Содержание к диссертации
Введение
І.Обзор литературы 7
1.1. Общее строение и функции цитохром 6с і-комплекса 9
1.2. Структура и функции цитохрома Ь 18
1.3. Структура и функции железносерного белка Риске 21
1.4. Структура и функции цитохрома С\ 26
1.5. Ингибиторы цитохром Ьс\-комплекса 28
1.6. Влияние ионов цинка на цитохром Ъс\ -комплекс 34
1.7. Возможные механизмы функционирования цитохром Ьс\ -комплекса 39
2. Материалы и методы исследований 51
2.1. Культивирование бактерий Rhodobacter capsulatus 51
2.2. Получение хроматофоров 52
2.3. Измерение концентрации бактериохлорофилла 52
2.4. Оборудование для импульсной спектрофотометрии 53
2.5. Среды и условия измерений 55
2.6. Измерение зависимостей от рН 56
2.7. Регистрация индуцированных вспышкой изменений рН внутри хроматофоров 56
2.8 Измерение температурной зависимости 57
2.9. Приготовление пробы для изучения влияния тяжёлой воды (D2O) на цитохром Ъс\- комплекс 57
2.10. Регистрация изменений A\j/ 58
2.11. Регистрация окислительно-восстановительных реакций в цитохроме Ь 59
2.12. Регистрация окислительно-восстановительных реакций в цитохромах С\ и с2 59
2.13. Расчет корректировочных коэффициентов 60
2.14. Измерение концентрации реакционных центров 61
2.15 Измерение концентрации ос|-комплекса 61
3. Результаты 62
3.1. Характеристика окислительно-восстановительных условий во время измерений 63
3.2. Индуцируемые вспышкой реакции в цитохром »С[-комплексе Rb.capsulatus 66
3.3. Ингабируещее действие ZniT 71
3.4. Зависимость редокс реакций гема bk и генерации Д\у цитохром Ьс\ -комплексом от концентрации Zn 79
3.5. Сравнение действия Zn на каталитический цикл цитохром Ъс\-комплекса в условиях насыщающей и слабой вспышек, соответственно 86
3.6. Каталитический цикл цитохром ос і-комплекса при различных значениях рН 88
3.7. Индуцируемые вспышкой изменения рН внутри хроматофоров Rb.capsulatus 95
3.8. Каталитический цикл цитохром 6сгкомплекса при разных значениях температуры 97
3.9. Влияние D2O на каталитический цикл цитохром feci-комплекса 106
4. Обсуждение 108
5. Выводы 123
6. Список цитированной литературы 125
- Общее строение и функции цитохром 6с і-комплекса
- Оборудование для импульсной спектрофотометрии
- Характеристика окислительно-восстановительных условий во время измерений
- Каталитический цикл цитохром ос і-комплекса при различных значениях рН
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Цитохром бсі-комплекс (убихинол: цитохром с оксидоредуктаза, ЕС 1.10.2.2.) является ключевым компонентом энергопреобразующих электрон-транспортных цепей. Этот фермент занимает центральное место в энергетическом обмене как митохондрий (где он ещё известен как комплекс Ш), так и большинства бактерий. Цитохром Ъс\-комплекс представляет собой димер, каждый мономер которого включает в себя один цитохром Ъ с двумя темами - высокопотенциальным гемом Ън (со среднегочечным окислительно-восстановительным потенциалом при рН 7,0 (Ещ7) равным 50 мВ), и низкопотенциальным гемом Ь/ (Ещ = -100 мВ), один [2Fe-2S] железносерный белок Риске (Ещ около 300 мВ), один цитохром С\ (Ещ около 300 мВ) и варьирующее количество субъединиц разной молекулярной массы, не содержащих просгетических групп. Цитохром Ьс)-комплекс окисляет молекулы убихинола и восстанавливает цитохром с (в фототрофных бактериях цитохром с), сопрягая эту редокс-реакцию с генерацией мембранного потенциала (т.е. трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода), использующегося для синтеза АТФ и транспорта метаболитов. В последнее время цитохром 6сі--комплекс привлекает к себе интерес ещё и как возможный регулятор образования активных форм кислорода. В цитохром бсі-комплексе различают два хинон-связывающих каталитических центра (сайта), расположенных по разные стороны мембраны. По современным представлениям убихинол окисляется у положительно заряженой р-сгороны мембраны в сайте Qo, образующемся на стыковочной поверхности белка Риске с цигохромом Ъ . Пути двух электронов, высвобождающихся во время этой реакции, расходятся. Первый электрон восстанавливает железосерный кластер белка Риске. Редокс-активный домен белка Риске (FeS домен) подвижен и поворачивается на 60 чтобы передать электрон цигохрому с, у которого электрон затем забирает мобильный цитохром с. Второй электрон поступает на гем bi откуда он переносится поперек мембраны сперва на тем Ъц, а затем в хинол-связывающий сайт Q, у противоположной, отрицательно заряженной и-стороны мембраны. Восстановление молекулы убихинона в сайте Qi приводит к образованию аниона семихинона Q. Окисление следующего убихинола в сайте Q„ дает убихинол QH2 в сайте Q,. Образование одной молекулы убихинола в сайте Q, в результате окисления двух молекул убихинола в сайте Q0 (т.н. Q-цикл П.Митчелла) повышает эффективность преобразования энергии, поскольку образование убихинола в сайте Q, связано с захватом двух протонов с «-стороны
мембраны, а окисление убихинола в сайте Q0 сопровождается выбросом двух протонов с р-сгороны мембраны. Механизм электрон-протонного сопряжения и природа электрогенных стадий в цитохром Ьсу комплексе остаются до сих пор неясными и заслуживают изучения.
В 1967 году Скулачёв с соавторами впервые показали, что ионы Zn + ингибируют цитохром Ьсі-комплекс. Добавление микромолярных концентраций ионов Zn к митохондриям увеличивало степень восстановленности цигохрома Ъ и уменьшало степень восстановленности цигохрома с. Ингибирующее действие цинка обращалось добавлением ЭДТА.
В настоящей работе исследовалось действие ионов Zn+ на простейший трех-субъединичный цитохром Ьс\- комплекс фототрофных бактерий Rhodobacter capsulatus. Фермент исследовался в нативных мембранных везикулах (хроматофорах). Наличие фотосинтетических реакционных центров (РЦ) позволяло запускать фермент вспышкой света. То обстоятельство, что каротиноидные пигменты светособирающих комплексов Rb. capsulatus являются природными электрохромными индикаторами трансмембранной разности электрических потенциалов (Ду), давало возможность оптическими методами регистрировать стадии трансмембранного переноса электрического заряда и изучать их связь с редокс превращениями цигохромов в микро- и миллисекундной временной шкале измерений.
Обратимость ингибирующего действия цинка позволяла надеяться, что его малые концентрации могут быть использованы для «притормаживания» индуцированных вспышками реакций в цитохром Ьс\- комплексе Rb. capsulatus и выявления отдельных стадий каталитического цикла без нарушения целостности работы фермента. Цель настоящей работы. Цель настоящей работы состояла в изучении механизма сопряжения окислительно-восстановительных (редокс) реакций в цитохром bci-комплексе Rb. capsulatus как друг с другом, так и с генерацией мембранного потенциала. Для этого было изучена работа цитохром be і- комплекса в присутствии малых концентраций ионов Zn +.
Научная новизна работы. Для цитохром беї-комплекса впервые предложена экспериментальная система, позволяющая, в присутствии малых концентраций ионов параллельно следить, используя метод импульсной спектрофогометрии, за редокс реакциями цигохромов Ъ и с„ генерацией Ду и переносом протонов. Предложенная методика позволяет изучать цитохром Подкомплекс в оптимальных для его функционирования окислительно-восстановительных условиях.
