Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛЙТЕРАОТЫ
Глава I, Молекулярная организация и биогенез ,комплекса - II
1.1. Состав и структура комплекса цитохромов
1.2. Биогенез комплекса цитохромов
1.3. Молекулярная организация и экспрессия гена цитохрома 21
Глава II. Топография синтеза митохондриальных белков в цитоплазме и механизм:их транспорта в митохондрии 32
ЭКСПЕРЖ НТАЛЪНАЯ ЧАСТЬ
Глава III. Материалы и методы 61
3.1. Материалы и реагенты 61
3.2. Выделение комплекса цитохромов 61
3.3. Электрофорез белков 62
3.4. Спектральный анализ комплекса цитохромов 64
3.5. Получение антител против комплекса цитохромов 64
3.6. Йотирование белков 65
3.7. Получение полирибосом 66
3.8. Седиментационный анализ полирибосом, синтезирующих компоненты комплекса цитохромов 67
3.9. Трансляция полирибосом в бес клеточных системах 68
3.10. Выделение и трансляция полисомных РНК стр.
З.1.1. Анализ, рекомбинантных клонов E.coli, синтезирующих апоцито хром 71
Глава ІУ. Характеристика полирибосом, синтезирующих комплекс цитохромов 74
4.1. Свойства изолированного комплекса цитохромов. и антител к нему 74
4.2. Связывание иммуноглобулинов с полирибосомами печени крысы 78
4.3. Внутриклеточная локализация полирибосом, синтезирующих полипептидные компоненты комплекса цитохромов 84
4.4. Размеры подирибосом, синтезирующих полипептиды комплекса цитохромов
box 87
4.4.1. Внутримитохондриальные полисомы, синтезирующие апоцитохром 88
4.4.2. Картирование гена апоцитохрома в ДНК печени крысы 92
4.4.3. Седиментационный анализ полирибосом цитоплазмы, синтезирующих полипеп
тидные компоненты комплекса 97
Глава У. Биосинтез полипептидов комплекса цитохромов в бес клеточных системах 105
5.1. Идентификация полипептидов комплекса цитохромов, синтезированных в бес клеточных системах 106
5.2. Реконструированные системы транспорта синтезированных в цитоплазме полипептидов комплекса в митохондрии
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 128
ШТОФ 137
СПЖОК ЛИТЕРАТУРЫ 1
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы достигнуты большие успехи в изучении генетических функций митохондриальной ДНК /мтДНК/ различных эукарио-тических организмов и молекулярно-генетических аспектов проблемы биогенеза митохондрий (см.обзоры /144,4,6,8,12,13,14,17,20/). Прежде всего, установлено, что формирование ферментных ансамблей митохондрий является результатом координированной деятельности5 митохондриальной генетической системы и хромосомных генов, причем матричные РНК - транскрипты этих двух групп генов транслируются как на митохондриальных, так и на цитоплазматических рибосомах /169,171,189/. В основном, идентифицированы белковые продукты, закодированные в молекулах мтДНК дрожжей. К ним относятся специфические субъединицы ферментных ансамблей внутренней митохондриальной мембраны - цитохромоксидазы, комплекса цитохро-мов Ъс-j. и АТ Т?-синтетазы /189,171,192,169/. Картировано положение этих генов на молекуле мтДНК дрожжей и выяснены многие детали их молекулярной организации и экспрессии, а также расшифрована первичная структура ряда регионов дрожжевой мтДНК. В опытах на мтДНК клеток высших организмов также идентифицированы гены, кодирующие полипептидные компоненты ферментных ансамблей внутренней мембраны. В 1981 г. завершена работа по определению полной первичной структуры мтДНК мыши /38/ и человека /27,28,32, 137,150/, в результате которой открыто своеобразие генетического кода митохондрий, отличающегося по информационному смыслу ряда кодонов от "стандартного" кода, считавшегося до этого универсальным способом кодирования в живой природе /32,38,123,68,43/. Доказано также, что основная масса митохондриальных белков кодируется хромосомными генами и синтезируется на рибосомах цито - б плазмы. Механизм транспорта этих белков в митохондрии интенсивно изучается в последние годы /22,52,168/,
Генетические функции мтДНК и механизмы ядерно-митохоцдри-альной интеграции в течение ряда лет систематически исследуются в Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ АМН СССР /12,13,14, 144/. В работах Лаборатории получена существенная информация о молекулярной организации мтДНК животных клеток /8/, о регуляции ее экспрессии /10,15,16/, свойствах митохондриальной мРНК и автономного белоксинтезирующего аппарата митохондрий /3,4/. При изучении топографии синтеза митохондриальных белков в цитоплазме обнаружена специфическая фракция полирибосом цитоплазмы, каким-то образом ассоциированная с наружной мембраной митохондрий и специализированная, по всей вероятности, в синтезе белков для этих органелл /5,71/. В частности, эта фракция цитоплазматичес-ких полисом преимущественно вовлечена в синтез субъединиц цито-хромоксидазы /II/. Однако, ряд аспектов топогенеза митохондриальных белков в животной клетке остается невыясненным. Остаются неизвестными общие закономерности топографии синтеза белков митохондрий в животной клетке, механизмы их специфического транспорта в митохондрии, связь между транспортом и созреванием митохондриальных белков и т.