Содержание к диссертации
Введение
Аналитический обзор литературы 11
1.1 Общие сведения о протеазах. Применение, классификация и
свойства 11
1.1.1 Классификация 12
1.1.2 Характеристика и свойства 13
1.1.3 Протеазы растительного происхождения 16
1.1.4 Протеазы животного происхождения 17
1.1.5 Протеазы микробного происхождения 17
1.2 Методы повышения активности протеаз 19
1.3 Гидролиз растительных и животных белков протеазами 22
1.4 Применение протеаз растений и микроорганизмов в
пищевой технологии 23
1.4.1 Улучшение качества белков мяса действием протеаз 26
1.5 Капуста белокочанная, ее химический состав,
протеазный комплекс и изменения при хранении и обработке 30
1.5.1 Химический состав 31
1.5.2 Влияние хранения 34
1.5.3 Влияние кулинарной обработки 35
1.5.4 Влияние замораживания 35
Резюме 37
Экспериментальная часть 38
2.1 Характеристика исследуемого материала 38
2.2 Лабораторные методы исследования 42
2.2.1 Определение активности кислых и щелочных протеаз 42
2.2.2 Изучение белкового комплекса 43
2.2.2.1 Фракционирование по растворимости и определение азота фракций 43
2.2.2.2 Электрофоретические исследования 43
2.2.2.3 Аминокислотный состав 44
2.2.3 Определение массовой доли витаминов 46
2.2.3.1 Определение аскорбиновой кислоты 46
2.2.3.2 Определение витаминов Вь В2 и РР 47
2.2.4 Определение активности пероксидазы 47
2.2.5 Определение углеводов 48
2.2.5.1 Определение восстанавливающих Сахаров 48
2.2.5.2 Определение целлюлозы 49
2.2.6 Определение массовой доли минеральных элементов: Са, Cu,Zn,MnH Fe 49
2.2.7 Определение биологической ценности кулинарных изделий
с помощью тест-организма Тетрахимена пириформис 49
2.3 Стендовые исследования 51
2.3.1 Варианты кулинарной обработки 51
2.3.2 Варианты замораживания-размораживания 52
2.4 Производственные испытания 52
2.4.1 Технология получения мясных блюд с капустой 52
2.5 Обработка экспериментальных данных 53
3 Результаты исследований 55
3.1 Изменение протеолитическои активности тканей капусты при хранении. Кислые и щелочные протеазы 55
3.2 Локализация протеаз в тканях кочана капусты 58
3.3 Изменение биохимического состава капусты в процессе хранения 59
3.3.1 Изменение витаминов С, Вь В2 и РР 59
3.3.2 Изменение массовой доли минеральных элементов 61
3.3.3 Изменение восстанавливающих Сахаров и целлюлозы 62
3.3.4 Изменение активности пероксидазы 64
3.3.5 Аминокислотный состав белков 65
4. Изменение белкового и протеазного комплекса капусты при тепловой обработке (варка в воде и на пару) 67
4.1 Активность кислых и щелочных протеаз 67
4.2 Электрофоретические спектры 70
5 Повышение протеолитическои активности тканей капусты 71
5.1 Влияние замораживания тканей 71
5.1.1 Изменение электрофоретических спектров белков капусты 72
5.1.2 Изменение активности протеаз 73
6 Влияние способа повышения активности протеаз на биологическую ценность ее в кулинарных изделиях 75
6.1 Изменение аскорбиновой кислоты 75
6.2 Изменение витаминов В і, В2 и РР 80
6.3 Изменение минерального состава 86
6.4 Изменение восстанавливающих Сахаров 88
6.5 Изменение пероксидазы 90
7 Разработка технологии получения мясных кулинарных изделий с повышенной усвояемостью белков 93
7.1 Разработка технологии 94
7.2 Биологическая ценность мясных кулинарных изделий с капустой 101
7.3 Дегустационная оценка кулинарных изделий 103
Выводы и рекомендации 105
Список использованных источников
- Протеазы растительного происхождения
- Гидролиз растительных и животных белков протеазами
- Электрофоретические исследования
- Изменение восстанавливающих Сахаров и целлюлозы
Протеазы растительного происхождения
Самые первые классификации протеаз строились по принципу происхождения ферментов: папаин, фицин и бромелин из растений; трипсин из поджелудочной железы; пепсин и реннин из желудка /67/.
Более поздняя классификация, предложенная Бергманом и Фрутоном /16,32/ гласит, что протеазы подразделяются на экзопептидазы и эндопептидазы.
Протеазы можно классифицировать в зависимости от строения активного центра на кислые протеиназы, металлопротеиназы, тиоловые и сериновые протеазы /60/. Каждый из перечисленных классов образуется целым рядом ферментов, для которых характерен однотипный механизм каталитического действия, обусловленный присутствием в активных центрах соответствующих реакционноспособных групп. Это проявляется, с одной стороны, в существовании специфических для данного класса ингибиторов, с другой - в сходстве диапазона рН, в котором ферменты определенного класса проявляют активность. Специфичность протеаз малопригодна как признак для классификации, так как она определяется зоной связывания фермента, а не ансамблем реакционноспособных групп активного центра, и может вследствии этого существенно варьировать в рамках одного класса. Внутри класса различаются семейства протеиназ. Для ферментов, входящих в семейство, характерны однотипно построенный каталитический центр и эволюционное родство, выраженное в гомологии первичной и сходстве пространственной структуры /38,68/.
Характеристика и свойства В. Я. Зобенко была выделена и исследована аспартильная протеиназа из покоящихся клубней картофеля /24/. По данным гель-фильтрации на сефадексе G-75, молекулярная масса этого фермента равна 22300 Да. Оптимум активности проявляется при рН 3,0-5,0 и температуре 40 С. По данным изоэлектрофокусирования, изоэлектрическая точка находилась при рН 4,2. В 1998 году А. В. Нечепуренко и М. Т. Проскуряков выделили и охарактеризовали 2 трипсино- и 4 химотрипсиноподобных фермента. Молекулярная масса анионного трипсина составляет 25170 Да, катионного - 21900 Да (по данным электрофореза). Химотрипсины с изоточками 4,6;5,6; 6,9; 9,9 имели молекулярные массы 21900, 27650, 23980 и 21250 Да соответственно /43/.
В 1989 году Н. Г. Туманьян и М. Т. Проскуряковым были выделены протеиназы из прорастающих семян риса посредством изоэлектрического фокусирования. Четыре протеиназы расщепляли гемоглобин, шесть - казеин, три - створаживали молочно-ацетатную смесь. Авторы констатировали факт появления новых форм ферментов при прорастании семян риса /64/.
В работах многих авторов было показано, что активность протеолитических ферментов возрастает при прорастании и снижается при созревании семян /16,82,83/.
С. Бжесюк и Т. Межвинской была рассмотрена активность ферментов на фоне снижения жизнеспособности семян. Утилизация запасных белков семян и, следовательно, активность в них гидролаз непосредственно связаны со способностью к прорастанию и дальнейшему развитию проростков. Отсутствие пропорционального снижения активности протеиназ по мере потери семенами всхожести позволило авторам сделать вывод, что определение активности протеолитических ферментов не может быть использовано как биохимический тест качества семян. Но все же, по мере потери зерном всхожести активность протеиназ достоверно падает 161. После хранения в течение года их активность снижается вдвое. О. В. Фурсов сделал вывод, что снижение активности протеиназ зерна кукурузы при длительном хранении объясняется образованием комплексов протеазоингибиторов /46/. Зеленским Г. В. была установлена положительная корреляция активности протеиназ и всхожести длительно хранящихся семян сои. Колебания протеолитической активности, по мнению автора, происходят вследствии периодических изменений в структуре и функции клеток семян или их компонентов /22/. Многими исследователями показано, что протеолитические ферменты выполняют разнообразные физиологические функции в растительных организмах: гидролитический распад запасных белков семян, участие в специфических регуляторных процессах, таких как активация зимогенов, образование гормонов, транспорт белков, а также защитные функции /34,42,70,84/. Из семян лебеды, семядолей семян вигны, латекса хлебного дерева и эндосперма семян риса были выделены ферменты, обладающие высокой протеолитической активностью. Выделенные протеазы гидролизовали гемоглобин в кислой области рН /76,80,103,112/. Английскими учеными были получены три протеиназные фракции из чертополоха. Неочищенный экстракт проявлял оптимальную активность при рН 5,7 и температуре 37 С, обладал низкой свертывающей и высокой протеолитической активностью /138/. Фрис и Гордон с помощью фракционирования белкового комплекса сульфатом аммония, гельфильтрации на сефадексе G-200, ионообменной хроматографии на и афинной хроматографии на гемоглобинсефарозе 4В выделили и изучили кислую протеиназу /77,78,79/. Важную роль в изменении активности протеаз растений играет агротехника, а также условия хранения. Е. В. Ли и Г. П. Карпиленко исследовали активность нейтральных протеиназ, выделенных из зерна пшеницы, выращенной на почвах различной степени окультуренности. Авторами сделан вывод, что наибольшей активностью обладают образцы зерна пшеницы, выращенные на хорошо окультуренной почве и по интенсивной технологии /36,37/.