В работе показано отсутствие кинетического сопряжения между быстрым окислением убихинола, приводящим к трансмембранныму переносу электрона к тему Ьь, и более медленными восстановлением цитохрома С\, генерацией Ду и выбросом протона внутрь хроматофоров. Неэлектрогенность трансмембранного переноса электронов в цитохром ісі-комплексе свидетельствует о способности белка электростатически компенсировать перенос заряда на расстояние около 20 А. Выявленная корреляция между восстановлением цитохрома с\ генерацией Дуу, выбросом протона внутрь хроматофора и окислением гема b/, позволила предложить модель работы цитохром Ьс\-комплекса, согласующуюся с экспериментальными данными.
Практическое значение работы. Полученные результаты значительно расширяют современные представления о свойствах и механизме функционирования цитохром Ъс\-комплекса Rb. capsulatus, а данные по ингибированию отдельных кинетических стадий ионами Zn + могут быть полезны при изучении этого фермента в других организмах. В данной работе предложены новые методические подходы для исследования работы цитохром Ъс\- комплекса в условиях близких к физиологическим. Полученные результаты могут быть использованы при изучении роли цитохром Ьсі-комплекса в регуляции образования активных форм кислорода.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на научном семинаре отдела биоэнергетики НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ 15 апреля 2004 г., а также на 12-ом Международном конгрессе по фотосинтезу (Брисбен, Австралия, 2001г.), 12-ой Европейской конференции по биоэнергетике (Аркашон, Франция, 2002г.), 11-ом Международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (Токио, Япония, 2003), 13-ой Европейской конференции по биоэнергетике (Пиза, Италия, 2004), 13-ом Международном конгрессе по фотосинтезу (Монреаль, Канада, 2004), Международной конференции «Российская биоэнергетика: От молекул к клетке» (Москва, 2005).
Публикации. Результаты диссертационной работы изложены в трёх статьях и восьми тезисах.
Структура диссертации. Диссертация, изложенная на 146 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, состоящего из 3-х отечественньж и 169 иностранных источников цитирования. Работа содержит 2 таблицы и иллюстрирована 45 рисунками.
Общее строение и функции цитохром 6с і-комплекса
Цитохром Ьс\ -комплексы животных и бактерий, также как и цитохром -комплексы растений и цианобактерий, представляют собой олигомерные мембранные белки, функционирующие как электрогенные хинол: цитохром с/пластоцианин оксидоредуктазы (Ivanov, 1993, Berry et al., 2000a, Cramer et al., 1996). Они катализируют окисление разнообразных хинолов при помощи высоко потенциальных переносчиков электронов, таких как цитохромы с-типа в митохондриях и бактериях или пластоцианин в цианобактериях и высших растениях. Энергия,, высвобождающаяся при окислительно-восстановительных реакциях, используется для переноса протонов через сопряженную мембрану. При этом одна сторона мембраны заряжается положительно и называется Р-стороной, в то время как другая сторона заряжается отрицательно (TV-сторона). Перенос протонов через мембрану приводит к формированию разности электрохимического потенциала протонов (ДцН ), которая состоит из химической (ДрН) и электрической (Av/) составляющих и достигает в нормальных физиологических условиях 200-250 мВ (Скулачев, 1972, Bulychev et al., 1976) Протеолипосомы, полученные реконструированием очищеного цитохром be [-комплекса с фосфолипидами, генерируют А\ііҐ при переносе электронов от некоторых аналогов убигидрохинона на цитохром с (Guerrieri and Nelson, 1975, Leung andHinkle, 1975). Если в такие протеолипосомы была встроена Н4 - АТФ синтетаза, то наблюдался сопряженный синтез АТФ (Racker, 1976). Эти факты и целый ряд наблюдений, сделанных при изучении митохондрий и их фрагментов, показывают, что цитохром 6сгкомплекс может функционировать как независимый генератор Лц]-Ґ (Скулачев, 1988). Рентгеноструктура митохондриального цитохром be \ -комплекса показывает, что фермент представляет собой димер (Yu et al., 1996, Xia et al., 1997, Zhang et al., 1998, Hunte et al., 2000). Ю с соавторами продемонстрировали, что цитохром be\-комплекс существовует в виде димера и в растворе (Xiao et al., 2001). Все цитохром bc\-комплексы содержат три минимально необходимые каталитические субединицы с характерными простетическими группами: цитохром b с двумя протогемами, цитохром с\ и так называемый белок Риске содержащий высокопотенциальный железосерный [2Fe-2S] кластер. Общее количество субъединиц цитохром ісі-комплекса варьирует от 3 до 11, в зависимости от организма. Митохондриальный йсі-комплекс состоит из 11 субединиц, цитохром Ьс\-комплекс дрожжей Saccharomyces cerevisiae содержит 10 субъединиц, а цитохром bci -комплекс бактерии Rhodobacter capsulatus состоит всего из трех субъединиц. На рисунке 1 показаны структуры цитохром бсі-комплексов из митохондрий быка и Rhodobacter capsulatus .