д. Решение этих вопросов представляет существенный интерес с точки зрения биологии животной клетки для понимания тонких механизмов координированной экспрессии ядерных и митохондриальных генов /сцепленных функционально, но разобщенных пространственно/, определяющих структуру субъединиц ферментных ансамблей митохондрий. Выяснение этих механизмов, в свою очередь, необходимо для детального изучения молекулярных основ нарушений биогенеза митохондрий при злокачественных новообразованиях, некоторых наследственных болезнях и других формах клеточ - 7 ной патологии, при воздействии на организм некоторых антибиотиков. Цели и задачи исследования:
В качестве модельного объекта для изучения внутриклеточного топогенеза митохондриальных белков представлялось целееообразным избрать комплекс цитохромов bcj. Этот комплекс является необходимым компонентом митохондриальной цепи транспорта электронов. Он локализирован во внутренней митохондриальной мембране /47, 157/ и состоит из ряда субъединиц, структура которых определяется как митохондриальными, так и ядерными генами /159,189,192/. Эти субъединицы различаются также по внутриклеточной топографии их синтеза. В опытах на дрожжах доказано, что мтДНК кодирует единственный полипептидный компонент комплекса bCj, а именно -апоцитохром Ъ /44/. В то же время вклад двух генетических систем животной клетки в формирование комплекса bcj до последнего времени оставался совершенно неизвестным. Неизученными остаются также закономерности внутриклеточного распределения полирибосом животных клеток, участвующих в синтезе полипептидов этого комплекса, и механизмы транспорта в митохондрии и созревания этих субъединиц.
В связи с этими соображениями цель данной работы в общем виде формулировалась как изучение внутриклеточной топографии синтеза субъединиц митохондриального комплекса цитохромов Ьс_.
В конкретные задачи работы входило: I/ Выделить и охарактеризовать комплекс цитохромов Ъс . из печени крысы и получить к нему моноспецифические антитела; 2/ С помощью радиоиюлунохимического метода изучить внутриклеточную локализацию полирибосом, содержащих насцентные цепи полипептидов - компонентов комплекса;
В опытах на реконструированных бесклеточных системах изучить механизмы транспорта в митохондрии новообразованных полипептидов - субъединиц комплекса bcj или их предшественников. Научная новизна работы:
Впервые показано, что субъединицы комплекса bcT синтезируются в виде предшественников на двух группах полирибосом цитоплазмы печени крысы - на полисомах, ассоциированных с наружной мембраной митохондрий, и на мембраносвязанных полисомах шероховатого эндоплазматического ретикулума. В опытах на реконструированных бесклеточных системах выявлена специфичность молекуляр-но-весового распределения полипептидов комплекса bcj, синтезируемых на двух группах полисом цитоплазмы. Продемонстрирован синтез высокомолекулярных /возможно, полипротеидных/ предшественников некоторых субъединиц. Синтез компонентов комплекса bc-j. на полисомах, ассоциированных с наружной мембраной митохондрий, связан с их котрансляционным транспортом внутрь органелл, который сопряжен во времени с ростом полипептидных цепей на полисомах. Субъединицы комплекса ъ , синтезируемые мембрано с вяз ан-ными полисомами шероховатого ретикулума, транспортируются в митохондрии посттрансляционно путем диффузии через цитозол. Научно-практическое значение полученных результатов:
Результаты работы объясняют механизмы специфического транспорта белков, синтезируемых в цитоплазме, внутрь митохондрий и последующей сборки ферментных ансамблей внутренней митохондри-альной мембраны из полипептидных субъединиц. Полученные данные существенны для дальнейшего экспериментального анализа молекулярных механизмов интеграции биосинтеза митохондриальных белков в различных компартментах животной клетки и нарушений биогенеза митохондрий в клетках злокачественных новообразований. Использованный в работе метод выделения комплекса цитохромов baj. из митохондрий печени крысы может быть применен в практике работы лабораторий, исследующих структуру и биогенез митохондриальных ферментных ансамблей. Обнаруженное в работе высокое относительное содержание мРНК субъединиц комплекса в полисомах, ассоциированных с наружной мембраной митохондрий, представляет интерес для разработки рационального метода препаративного выде-.ления этих мРНК, их обратной транскрипции и клонирования кДНК в бактериальных векторах. Структура диссертации:
