепатоцитов эмбрионов G.domesticus и печени крыс, больных аллоксановым диабетом;
оптимизировать метод выделения РНК из печени животных и на основе анализа гомологичных последовательностей разработать праймеры для идентификации гена ИЦЛ у исследуемых объектов;
провести ОТ-ПЦР анализ мРНК для идентификации уникальных последовательностей гена ИЦЛ у эмбрионов G.domesticus и в печени крыс, больных аллоксановым диабетом.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. Показана возможность индукции ключевых ферментов глиоксилатного цикла в печени эмбрионов птиц и в печени крыс, страдающих аллоксановым диабетом.
Установлено, что в процессе эмбриогенеза у птиц и у крыс при экспериментальном диабете наблюдается интенсификация цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), увеличение активности аминотрансфераз, индукция ферментов ГЦ, у крыс снижение активности гликолиза и пентозофосфатного пути (ПФП). Показано, что активация глюконеогенеза в этих условиях происходит как за счет мобилизации запасных жирных кислот, так и за счет глюкогенных аминокислот.
Получены гомогенные ферментные препараты ИЦЛ из печени эмбрионов Gallus domesticus и печени крыс с аллоксановым диабетом. Исследованы
каталитические свойства и регуляторные аспекты ферментов, определена их молекулярная масса и субъединичное строение.
На основе разработанных праймеров, впервые клонировали и идентифицировали участок гена ИЦЛ из печени эмбрионов птиц и пчени крыс с экспериментальным диабетом. Получили библиотеку комплементарных ДНК и продуктов гена ИЦЛ из организмов различных таксономических групп.
Полученные результаты и данные литературы (Епринцев и др., 2002; Попов и др., 2001, 2000) убедительно свидетельствуют о присутствии глиоксилатного цикла не только в клетках прокариот, растений и нематод и позволяют рассматривать данный метаболический путь как универсальный механизм конверсии жирных кислот в углеводы в животных организмах разного уровня организации.
Практическая значимость исследования. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о механизмах сопряжения анаболических и катаболических процессов в клетках насекомых и высших животных. Разработанная схема выделения высокоочищенных препаратов может быть использована для получения коммерческих препаратов фермента. Найденный метод стабилизации фермента позволяет сохранять его активность в течение длительного времени, что обеспечивает возможность применения препарата изоцитратлиазы для медицинской диагностики и в биохимических исследованиях, которые могут быть использованы в научно-исследовательских работах. Разработанные методы позволяют обосновать применение разгрузочно-диетической терапии (пищевой депривации) для профилактики и лечения болезней обмена веществ (ожирение, подагра, диабет). Подтверждение присутствия ГЦ в тканях высших животных открывает перспективу для разработки новых лекарственных препаратов против патогенных микроорганизмов животных и человека (McKinney et al., 2000; Lorenz et al., 2001).
Материалы диссертационной работы используются в ходе учебного процесса на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета, при чтении лекций по биохимии и молекулярной биологии, спецкурсов по энзимологии и генетической инженерии, кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 9— и 10— международной конференции молодых учёных
(Пущино, 2005, 2006), на XLIII международной конференции аспирантов (Новосибирск, 2005), на международной научной конференции «Современные проблемы адаптации» (Махачкала, 2006), на межрегиональной конференции молодых учёных (Нерюнгри, 2005), на межрегиональной конференции «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2004, 2005, 2006), на межрегиональной конференции «Физиология и психофизиология мотиваций» (Воронеж, 2005).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 10 публикациях - 4 статьях и 6 тезисах.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (204 источника). Иллюстрационный материал включает 24 рисунка, 16 таблиц.
Общая схема трансформации основных запасающих веществ в животном организме
В 1943 г. Дипп с сотрудниками обнаружили, что введение аллоксана крысам и кроликам сопровождается развитием у них диабета, который можно назвать островковым. Он является следствием некроза бета-клеток островков Лангерганса и способствует первичной инсулиновой недостаточности. Большим преимуществом такого "химического" диабета является сохранение внешней секреции поджелудочной железы и нормальная продукция ее активных начал.