В трансмембранной части располагаются темы цитохрома Ь, гидрофобные спирали цитохрома с\ и железносерного белка Риске, а в митохондриальном цитохром йсі-комплексе ещё и субъединицы 7 и 10. С Р-стороны мембраны находятся глобулярные домены цитохрома С\ и железносерного белка Риске, а с Л/-стороны мембраны, в случае митохондриального цитохром -комплекса, располагаются две большие субъединицы 1 и 2, а также субъединица 6 (Zhang et al., 1998 , Iwata et ah, 1998, Berry and Huang, 2003).
В клетках бактерий ионы Н" транспортируются через цитоплазматическую мембрану в направлении от цитоплазмы к внешней среде, а в хроматофорах, наоборот, протоны захватываются снаружи и переносятся внутрь хроматофора. Таким образом, в бактериальной клетке мембрана заряжается положительно со стороны переплазматического пространства и отрицательно со стороны цитоплазмы, а в хроматофорах внутренняя сторона мембраны хроматофора заряжена положительно, а внешняя отрицательно. В митохондриальном цитохром Ьс\ -комплексе Р-сторона соответствует межмембранному пространству, а iV-сторона - матриксу митохондрий. Поскольку для цитохром Ъс\-комплексов из разных объектов нумерация аминокислот различна, то в данной работе для удобства, в том случае, когда специально не оговаривается, имеется ли в виду цитохром Ъс\-комплекс бактерий, нумерация аминокислот соответствует нумерации в цитохром be і -комплексе митохондрий цыплёнка.
Оборудование для импульсной спектрофотометрии
Это означает, что электрогенная реакция сопряжена с окислением гема йь. С другой стороны, после выявления трансмембранного расположения двух гемов в цитохроме Ъ (Saraste, 1984, Widger et al., 1984), стало принято считать, что электрогенез цитохром йсі-комплекса связан с переносом электрона между гемами b\ и by,. В пользу этого говорило то, что в присутствии антимицина А, когда окисление гема b заблокировано, наблюдается электрогенная реакция соответствующая переносу заряда на 30-60% толщины мембраны (Glaser and Crofts, 1984, Robertson and Dutton, 1988, Drachev et al., 1989, Shinkarev et al., 1990). Чтобы учесть действие Ду на окисление гема 6h Робертсон и Даттон предложили, что электрогенная реакция в цитохром Ьс\-комплексе идёт в две стадии, так что сначала электрон переносится с гема Ъ\ на гем Ьъ в середине мембраны, а потом - с гема oh в Qi -сайт на поверхности мембраны (Robertson and Dutton, 1988). Эта гипотеза, однако, пришла в противоречие с рентгеноструктурой, на которой видно, что гем оь находится вблизи jV-поверхности мембраны, на том же уровне, что и Qj-сайт (Xia et al., 1997, Kim et al., 1998, Zhang et al., 1998, Iwata et al., 1998, Hunte et al., 2000). Отсюда следует, что перенос электрона с гема Ьь на убихинон в Q; -сайте должен быть электро нейтральным и нечувствительным к Д\/. Последовательность каталитических стадий в цитохром Ьс\-комплексе можно отслеживать, запуская его вспышкой света в хроматофорах (мембранных везикулах) изолированных из фототрофных пурпурных бактерий Rhodobacter sphaeroides и Rhodobacter capsulatus (Crofts and Wraight, 1983, Jackson, 1988, Gennis et al., 1993). Эволюционно пурпурные бактерии довольно близки к митохондриям (Andersson et al., 1998), поэтому для обоих объектов можно использовать