Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1.1. Внутриклеточное расщепление белка и его регуляция 9
1.2. Функциональное значение амидных групп в белках 29
Глава II. Экспериментальная часть 40
2.1. Материалы и методы исследования 40
2.1.1. Материалы исследования . . 42
2.1.2. Методы исследования.
Глава III. Результаты исследований 58
3.1. Неферментативное дезамидирование индивидуальных белков 58
3.1.1. Неферментативное дезамидирование препаратов сывороточного альбумина и гамма-глобулина в условиях, моделирующих физиологические (рН 6,5-7,0, 37С) 58
3.1.2. Дезамидирование гемоглобина в процессе его старения 70
3.2. Атакуемость дезамидированных белков протеоли-
тическими ферментами 75
3.2.1. Изучение атакуемости нативного и дезамидиро-ванного препаратов сывороточного альбумина протеиназами тканей при разных рН 79
3.2.2. Изучение атакуемости препарата гамма-глобулина в зависимости от степени его дезамиди-рования 94
3.2.3. Изучение атакуемости нативного и дезамидиро-ванного препарата сывороточного альбумина протеиназами субклеточных фракций тканей семенников и мозга 96
3.2.4. Изучение атакуемости нативного и дезамидиро-ванного препаратов сывороточного альбумина интактными и разрушенными лизосомами семенников крыс 102
3.2.5. Изучение атакуемости человеческого гемоглобина, выделенного из молодых, зрелых и старых эритроцитов крови, протеиназами тканей и субклеточных фракций . 107
3.2.6. Изучение изменения селективной активности протеина з ткани печени при старении III
3.3. Изучение атакуемости дезамидированных препаратов белка в опытах in vivo 115
Глава IV Обсуждение результатов 121
Выводы 151
Литература 153
- Внутриклеточное расщепление белка и его регуляция
- Неферментативное дезамидирование индивидуальных белков
- Неферментативное дезамидирование препаратов сывороточного альбумина и гамма-глобулина в условиях, моделирующих физиологические (рН 6,5-7,0, 37С)
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение обмена белков в организме представляет одну из важнейших проблем современной биохимии. Исследованиями последних лет установлены основные закономерности биосинтеза белка и его регуляции. Значительно меньше сведений о механизмах регуляции внутриклеточного расщепления белков, хотя значение этого процесса не менее велико. Интерес к проблемам протеолиза еще более возрос в последнее время в связи с обнаруженным участием протеолитических ферментов в механизме секреции белковых веществ, образовании физиологически важных белков и пептидов, защитных и адаптивных реакциях организма и ряде других жизненноважных процессах.
Мало изучена одна из важнейших функций протеолиза - выведение из организма старых, отслуживших свой срок молекул белка. Собственно, судьба старых белковых молекул не является загадкой - они расщепляются протеолитическими системами клеток до свободных аминокислот. Невыясненными остаются механизмы, по которым происходит узнавание старых белков про-теиназами или системами, их обслуживающими. Срок существования индивидуальных белков или их комплексов резко различается, что свидетельствует о наличии определенной регуляции времени их нахождения в организме. Такая регуляция несомненно должна быть связана со структурой белковой молекулы и, в частности, с ее аминокислотной последовательностью. Особая роль в процессах саморегуляции должна принадлежать радикалам аминокислот, способным к неферментативным посттрансляционным модификациям.
До настоящего времени остается невыясненным значение процесса и последствий спонтанного дезамидирования аспарагина и глутамина, занимающих важное место в структурной организации белковой молекулы. Способность этих аминокислот терять свои амидные группы в водных растворах при физиологических условиях среды была показана как на синтетических пептидах ( Robinson, Rudd, 1974), так и на индивидуальных белках (Кричевская и др., 1980). До сих пор не обнаружены ферменты, способные специфически катализировать реакцию дезамидирования. В то же время на скорость этой реакции в значительной мере влияют радикалы аминокислот, соседствующие с амидами в полипептидной цепи ( Robinson, Rudd, 1974).