Следует иметь в виду, что диабетогенная доза аллоксана близка к токсической (для крыс 400-500 мг/кг при подкожном введении). Его токсичность возрастает при недостаточно полном освобождении препарата от аллоксантина и других продуктов превращения. Одним из проявлений токсического действия аллоксана служит недостаточность почек и гиперазотемия до 174 мг %, а также гипохромная анемия.
Механизм его действия еще недостаточно установлен. Одной из наиболее интересных является концепция Назарова, который считает, что аллоксан вызывает избирательное повреждение проницаемости бета-клеток вследствие его реакции с дитиоловыми группировками и с ионами металлов. Структура клеточной мембраны изменяется; в ней образуются пространства, через которые клетки теряют калий, коферменты и ферменты в обмен на экстрацеллюлярный натрий. Данные трансформации нарушают обмен в бета-клетках, что приводит к их гибели.
Следует отметить, что в настоящее время аллоксан является одним их наиболее широко используемых диабетогенных соединений при формировании у объекта исследования экспериментального диабета.
Метаболическая активность печени обеспечивает источниками энергии мозг, мышцы и другие периферические органы. Вещества, всасываемые в кишечнике, попадают главным образом в печень, что позволяет ей регулировать концентрацию в крови многих метаболитов (Марри, 1993).
Паренхиматозные клетки печени служат главным местом биохимических превращений углеводов пищи и оказывают на их обмен регуляторное воздействие. Всасываясь, сахара попадают из клеток эпителия кишечника в кровеносные капилляры, впадающие в воротную вену; по ней моносахариды пищи поступают непосредственно в печень. Здесь сахара быстро поглощаются паренхиматозными клетками, где происходит превращение фруктозы и галактозы в глюкозу. Одной из важнейших функций печени в процессах обмена веществ является ее участие в поддержании постоянного уровня глюкозы в крови (глюкостатическая функция). Концентрация глюкозы в норме натощак составляет 80мг/100мл (4,4 мм). В течение дня концентрация глюкозы в крови в норме колеблется от 80мг/100мл перед едой до примерно 120мг/100мл после еды. Повышение концентрации глюкозы в крови, происходящее после приема богатой углеводами пищи, в свою очередь вызывает повышение содержания глюкозо-6-фосфата в печени, так как только в этих условиях каталитические участки глюкокиназы заполняются глюкозой. Дальнейшая судьба глюкозо-6-фосфата регулируется в основном противоположно направленным действием глюкагона и инсулина. Глюкагон запускает каскадный механизм регуляции, опосредуемый ц-АМФ, что приводит к расщеплению гликогена, тогда как инсулин, будучи антигонистом глюкагона, оказывает противоположное действие. Когда концентрация глюкозы высока, связывание глюкозы с фосфорилазой а делает ее чувствительной к действию фосфатазы, превращающей ее в фосфорилазу в. Фосфорилаза в не способна расщиплять гликоген. Это превращение приводит также к высвобождению фосфатазы, что позволяет ей активизировать гликоген-синтазу. Таким образом, глюкоза аллостерически переключает метаболизм гликогена с расщепления на синтез (Страйер, 1985).
Высокое содержание инсулина после еды способствует также проникновению глюкозы в мышцы и жировую ткань. Инсулин стимулирует синтез гликогена, как в мышцах, так и в печени. Содержание количества глюкозы в крови снижается через несколько часов, что, в свою очередь, вызывает уменьшение секреции инсулина и повышение секреции глюкагона. Описанные выше процессы протекают в обратном направлении. При уменьшении концентрации глюкозы в крови и мышцы, и печень используют в качестве источника энергии жирные кислоты.
Основными предшественниками глюкозы служат лактат и аланин, поступающие из мышц, глицерол - из жировой ткани и глюкогенные аминокислоты, поступающие с пищей.