одинаковые ингибиторы. В ответ на вспышку света в хроматофорах происходит разделение зарядов в фотосинтетических реакционных центрах (РЦ) и образуются потенциальный восстановитель — подвижный убихинол и окислитель -подвижный окисленный цитохром с2. Когда убихинон в мембране окислен, реакции в цитохром be\-комплексе запускаются убихинолом, приходящем из РЦ. В случае, когда убихинон в мембране восстановлен, окисленный цитохром с2 инициирует срабатывание цитохром Ъс\-комплекса своим взаимодействием с цитохромом с\. Последний, окисляет FeS кластер белка Риске, который в свою очередь восстанавливается убихинолом в Q0-сайте. Окислительно-восстановительные реакции в цитохром Ьс\ -комплексе можно отслеживать оптически (Dutton and Prince, 1978, Crofts and Wraight, 1983). Образование Д\/ на мембране хроматофора можно регистрировать оптически, по электрохромному сдвигу мембранных каротиноидов (Jackson and Crofts, 1971), или электрометрически (Drachev et al., 1989, Mulkidjanian et al., 1990), а изменения pH можно отслеживать при помощи рН индикаторов (Jones and Jackson 1990, Mulkidjanian and Junge, 1995). В хроматофорах, реакции, связаные с окислением убихинола цитохром Ьс\-комплексом, можно вычленить, используя миксотиазол, который припятствует связыванию убихинола в Q0-cam:e, но при этом не оказывает никакого влияния ни на РЦ, ни на перераспределение электрона в высокопотенциальной электронтранспортной цепи цитохром йсі-комплекса (Crofts, 1985, Berry et al., 2000a). В отсутствие специфических ингибиторов, электрон(ы) появляются на геме Ьь быстрее, чем на цитохроме с і после окисления убихинола в Qo-сайте. Такой эффект наблюдался, как в митохондриальном цитохром бй-комплексе (King et al., 1975, Snyder and Trumpower, 1999), так и в цитохром bc\ -комплексе хроматофоров фотосинтетических бактерий (Dutton and Prince, 1978, O Keefe and Dutton, 1981, Bowyer and Crofts, 1981, Matsuura et al., 1983, Drachev et al., 1989 , Mulkidjanian et al., 1991, Mulkidjanian and Junge, 1994, 1995, Gopta et al., 1998). В хроматофорах генерация Ду и выброс протонов с Р-стороны мембраны происходят с той же скоростью, что и восстановление цитохрома с\ убихинолом. Опережающее восстановление гема bh наблюдалось и в том случае, когда цитохром Ъс\-комплекс срабатывал однократно в условиях дефицита убихинола (Gopta et al., 1998, Gopta and Mulkidjanian, 1998) или при уменьшении интенсивности возбуждающей вспышки (Mulkidjanian and Junge, 1995). После добавления антимицина А это кинетическое несоответствие исчезало, как в митохондриальном цитохром Ъс\ -комплексе (Snyder and Trumpower, 1999, Hansen et al., 2000), так и в цитохром Ъс\-комплексе Rhodobacter (Crofts et al., 1983, Glaser and Crofts, 1984, Drachev et al., 1989, Mulkidjanian et al., 1991, Mulkidjanian and Junge 1995, Gopta and Mulkidjanian 1998). Это наблюдение показывает, что первый каталитический оборот в интактном цитохром Ьсркомплексе отличается от единственного оборота обработанного антимицином А цитохром / -комплекса. Драчёв с соавторами (Drachev et al., 1989), изучая электрогенные реакции в цитохром Ьс\-комплексе, предположили, что существенный вклад в генерацию Д\/ цитохром Ьс\ -комплексом вносят реакции трансмембранного переноса протона.