Гидролиз растительных и животных белков протеазами
Определение свободной аскорбиновой кислоты проводили следующим образом: измельченную навеску материала массой 5 г растирали в фарфоровой ступке и заливали 2 %-ной щавелевой кислотой, оставляли для настаивания на 5 мин. Затем содержимое отфильтровывали, 20 см фильтрата оттитровывали раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.
Определение суммы свободной и связанной аскорбиновой кислоты вели в следующей последовательности: навеску растительного материала растирали в фарфоровой ступке, заливали 1 %-ным раствором соляной кислоты, оставляли для настаивания. Полученный раствор фильтровали и затем оттитровывали раствором 2,6 дихлорфенолиндофенола до появления стойкого розового окрашивания. коэффициент для пересчета. Содержание связанной аскорбиновой кислоты находили по разности между суммой свободной и связанной аскорбиновой кислоты и свободной аскорбиновой кислоты.
Активность пероксидазы определяли методом, основанном на окислении пирогаллола в присутствии перекиси водорода до пурпурогаллина.
Навеску измельченного материала массой 2 грамма растирали с фосфатным буфером в фарфоровой ступке, затем раствор настаивали 30 минут при комнатной температуре, центрифугировали 10-15 минут при 4000 об/мин. В дальнейшем к 1 см центрифугата приливали 10 см пирогаллола и 2 CMJ 1 % перекиси водорода. Содержимое пробирок встряхивали и помещали в термостат с температурой 25 С на 20 минут, затем добавляли 5см 10 % раствора H2SO4 для прекращения действия фермента. Интенсивность окраски образовавшегося пурпурогаллина определяли на ФЭКе с зеленым светофильтром.
Количество восстанавливающих Сахаров проводили по методу Бертрана, основанному на способности редуцирующих Сахаров, обладающих свободной гидроксильной группой, взаимодействовать со щелочным раствором окисной меди (реактивом Фелинга) и восстанавливать ее до закиснои меди, выпадающей в виде осадка красного цвета.
Навеску испытуемого материала растирали в фарфоровой ступке, заливали водой и настаивали на водяной бане при t =40 С в течение 30 минут. К 10 см вытяжки приливали реактив Фелинга и смесь кипятили 3 минуты. Горячую жидкость фильтровали через стеклянный фильтр декантацией (осадок на фильтр не переносится) в колбу Бунзена при слабом отсасывании водоструйным насосом. Осадок заливали раствором сернокислого железа и оттитровывали 0,1 М раствором перманганата до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 1 минуты.
Количество см3 перманганата, затраченное на титрование, умножали на его титр по меди и по таблице находили количество сахара, соответствующее данному количеству меди.
Для определения биологической ценности разработанных блюд с добавлением капусты применили способ с реснитчатой инфузорией Тетрахимена пириформис. Она имеет многие преимущества перед традиционно используемыми лабораторными животными. Размеры инфузории 20+50 мк позволяют иметь в объеме 1 мл среды десятки и сотни тысяч особей. Тем самым стираются индивидуальные различия и получается высоко достоверная информация, что невозможно достичь на высших животных. Период смены поколений 4-6 час, что позволяет определить биологическую ценность продукта за 1 - 2 дня на 8 - 12 поколениях.