Кроме того, печень играет главную роль в регуляции липидного метаболизма. Когда в организме имеется избыток источников энергии, жирные кислоты синтезируются в печени, этерифицируются и секретируются в кровь в виде липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП). Эти липопротеины плазмы - основной источник жирных кислот, используемых жировой тканью для синтеза триацилглицеролов. Следует отметить, что жирные кислоты с длинной цепью проходят через внутреннюю митохондриальную мембрану только в том случае, если они связаны эфирной связью с карнитином. Фермент, катализирующий образование ацилкарнитина на наружной поверхности этой мембраны, ингибируется малонил-КоА - промежуточным продуктом, определяющим дальнейшую последовательность реакций в синтезе жирных кислот. Таким образом, при синтезе жирных кислот с длинной цепью они не проникают в митохондриальный матрикс - компартмент, где происходит Р-окисление и образование кетоновых тел. Эти жирные кислоты включаются в триацилглицеролы и фосфолипиды.
Регуляция обмена белков печенью осуществляется благодаря интенсивному биосинтезу в ней белков и окислению аминокислот. За сутки в организме человека образуется около 80-100 г белка, из них половина в печени. В отличие от других органов и тканей печень значительную часть всего синтезируемого белка (преимущественно альбумина) поставляет для потребления другими органами. За сутки в печени образуется примерно 20 г альбуминов плазмы крови, большая часть а- и р-глобулинов крови. Кроме того, в ней образуются белки плазмы крови, участвующие в гемостазе (фибриноген, протромбин и другие белковые факторы свертывающей и антисвертывающей систем крови), холинэстераза, группа транспортных белков (ферритин, церуллоплазмин, транскортин и другие белки, участвующие в транспорте гормонов, витаминов) (Филиппович, 1999).
В печени наиболее активно протекает обмен аминокислот: синтез заменимых аминокислот, синтез азотистых небелковых соединений из аминокислот (креатина, глутатиона, никотиновой кислоты, пуринов и пиримидинов, порфиринов, дипептидов, коферментов пантотената и др.), окисление аминокислот с образованием аммиака. Следует отметить, что печеночные клетки в отличие от других клеток нашего тела располагают полным набором ферментов, участвующих в обмене аминокислот. Вследствие этого характерной особенностью печени является быстрота синтеза и распада белков (скорость обновления белков в печени выше, чем в любом другом органе, кроме поджелудочной железы). Так при голодании печень быстрее всех расходует резервные белки. Потери белка здесь составляют примерно 20%; в то время как в других органах не более 4%.
Экспрессия маркерных ферментов глиоксилатного цикла у патогенных микроорганизмов
Новый импульс исследования ГЦ получили после открытия его вклада в патогенез возбудителей инфекционных заболеваний. Совсем недавно было показано, что необходимым условием патогенности возбудителей некоторых заболеваний животных, человека и растений является функционирование ГЦ. Активация ГЦ в патогенных клетках даёт преимущество болезнетворным микроорганизмам при нахождении внутри фагоцитов (после фагоцитоза), обеспечивающих клеточный иммунитет.
Первым барьером на пути проникновения патогенных микроорганизмов в организм животных и человека являются неспецифические клеточные факторы иммунитета - макрофаги и нейтрофилы (Ройт, 2000). После распознавания чужеродной клетки происходит её поглощение фагоцитом с образованием фагосомы - внутриклеточного компартмента, содержащего микроорганизм. Смысл данного явления - в изоляции и уничтожении патогена. Для этого фагосома сливается с лизосомами, превращаясь в фаголизосому, содержащую бактерицидные вещества и среду с кислым рН (Lorenz et al., 2002).
Выживание патогена в агрессивной среде в фаголизосоме зависит от его способности синтезировать белки и другие компоненты клетки. Таким образом, фагоцитированный микроорганизм должен найти источник питательных веществ для биосинтеза макромолекул и производства энергии.