Характеристика окислительно-восстановительных условий во время измерений
Как отмечалось в обзоре литературы, при окислении убихинола в центре Q0 первый электрон поступает на FeS-домен белка Риске и только второй электрон восстанавливает сперва гем bi, а затем, пересекши мембрану, - гем bh- Окисление убихинола сопровождается высвобождением двух протонов. Один из них поступает на FeS-домен белка Риске, а второй, по всей видимости, поступает на Glu-272 цитохрома b . В принципе, можно было ожидать совпадения кинетики восстановления гема bh с кинетиками генерации Ау и выброса протонов из центра Q0. Этого, однако, не наблюдалось — гем b восстанавливался значительно быстрее. Отсутствие сопряженной с восстановлением гема bh генерации Ду показывает, что трансмембранный перенос электрона из центра Q0 к гему bh электрически компенсируется. Впервые это явление было отмечено Мулкиджаняном и соавторами в цитохром бсі-комплексе Rb. sphaeroides (Mulkidjanian et al., 1991). Для цитохром 6 /-комплекса отсутствие кинетического сопряжения между трансмембранным переносом электрона в цитохроме b и генерацией Лу было убедительно показано Понамаревым и Крамером (Ponamarev and Cramer, 1998), обнаружившими, что при замене аминокислотных остатков в цитохроме / замедлялись восстановление цитохрома/и генерация Avj/, в то время как скорость восстановления цитохрома b не изменялась и была существенно быстрее, чем две другие реакции. В случае цитохром беї.комплекса отсутствие кинетического сопряжения между трансмембранным переносом электрона и генерацией Ду оставалось, однако, спорным по следующей причине. С одной стороны, скорость восстановления гема bh в цитохром Ъс\ -комплексе опережает электрогенез и востановление цитохрома с\ только в 2-4 раза (O Keefe and Dutton, 1981, Matsuura et al., Bowyer and Crofts, 1981, Mulkidjanian and Junge, 1995, Gopta et al., 1998, Hansen et al., 2000, Snyder and Trumpower, 1999, Schultz and Chan, 2001).C другой стороны, при добавлении антимицина А восстановление гема bh замедляется в 2-3 раза (O Keefe and Dutton, 1981, Gopta et al., 1998, Snyder and Trumpower, 1999, Drachev and Mamedov, 1989, Hansen et al., 2000). Таким образом скорости восстановления цитохрома с\ и генерации Д\/ без антимицина А приблизительно совпадают со скоростью восстановления гема bh, но в присутствии антимицина А (!), что использовалось в качестве основного аргумента в пользу кинетического сопряжения между трансмембранным переносом электрона к гему bf, и электрогенезом (Crofts, 1985, Crofts etal., 1999а).
Представленные в настоящей работе данные показывают, что и в цитохром Ьсх -комплексе скорости трансмембранного переноса электрона в цитохроме Ъ и генерации Д\/, обе измеренные в отсутствие антимицина А, могут различаться в 15 раз (при 30С, см. рис. 37). Даже в условиях однократного срабатывания цитохром be t -комплекса кинетики этих реакций различались, по меньшей мере, в 5 раз (см. рис. 41).
Несопряженность реакций восстановления гема bh, с одной стороны, и генерации Д\/, а также ре-восстановления цитохрома с\, с другой стороны, следует также из того факта, что Zn2+(B концентрации 100 мкМ) по разному влияет на эти реакции, замедляя последние две по отношению к восстановлению гема bh. (см рис. 22, 23, 24) Если бы все эти реакции были кинетически сопряжены, то они одинаково бы отвечали на добавку Zn2+. Таким образом, полученные в настоящей работе данные показывают, что трансмембранный перенос электрона к гему b/, неэлектрогенен, что говорит об электростатической компенсации трансмембранного переноса электрона в цитохром Ьс\-комплексе Rb. capsulatus. На первый взгляд, предположение, что трансмембранный электронный транспорт из центра Q0 к гему bh не сопровождается генерацией Д\/, является парадоксальным. Однако такое возможно, например, при кинетическом сопряжении переноса электронов между гемами bi и bh с переносом протонов в том же направлении.
В кристаллической структуре цитохром be і -комплекса дрожжей видна водная цепочка, соединяющая пропионатные группы гема Ъ\ с внешней водной фазой (Hunte et al., 2000). Крофтс с соавторами предположили, что подобная цепочка служит для выброса протонов из центра Q0 (Crofts et al., 1999b). Эта цепочка на рис. 42А обозначена как R-канал поскольку она «выстлана» консервативными аргининовыми остатками Arg-81 и Arg-72 (нумерация дрожжей). Выброс протонов через этот канал достаточно маловероятен из-за электростатического противодействия как со стороны положительно заряженных аргининовых остатков, так и со стороны трансмембранного электрического поля. Эти же факторы, однако, будут способствовать переносу протона в противоположном направлении к пропионатным группам гема 6/. Такой перенос протона будет электростатически компенсировать трансмембранный перенос электрона к гему Ьи- Дополнительно перенос отрицательного заряда между гемами bi и bh может быть скомпенсирован диэлектрической релаксацией белка, переориентацией диполей воды и, возможно, кинетически сопряженным движением заряженных доменов белка.
Замедление восстановления цитохрома сх по сравнению с восстановлением гема bh, проявляющееся более явно в присутствии Zn2+, говорит о задержке электронного переноса с FeS-кластера белка Риске на цитохром С\. Подобная задержка, как было отмечено Мулкиджаняном и Юнге (Mulkidjanian and Junge, 1995), нужна для предотвращения «короткого замыкания», которое может произойти при «утечке» обоих электронов с убихинола на цитохромы с. «Застревающий» на FeS-кластере первый электрон вынуждает второй электрон восстанавливать гемы цитохрома Ь.
Представленные данные говорят о кинетическом сопряжении между ре-восстановлением цитохрома с\, окислением гема bh, выбросом протонов из центра Q0 и генерацией Ду, а также о способности ионов Zn замедлять все эти реакции (см. рис 23, 27, 35). Понять эти наблюдения можно, анализируя структурные данные. Они, в частности, показывают, что FeS-домен белка Риске после его восстановления убихинолом, чтобы восстановить цитохром С\, должен отстыковываться от цитохрома b и перейти в положение «цит. с\» (Kim et al, 1998, Berry et al., 2000). Анализ литературных данных позволяет предположить, как это движение регулируется и как оно может замедляться ионами Zn+. В частности, было показано, что движение FeS-домена механически контролируется ef петлёй цитохрома 6, которую FeS-домен должен «отодвинуть» на 1-2 А чтобы «пройти» к цитохрому С\ (Israilev et al., 1999 , Darrouzet and Daldal, 2002, 2003,). Один из лигандов 2n2+(His-268 для цитохром йсі-комплекса цыплёнка или His-291 для цитохром Ьсі-комплекса Rb.capsulatus) располагается как раз на том коротком участке ef петли, которая взаимодействует с подвижным доменом белка Риске. Вероятно, связывание цинка придаёт ef петле дополнительную жесткость, так что FeS-домену становится труднее совершить движение FeSf, FeSc. С другой стороны, структура 2п2+-связывающего сайта очень похожа на структуру Zn -связывающего сайта в РЦ Rb. sphaeroides (Berry et al., 2000, Paddock et al., 2003). Последний служит «протонным входом» в РЦ.
Каталитический цикл цитохром ос і-комплекса при различных значениях рН
Перенос протонов в реакциях (а) - (в), с одной стороны, электрогене н, а с другой - должен коррелировать с ре-восстановлением цитохрома сь что и наблюдалось в эксперименте. Помимо этого, образование убихинола в центре Q; соответствует нейтрализации того отрицательного заряда, который электростатически компенсируется во время быстрого восстановления гема Ьь. Это должно приводить к обращению всех компенсирующих событий, что само по себе будет давать электрогенную реакцию, кинетически сопряженную с окислением гема bf,.
Рентгеноструктурный анализ выявил, что в димерном цитохром .комплексе дрожжей убихинон в Qi-сайте был в том мономере, который взаимодействовал с извне добавленным цитохромом с (Hunte et al., 2003). Таким образом восстановление цитохрома с и образование убихинола в Qi-сайте, видимо, происходит в одном мономере. Убихинол/убихинон способен входить в Qo-сайт одного мономера со стороны Qi-сайта другого мономера (Xia et al., 1997).
Таким образом внутри димера цитохром be\ -комплекса, видимо, может происходить обмен убихинол/убихиноном между Qj-сайтом и Qo-сайтом разных мономеров. Так например, по предположениям Рича (Rich, 1984, Rich et al., 1992), убихинон, образовавшийся после окисления убихинола в одном Qo-сайте, может напрямую перейти в Qi-сайт другого мономера, а убихинол, образовавшийся в Qj-саите одного мономера, может перейти в Qo-сайт другого мономера. Весьма вероятно, что окисление убихинола в димерном цитохром Ъс\- комплексе происходит поочерёдно то в одном, то в другом мономере (Gopta et al., 1998, Trumpower et al., 2002, 2004). Для ответа на все эти вопросы потребуются дальнейшие исследования
Суммируя вышеизложенное, можно утверждать, что каталитический цикл окисления убихинола цитохром be\ -комплексом идет в две стадии. На первом этапе, как показано на рисунке 42А, молекула убихинола окисляется в центре Q0, приводя к восстановлению и протонированию FeS-домена белка Риске и восстановлению гема bt, соответственно. FeS-домен остается связанным с цитохромом Ь, как показано на рис. 42А. С гема bi электрон переносится поперек мембраны на гем bf,; неэлектрогенность этой реакции свидетельствует о ее электрической компенсации. На данной стадии высвобождения протонов в водную фазу не происходит.
На следующей стадии, которая в присутствии 50 мкм Zn проходит примерно за 10 мс, происходят окисление гема bh, восстановление цитохрома С\, выброс протона внутрь хроматофоров и генерация Д\/. Кинетическое сопряжение этих реакций между собой, а также их параллельное замедление с увеличением концентрации цинка могут быть объяснены предположением, что Zn -связьшающий сайт, идентифицированный в структуре митохондриального цитохром be)-комплекса (Berri et al., 2000b), служит местом выхода протонов из центра Q0. Данное предположение основано на структурном сходстве с Zn -связывающим входным протонным каналом РЦ Rb. sphaeroides (Paddock et al., 2003) и на известной способности ионов цинка блокировать протонные каналы в разных ферментах (De Coursey, 2003). Как видно из рис. 42А, Zn2+ связывающий сайт закрыт FeS-доменом белка Риске, когда последний состыкован с цитохромом Ь, однако, становится доступным для воды после поворота FeS-домена к цитохрому с\. (см. рис. 42В). Известно, что поворачиваясь к цитохрому сь FeS-домен «отодвигает» петлю ef цитохрома b (петля выделена толстым контуром и обозначена е/пв. рис. 42А.). Эта петля, в то же время, участвует в связывании иона Zn +, предоставляя один из гистидиновых лигандов (см. рис. 42А). Таким образом, с увеличением концентрации цинка должны одновременно затрудняться и восстановление цитохрома С\ подвижным FeS-доменом белка Риске и электрогенный выход протонов из центра Q0, что и наблюдалось в экспериментах. Корреляция этих реакций с окислением гема bk обусловлена, скорее всего, механическим (конформационным) сопряжением между центром Qt и FeS-доменом белка Риске. Хотя механизм подобного сопряжения, впервые предложенного Мулкиджаняном и Юнге (Mulkidjanian and Junge, 1995), остается неясным, свидетельства в его пользу начинают накапливаться (Valkova-Valchanova et al. 2000, Berry and Huang, 2003, Cooley and Daldal, 2005).