На основании экспериментов и расчетов, которые показали строгую зависимость между содержанием амидных групп в белках и временем их существования в организме, была высказана гипотеза о роли процесса неферментативного дезамидирования в регуляции "продолжительности жизни" белковых молекул (Robinson et al., 1970). Согласно этой гипотезе, скорость дезамидирования белка, зависящая от числа, соотношения и расположения амидов - показателей, индивидуальных для разных белков,-и является конкретным механизмом, определяющим время существования белковой молекулы.
В единичных опытах было показано, что некоторые дезами-дированные белки быстрее атакуются протеолитическими ферментами (Flatmark, 1967; Пушкина, 1979), однако, конкретные механизмы этого процесса до настоящего времени не изучены.
Мы предположили, что в организме существуют специальные протеиназы, узнающие и расщепляющие дезамидированные белки. Их мощность должна быть различной в разных тканях и изменять- ся с возрастом, что может привести к накоплению в организме старых дефектных белков. Это, возможно, определяет возникновение ряда нарушений метаболитических процессов, наблюдаемых при старении. Использование в медицинской практике дезамиди-рованных препаратов белка способно снизить их терапевтическое действие за счет быстрой инактивации протеиназами.
Цель исследования» Основной задачей настоящей работы явилось определение активности протеиназ разных тканей к на-тивным и дезамидированным белкам у половозрелых (молодых) и старых животных, степени селективности протеиназ разного субклеточного происхождения по отношению к дезамидированным белкам и выяснение оптимальных условий их функционирования в опытах in vitro.
Для решения поставленной задачи работа проводилась в следующих направлениях: исследование процесса неферментативного дезамидиро-вания индивидуальных белков крови: сывороточного альбумина и гамма-глобулина; исследование изменения амидированности гемоглобина эритроцитов человека при их старении в организме; изучение процесса расщепления дезамидированных in vitro и in vivo белков протеиназами гомогенатов и субклеточных фракций тканей в зависимости от: а) рН инкубационной среды; б) типа ткани; в) возраста организма; в опытах с меченым сывороточным альбумином изучение различий в атакуемости протеиназами нативного и дезамидиро-ванного альбумина сыворотки крови in vivo.
Научная новизна работы. В настоящей работе на производственных (медицинских) препаратах сывороточного альбумина и гамма-глобулина подтвержден процесс неферментативного дезами-дирования. Показано уменьшение числа амидных групп в молекуле гемоглобина при старении эритроцита. Впервые в сравнительном аспекте изучена специфическая активность протеиназ тканей мозга, печени, почек, семенников и селезенки к дезамидиро-ванным белкам. В опытах in vitro показано, что дезамидиро-ванные белки быстрее атакуются протеолитическими ферменташ тканей, чем нативные, причем, степень увеличения атакуемости зависит от глубины дезамидирования, тканевого источника протеиназ, рй-инкубационной среды. Показана возможная роль ли-зосомальной системы и, в частности, лизосомальных протеиназ и лизосомальной мембраны в процессах отбора и селективного расщепления дезамидированных препаратов сывороточного альбумина. Установлено снижение селективной активности специфических протеиназ с возрастом, что может быть непосредственной причиной накопления в тканях старых животных дезамидированных белков. Впервые с меченным белком показано более быстрое выведение из организма животных внутривенно введенного дезами-дированного препарата сывороточного альбумина, по сравнению с нативным.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе данные представляют существенный интерес для понимания механизмов отбора и расщепления белков в клетке. В теоретическом плане важным является установление различной мощности лизосомальных и нелизосомальных систем, селективного протеолиза дезамидированных белков в клетках разных тканей, по-видимому, связанной с их функциями в организме. Разнообразие систем селективного отбора и расщепления дезамиди- _ 8 - рованных белков, выявленное на молекулярном (спектр протеи-наз) и субклеточном (лизосомальная мембрана) уровнях, может быть следствием их постоянного усовершенствования в процессе эволюции в связи с дифференцировкой клеток.