Обнаружено, что возбудитель туберкулёза Mycobacterium tuberculosis способен длительное время находиться внутри макрофага в латентной форме, а впоследствии при благоприятных условиях распространяться по всему организму (Lorenz et al., 2002). Грибной паразит млекопитающих Candida albicans также может сохранять жизнеспособность при фагоцитозе макрофагом (Lorenz et al., 2001). Но в отличие от М. tuberculosis его существование с фагоцитом не столь долгое. Уничтожив фагоцит, паразит также может распространяться по организму.
Неожиданностью было открытие, что, несмотря на разные пути развития внутри макрофага, общим для данных патогенов (а также множества других) является индукция в них ГЦ. С помощью двумерного электрофореза белков из фагоцитированных бактерий М. avium было обнаружено значительное увеличение содержания одного из белков, идентифицированным как ИЦЛ (Lorenz et al., 2002). Анализ кДНК данного микроорганизма привёл к идентификации 11 генов, активированных после фагоцитоза, одним из которых оказался ген ИЦЛ. Для доказательства экспрессии гена ИЦЛ в М. tuberculosis и M. avium была создана конструкция генов ИЦЛ и зелёного флюоресцирующего белка. Показано, что индукция гибридного белка была даже выше в макрофагах, активированных гамма интерфероном и липополисахаридами (Graham et al., 1999). Таким образом, несколько независимых подходов чётко указывают на индукцию ИЦЛ бактериями рода Mycobacterium как ключевой ответ на фагоцитоз.
Для определения метаболических путей, активируемых в ответ на фагоцитоз С. albicans (и родственным организмом, дрожжами Saccharomyces cerevisiae) был использован геномный подход. С помощью геномных микрочипов удалось показать повышенный уровень транскрипции генов ИЦЛ и МС. Содержание мРНК данных ферментов в фагоцитировааных S. cerevisiae было повышено в 22 раза. Кроме того, наблюдалась значительная активация транскрипции генов, продукты которых так или иначе, связаны с ГЦ и глюконеогенезом. Таковы, например, гены ацетилтрансфераз и белков-переносчиков метаболитов между клеточными органоидами, ацетил-КоА синтазы и ключевого фермента глюконеогенеза - фруктозо-1,6-бисфосфатазы. В итоге, были активированы 11 из 15 генов, кодирующих белки, прямо или косвенно связанные с работой ГЦ. Содержание транскриптов остальных генов (в том числе мРНК ферментов ЦТК) не было повышено по сравнению с контролем (Lorenz et al., 2001). Наиболее вероятным объяснением смысла индукции ГЦ в бактериях и грибах после их фагоцитоза представляется то, что данный метаболический путь активируется в ответ на недостаток питательных веществ внутри фаголизосомы (Lorenz et al., 2002).
Принимая во внимание функции ГЦ, можно предположить, что фагоцитированный микроорганизм обнаруживает простые источники углерода внутри фаголизосомы и активирует метаболические пути, необходимые для их использования. По аналогии с биологической ролью ГЦ в проростках семян масличных растений простые источники углерода (ацетил-КоА) могут быть получены в результате р-окисления жирных кислот макрофага. Важность ГЦ для развития инфекции был подтвержден рядом исследований. Не наблюдалось существенного различия между развитием мутантов М. tuberculosis по гену ИЦЛ (А/с/) и патогенов дикого типа в неактивированных макрофагах in vitro. Однако при попадании в активированные макрофаги микроорганизмы дикого типа имели значительное преимущество над А/с/ мутантами (McKinney et al., 2000). В модели туберкулёза мышей А/с/ мутантный штамм М. tuberculosis развивается с той же скоростью, что и штамм дикого типа во время ранней острой фазы заболевания. Однако А/с/ мутанты гораздо менее устойчивы на последующих этапах и полностью фагоцитируются макрофагами.
В последних публикациях сообщается о том, что ГЦ также необходим для вирулентности патогенов растений. Штамм бактерии Rhodococcus fascians (возбудитель галла некоторых растений), дефектный по гену МС, мог существовать в растительных тканях, однако не был способен вызывать заболевание (Idnurm et al., 2002). Аналогично мутантные по гену ИЦЛ штаммы фитопатогенного гриба Leptosphaeria maculans, поражающего капусту (Brassica парт), были авирулентны (Bowyer et al., 2000).
Данные, полученные при исследовании других фитопатогенных грибов, подтверждают предположение о важной роли ГЦ для развития инфекции. Гибрид промотора гена ИЦЛ Neurospora crassa с геном зелёного флюоресцирующего белка экспрессировался в Tapesia yallundae, паразите пшеницы (Scheideler et al., 2002). Экспрессия данной конструкции хорошо регулировалась in vitro и избирательно активировалась во время инфекции. Наоборот, анализ с помощью биочипов показал, что ГЦ индуцируется в ответ на инфекцию в тканях растения Arabidopsis thaliana (Murray et al., 1998). Предполагается, что смысл работы ГЦ в растении в ответ на инфекцию сводится к ускоренному использованию запасных липидов как косвенной защите от проникших в организм патогенов.
Открытие вклада ГЦ в развитие устойчивости патогенов сфокусировало внимание на важности центральных метаболических путей для развития болезней. Значительное снижение вирулентности Aid мутантов позволило предположить возможность использования ингибиторов ферментов ГЦ в качестве лекарств против устойчивых форм туберкулёза и кандидозов (Smith et al., 2003). Наиболее вероятными кандидатами в такие лекарства являются молекулы, связывающиеся с активным центром ферментов.
Динамика активности ферментов основных метаболических путей в печени крыс с экспериментальным диабетом и в печени эмбрионов птиц
У растений и микроорганизмов глюконеогенез из липидов обеспечивается функционированием пероксисомального или митохондриального р - окисления жирных кислот, глиоксилатного цикла, участка цикла Кребса, ФЕПКК и обращенного гликолиза. Исследование динамики количества интермедиатов и активности ферментов основных метаболических путей на разных этапах эмбриогенеза цыплят свидетельствуют об интенсификации глюконеогенетических процессов (табл. 3, 4). Регуляция активности ПК играет важную роль в поддержании уровня фосфоенолпирувата (ФЕП). Однако содержание ФЕП в печени контролируется и ферментами глюконеогенеза, в частности активностью ФЕПКК. Определения её активности показали её присутствие не только в печени зародыша птиц, но и в желтке. Вероятно, в зародыше существует два независимых фонда ФЕП, причём наличие ФЕПКК отражает не только образование и расход данного метаболита, но и отражают внутриклеточную активность всего глюконеогенетического процесса. Действительно, снижение активности ФЕПКК в печени зародыша на 9 сутки развития коррелирует со снижением количества ФЕП в этот же период. Характер уменьшения активности ФЕПКК полностью совпадает со снижением активности ПК и уменьшение количества ПВК, что позволяет говорить о реципроктной регуляции гликолиза и глюконегенеза. Работами Мильмана (1973) было показано, что своеобразие зародыша костистых рыб заключается в резком пространственном разграничении ПК и ФЕПКК между структурами желтка и зародыша. Опыты, проведённые с изолированными бластодермами, которые хорошо проницаемы для аминокислот, подтвердили отсутствие ресинтеза гликогена из этих соединений. В связи с этим постепенное увеличение активности АсАТа вплоть до вылупления цыплят обеспечивает рост и развитие зародыша. Следует отметить, что субстратами глюконеогенеза в зародыше могут служить только интермедиаты цикла Кребса и жирные кислоты. Использование неуглеводных предшественников, в частности, фосфотриоз (глицерин, а - глицерофосфат) в зародыше практически исключено, что