Практическую ценность представляют результаты по неферментативному дезамидированию белковых препаратов в процессе их длительной инкубации. Установленное снижение амидированнос-ти гемоглобина эритроцитов при их старении in vivo может также происходить в процессе хранения препаратов крови и в результате этого понизить их терапевтическую активность. Особый интерес представляют данные о более быстром выведении из организма дезамидированных препаратов сывороточного альбумина, по сравнению с нативным. Эти данные могут иметь значение при учете дозирования препаратов сывороточного альбумина с разным сроком хранения в клинике. Полученные в работе материалы используются при. чтении специальных курсов на кафедре биохимии и биотехнологии РГУ. _ 9 -
Внутриклеточное расщепление белка и его регуляция
Расщепление пептидных связей в молекулах белков катализируется особой группой ферментов - протеиназами (3.4). О важном значении процессов протеолиза свидетельствует наличие широкого спектра протеолитических ферментов, обнаруженных на разных уровнях организации ЖИВЫХ систем ( Holzer, Heinrich, 1980). Полагают, что самой древней функцией протеолиза является извлечение вещества и энергии из экзогенных белковых субстратов, которые необходимы организму для биосинтетических процессов ( Figure et al., 1980).
В процессе эволюции функции протеолиза в организме значительно расширились. Посредством протеолиза осуществляется тонкая регуляция функционирования некоторых белков. После отщепления специфическими протеиназами определенного участка полипептидной цепи ряда ферментов (трипсин, химотрипсин и т.д.) и гормонов (глюкагон, ангиотензин, инсулин и т.д.) происходит повышение их ферментативной или гормональной активности ( Steiner at al., 1975; Docherty et al., 1982). Таким же образом регулируется функционирование некоторых транспортных белков (альбумин) ( Judah, Foreman, 1980), структурных белков (коллаген) ( binder et al., І98І), белков, участвующих в механизме свертывания крови (фибрин) (steinbuch, 1979). Частичный протеолиз способствует переносу ряда секреторных белков через мембраны эндоплазматического ретикулума (De Pierre, Ernster, 1977).
Большое значение протеолитические реакции имеют в морфо -10 генетических процессах: при самосборке вирусов, споруляции бактерий, в процессах морфогенеза высших организмов, при оплодотворении яйцеклетки, злокачественной трансформации клеток И Т.д. (Holzer, Heinrich, 1980).
Протеолиз лежит в основе функционирования ряда специализированных клеток высших организмов. Так, защитное действие фагоцитов обусловливается протеолитическим расщеплением фагоцитированных ими болезнетворных микроорганизмов, попавших в в кровяное русло (Карр, 1978).
Наличие у высших организмов специального аппарата внутриклеточного разрушения - лизосом - позволяет осуществлять тонкую регуляцию протеолитических процессов в клетке (Покровский, Тутельян, 1976; De Duve, 1980). Лизосомы отсутствуют только у бактерий, вирусов и в некоторых специализированных клетках высших организмов. Первичная функция лизосом, сохранившая свое значение у одноклеточных организмов, - внутриклеточное пищеварение ( Verma, verma, 1977). Наиболее общими функциями лизосом, которые они выполняют во всех клетках, является осуществление клеточного питания и устранение из клетки утративших свое функциональное значение или активность структур и макромолекул (Покровский, Тутельян, 1976). В последнее время большое внимание уделяется возможному участию лизосом в адаптивной перестройке метаболизма при различных патологических процессах и изменениях условий внешней среды (Панин, 1983).
Неферментативное дезамидирование индивидуальных белков
Амидные группы белков представлены, в основном, амидами аспарагина и глутамина. Различная устойчивость амидов этих аминокислот к кислотному гидролизу делает возможным их количественное определение (Гершенович, Кричевская, I960). По данным этих авторов, легкогвдролизуемые амидные группы, принадлежащие, главным образом, аспарагину (Пушкина, Лукаш, 1976), гидролизуются в IN H2SO. при Ю0С через 10 минут, -в то время как полный гидролиз всех амидов белка в тех же условиях проходит за 120 минут.