связано с низкой активностью а-глицерофосфатдегидрогеназы (Мильман, 1973). Наиболее благоприятным условием глюконеогенеза является такое функциональное состояние ткани (например, печени), при котором увеличивается содержание свободных жирных кислот, ацетоацетата и ацетил-КоА, что и наблюдается в период эмбриогенеза птиц. Ранее, при изучении углеводного обмена у птиц при голодании (Garcia F. et al.,1987) было показано что, у цыплят пищевая депривация в течение 48 часов приводило к 10-кратному снижению гликогена в печени, накоплению ацетоацетата и 3-оксибутирата и снижению концентраций лактата и малата при этом гомеостаз глюкозы практически не изменялся. При этом наблюдали активацию лактатдегидрогеназы (ЛДГ), аконитатгидратазы (АГ) и малатдегидрогеназы (МДГ). При голодании у перепёлок изменений в содержании глюкозы в крови не обнаружено, но уменьшалось содержание триглицеридов (Didier et al., 1983). У мигрирующего скворца наблюдались суточные и сезонные вариации содержания гликогена и жира в печени (Pilio et al., 1983). На ранних стадиях развития субстратом дыхания является, в основном, гликоген. Главный расход липидов и белков на дыхание наступает сразу после окончания раннего периода развития зародыша, т.е. после завершения гаструляции. Интенсификация дыхательного метаболизма, о чём свидетельствует увеличение активности АГ и СДГ в печени зародышей цыплят и активация ФЕПКК предполагают наличие другого метаболического пути (отличного от ЦТК), способного направлять ацетил-КоА на глюконеогенетические процессы, т.е. глиоксилатного цикла. На 9 сутки эмбриогенеза в печени птиц была обнаружена активность маркерного фермента ГЦ - изоцитратлиазы, которая достигала максимального значения на 16 день эмбрионального развития и составила 2,29 Е/гр.с.м..
Сходная картина интенсификации глюконеогенетических процессов характерна и для печени крыс с экспериментальным диабетом. Пополнение запаса глюкозы достигается как ограничением ее утилизации, так и активацией процессов глюконеогенеза. Этому способствует снижение активности ключевых ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути (табл.5). Установлено, что активность пируваткиназы уменьшается на протяжении опыта. В контрольных организмах величина активности данного фермента составляла 52,9 Е, но уже через двое суток - 38,5 Е и снижалась до 18,6 Е через 5 суток. Аналогичная картина изменения активности наблюдалась для лактатдегидрогеназы. Резкое уменьшение активности этого фермента начиналось через 24 часа, и в конце опыта (через 5 суток) составляло 0,110 Е, что было меньше половины начальной активности альдолазы в гепатоцитах крыс.
В ходе проведения наших исследований в качестве маркерного фермента ОПФП использовали глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. Как видно из таблицы 6, активность Г-6-ФДГ была максимальной в печени и составляла 2,05 Е/гр. с. м. На 8 сутки после инъекции аллоксана наблюдалось уменьшение (снижение) активности исследуемого фермента в печени и почках более чем в 2 раза, что доказывает торможение ПФП. Кроме того, активность альдолазы, одного из ферментов гликолиза была максимальной в норме в сердце и почках и составила, соответственно, 3,97 и 4,17 Е/гр.см. В условиях диабета происходит уменьшение активности альдолазы в исследуемых органах, что также подтверждает сделанное ранее предположение.
Очистка и изучение свойств изоцитратлиазы из печени эмбрионов птиц
Для всех объектов исследования успешно проведена экстракция тотальной РНК с последующей обратной транскрипцией мРНК, а также успешно выделена геномная ДНК. После получения комплементарной ДНК (кДНК) и геномной ДНК были оптимизированы условия проведения полимеразнои цепной реакции. В данном процессе важную роль играют такие факторы, как число циклов, временные и температурные характеристики, концентрация амплимеров (праймеров), ионов магния, нуклеозидтрифосфатов, Гад-полимеразы. ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация кДНК 94С, отжиг праймерорв от 48-57С в зависимости от опыта и температуре элонгации ДНК 72С - оптимум для работы полимеразы. Однако самым важным условием успешной полимеразнои цепной реакции - этот температура отжига праймеров, которые обеспечивают специфичность ПЦР и являются необходимым условием работы ДНК- полимеразы, которая может реплицировать ДНК только при наличии двухцепочечного участка, при этом серия повторяющихся циклов приводит к экспоненциальному росту, накоплению определённого фрагмента ДНК, соответствующему искомому гену. Чувствительность ПЦР позволяет типировать минимальные количества ДНК, и в этом случае опасность загрязнения образцов чужеродной ДНК вызывает серьезные опасения, поэтому исследуемые образцы ДНК и РНК должны хранили отдельно от компонентов набора. Все работы по подготовке образцов для амплификации проводили в чистых условиях на протяжении всего времени во избежание контаминации. Все указанные условия амплификации для генов ИЦЛ и МС обеспечивают устойчивые воспроизводимые результаты на приборе МС-2 («Терцик», ДНК-Технология, Россия) и амплификаторе ДНК фирмы Biometra с использованием соответствующих тонкостенных пробирок. Также проводили отрицательный контроль: а) на загрязнение компонентов наборов чужеродной ДНК; б) на чистоту условий подготовки образцов для амплификации. Постановка отрицательного контроля осуществлялась в отдельной пробирке при каждом проведении амплификации путем добавления в реакционную смесь вместо исследуемого образца ДНК такого же объема воды. После завершения амплификации образцы сразу же анализировали методом электрофореза или хранили при -70С. В ходе ПЦР с пробами комплементарной ДНК (кДНК) кукурузы и бактерии E.coli (выращенной на среде с ацетатотм) получен продукт длиной около 360 п.н. (рис.22). Длина амплификона соответствует величине искомого участка мРНК фермента ИЦЛ из микроорганизмов и растений. Реамплификация ГЩР-продуктов, экстрагированных из агарозного геля, не приводила к уменьшению чёткости полосы, что свидетельствует о их гомогенности. Температура отжига праймеров для кДНК из куколок бабочки махаона составила 49С. Такая температура отжига оказалась оптимальной и для других объектов. ПЦР - анализ кДНК гепатоцитов крыс привёл к идентификации продуктов длиной около 400 п.н. (рис. 23), которая близка к величине 360 п.н. Таким образом, сконструированные пары праймеров образуют единую универсальную систему, которая эффективно выявляет гены ИЦЛ различных организмов. Однако для того чтобы сделать однозначный вывод о наличии гена ИЦЛ в геноме крыс необходимы дополнительные исследования. Повышение и понижение температуры отжига праймеров с 47 до 53 С, а также варьирование концентрации ионов Mg (кофактор ДНК-полимеразы) не приводило к существенному увеличению чёткости полосы ПЦР-продуктов на геле. Следует отметить, что топология филогенетического дерева, построенного на основании сравнения последовательностей ИЦЛ, имеет значительное расхождение с аналогичным деревом, основанным на сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей генов ИЦЛ. Это соответствует результатам, полученным и для других ферментов (Watson, 1997), и, наиболее вероятно, объясняется особенностями эволюции генов ИЦЛ. Однако не исключено, что при увеличении колическтва изученных последовательностей ИЦЛ топология соответствующего дерева может измениться. Возможным объяснением результатов ПЦР-анализа кДНК крыс может являться отсутствие достаточной для амплификации гомологии между праймерами и нуклеотидной последовательностью кДНК. В ходе эволюции последовательность нуклеотидов гена фермента ИЦЛ могла сильно измениться. В результате исследуемый ген у крыс может иметь низкую гомологию с аналогичным геном растений и микроорганизмов. Фактом, подтверждающим эту гипотезу, является наличие бифункционального фермента нематоды С. elegans, сочетающего каталитические активности ИЦЛ и МС (Liu, 1995). Учитывая, что эволюция гена ИЦЛ от микроорганизмов до нематод привела к подобной трансформации, то изменения гена у млекопитающих могли быть ещё более радикальными. Одним из предположений, объясняющим одновременное наличие каталитической активности ИЦЛ в тканях крысы и отсутствие в её геноме гомолога гена ИЦЛ растений, прокариот и нематод, является наличие белка, обладающего изоцитратлиазной активностью, но не имеющего гомологии с растительным ферментом на уровне первичной последовательности. И хотя примеры подобных белков существуют (Murzin, 1993; Manival, 2001), для проверки этой гипотезы необходимы дальнейшие исследования.