На основании этих данных нами было определено количество легко- и трудно гидролизуемых амидных групп в исследуемых белках. В наших опытах сывороточный альбумин содержал 510,4 + 17,2 мкМ амидного азота на г белка (табл. I), по данным литературы - 500 мкМ амидного азота на г белка ( Meio-un et al., 1975, пит. по Ландау, 1981).
Используемый нами препарат гамма-глобулина содержал 726,6 +14,8 мкМ амидного азота на г белка (табл. 4), по данным других авторов - 744 мкМ амидного азота на г белка (Кричевская и др., 1978).
В препарате сывороточного альбумина на долю ЛАГ приходится 227,1 +15,5 мкМ амидного азота на г белка, что составляет 44,4$ от общего числа амидов; на долю ТАГ - 283,3 + + 9,6 мкМ амидного азота на г белка (табл. 2; 3).
Исходный препарат гамма-глобулина содержал 184,2 + 7,7 мкМ ЛАГ, 25,3$ от общего содержания амидов в белке, и 542,4 + 15,4 мкМ ТАГ на г белка (табл. 4).
Соотношение ЛАГ/ТАГ для сывороточного альбумина равно 0,8, для гамма-глобулина - 0,34 (табл. 5); таким образом, используемые нами препараты белков существенно различались по уровню амидированности и по соотношению ЛАГ и ТАГ.
Неферментативное дезамидирование препаратов сывороточного альбумина и гамма-глобулина в условиях, моделирующих физиологические (рН 6,5-7,0, 37С
В качестве субстрата для протеолитических ферментов мы сочли необходимым использовать также белок, утративший часть амидов при функциональном старении в условиях организма. Для этой цели был выбран гемоглобин. Особенности жизненного цикла эритроцитов позволяют исследовать постсинтетические модификации их белковых компонентов, включая фракцию гемоглобина. Время жизни некоторых видов гемоглобина сравнимо с временем жизни самой эритроцитарной клетки, так как потеря эритроцитом ядра на ранних стадиях эритропоэза исключает возможность синтеза новых молекул белка. Таким образом, все структурные изменения гемоглобина "старых" эритроцитов определяются постсинтетическими модификациями. В качестве одной из наиболее вероятных постсинтетических модификаций указывается дезамидирование (Labie, Krishnammorthy, 1979).
Молекула человеческого гемоглобина содержит 28 молей амидов на моль белка ( Perutz, 1976). Нами была определена амидированность гемоглобина, выделенного из "старых", "зрелых" и "молодых" эритроцитов крови человека, и количество основных фракций амидов, различающихся по своей устойчивости к кислотному гидролизу (табл. 9).
Амидированность "молодого" гемоглобина в наших экспериментах составляла 392,9 + 11,4 мкМ амидного азота на г белка. При этом 127,5 + 3,3 мкМ амидов на г белка принадлежало фракции ЛАГ (32$), а 265 + 12,1 мкМ амидного азота на г белка - фракции ТАГ (68$).
Таким образом, I молекула "молодого" гемоглобина в наших экспериментах содержала 25,5 моля амидов, из них 8,3 моля легкогидролизуемых и 17,2 моля трудногидролизуемых (табл. 10). При созревании и старении эритроцитов происходит изменение амидированности содержащегося в них гемоглобина. Так, количество ЛАГ статистически достоверно уменьшается на 11,8$ в гемоглобине "зрелых" эритроцитов по сравнению с их количеством в гемоглобине"молодых" эритроцитов. Количество ЛАГ в гемоглобине "старых" эритроцитов меньше, чем в гемоглобине "молодых" эритроцитов, на 19,4$ и составляет 102,8 + 4,7 мкМ амидного азота на г белка. Изменение ТАГ гемоглобина в процессе онтогенеза эритроцитов статистически недостоверно. Снижение САГ в гемоглобине за период жизненного цикла эритроцита составляет 49,8 мкМ амидного азота на г белка, что соответствует 12,7$ от его исходного уровня (табл. 9