Среди 1500 видов простейших Тетрахимена наиболее полно изучена за последние 50 лет. Изучена ее экология, морфология, биология, генетика, воздействие на Тетрахимену различных физических, химических и биологических агентов. Установлена возможность использования ее как модельного организма для первичного тестирования, а также оценки острой, подострой и хронической токсичности и других свойств, вредных факторов, загрязняющих пищевые продукты. Выявлено много общего между показателями жизнедеятельности Тетрохимены и высших животных.
Электрофоретические исследования
Инфузория Тетрахимена пириформис имеет двойной цикл пищеварения: кислотный и щелочной. Многие ее ферментативные системы адекватны ферментным системам высших животных, и для ее роста требуется все незаменимые аминокислоты. Быстрый рост в благоприятных условиях и микроскопические размеры инфузории позволяют получать за короткое время статически достоверные данные, совпадающие с экспериментальными данными исследований, проводимых на высших животных.
В основу метода положен учет числа инфузорий, размножившихся за определенное время в одинаковых условиях при добавлении в пищу стандартного белка (казеина) и испытуемой пробы, в нашем случае -голубцов - содержащих определенное количество азота. Результат выражают в процентах.
При выполнении анализа в сухие и чистые пробирки помещали образцы голубцов и параллельно в другие пробирки - контрольные навески стандартного казеина из расчета 0,4 мг/г общего азота. В пробирки добавляли 0,4 мл основного раствора и 0,5 мл дистиллированной воды.
Пробирки в штативе термостатировали при 85 С в течение 15-20 мин для инактивации посторонней микрофлоры. После охлаждения пробирок до комнатной температуры производили посев 0,02мл трехдневной культуры Тетрахимена пириформис и затем термостатировали при 25 С в течение 4 сут, периодически встряхивая пробирки (через 3 - 6 ч).
По окончании термостатирования содержимое пробирок фиксировали раствором Люголя, брали пробу суспензии и проводили подсчет микроорганизмов в камере Горяева.
Относительная биологическая ценность (ОБЦ) белковых продуктов рассчитывалась по формуле (%):
ОБЦ=К6- 100/Кк, где: К б - количество микроорганизмов, выросших в опытных пробирках с исследуемым белковым веществом;
Варку кочанов капусты, предварительно разрезанных на 4 части, осуществляли в лаборатории кафедры технологии и организации общественного питания КубГТУ по двум вариантам - в кипящей дистиллированной воде и на пару в кастрюлях с перфорированными вставками над кипящей водой, продолжительность обработки 1, 2, 7, 10 минут от начала кипения.
Замораживание кочанов, предварительно разрезанных на 4 части, проводили в морозильных камерах кафедры при температурах -3 С, -6 С, -9 С в течение 1, 3, 5, 8 и 10 часов. Размораживали четвертинки кочанов, упакованные в полиэтиленовые пакеты, на воздухе путем выдерживания при комнатной температуре почти до полного перехода льда в жидкое состояние. Вторым вариантом явилось размораживания путем помещения четвертинок капусты в печь СВЧ.
Блюдом для исследования явились голубцы ленивые. Для их приготовления по разработанному способу проводили следующие операции: белокочанную капусту замораживали в холодильнике при температуре -6 С в течение 5 часов, затем размораживали при комнатной температуре, шинковали соломкой, вводили в смесь говядины, пропущенной через мясорубку, мелко рубленного пассированного лука, сваренного до полуготовности риса, соли, перца и все перемешивали. Формовали голубцы, придавая им цилиндрическую форму. Голубцы панировали в муке, выкладывали на смазанный жиром противень и обжаривали в обжарочном шкафу, после чего заливали томатным соусом и запекали до готовности. Производственные партии мясных блюд с капустой готовили в условиях цеха питания ТО «Премьера» (г.Краснодар).
Для получения достоверности результатов, выявления связей между исследуемыми факторами, а также сокращения количества опытов в экспериментах применяли математические методы. Статистическую обработку вели с использованием программных пакетов "Статистика".
Изменение восстанавливающих Сахаров и целлюлозы
В настоящее время известно несколько способов приготовления голубцов. Известны голубцы с мясом и рисом, состоящие из капусты, говядины (котлетное мясо), крупы рисовой, лука репчатого и маргарина столового, приготовляемые по следующей технологии: кочаны белокочанной капусты кладут в горячую воду, предварительно вырезав из них кочерыгу, варят, периодически снимая с кочанов верхние сварившиеся листья. Их разравнивают, слегка отбивают. На лист капусты укладывают фарш и завертывают его, придавая изделию цилиндрическую форму. Голубцы кладут на смазанный жиром противень и обжаривают в обжарочном шкафу, после чего заливают соусом и запекают /54/.
Недостатком технологии приготовления голубцов с мясом и рисом является варка кочанов капусты перед использованием, в результате которой их биологическая ценность резко снижается из-за перехода водорастворимых веществ в отвар (витаминов группы В, витамина С, минеральных элементов), который затем сливается, а также разрушения их при высоких температурах варки.
Известны также ленивые голубцы, состоящие из капусты, говядины, моркови, репчатого лука, риса, томата, маргарина столового, приготавливаемые по следующей технологии: кочан капусты обдают несколько раз кипящей водой, затем мелко режут и выкладывают половину нормы на дно кастрюли. Нарезанное небольшими кусочками мясо, тертую морковь, лук репчатый, томат отдельно обжаривают на маргарине и выкладывают в кастрюлю с капустой в следующем порядке: мясо, морковь, сырой рис, капуста. Добавляют лавровый лист, перец, немного бульона, соль. Ленивые голубцы тушат на слабом огне, помешивая, 40 минут /1/.
Однако описанная технология приготовления ленивых голубцов обладает теми же недостатками, что и описанная выше.
Нашей задачей было создание голубцов с мясом и рисом, обладающих повышенной пищевой ценностью, лучшей усвояемостью, а также расширение ассортимента выпускаемой продукции предприятиями общественного питания.
Поставленная задача решается за счет того, что изменяется способ обработки капусты до использования: варка капусты заменяется замораживанием-размораживанием. Капусту замораживают при температуре -6 С в течение 5 часов. Размороженную при комнатной температуре капусту шинкуют соломкой, затем вводят в смесь говядины, пропущенную через мясорубку, мелко рубленного пассерованного лука на растительном масле, сваренного до полуготовности риса, соли, перца и все перемешивают, причем, компоненты берут в соотношении, % : мука 1,5 В голубцах с мясом и рисом, приготовленных по заявляемому способу, повышается биологическая ценность продукта за счет снижения потерь, а также повышается усвояемость белков говяжьего мяса, за счет действия протеолитических ферментов, находящихся в капусте.
Замораживание-размораживание капусты способствует сохранению помимо питательных веществ капусты, также, что наиболее важно, повышению активности протеолитических ферментов, гидролизующих белки компонентов рецептуры (белки мяса).
Замена маргарина столового на растительное масло позволяет использовать голубцы, приготовляемые по описанному способу, в заведениях детского и лечебно-профилактического питания.
В таблице 31 указаны изменения биохимического состава (витаминов и протеолитических ферментов), происходящие при различных режимах замораживания белокочанной капусты. Из этой таблицы видно, что оптимальное время замораживания капусты составляет 5 часов при температуре -6 С, т. к. использование более длительного замораживания приводит к излишним затратам электроэнергии, также как и использование более низких температур замораживания при незначительных изменениях биохимического состава. Выбранный режим способствует получению необходимой консистенции капусты после ее размораживания.
Использование замороженной капусты повышает пищевую ценность продукта, а варка - значительно снижает этот показатель. усл.ед. В описанном ранее способе приготовления голубцов, варка кочанов капусты составляет 15 -20 минут, что приводит к потере практически всех водорастворимых веществ капусты. Данные, представленные в таблице 32, указывают на то, что голубцы с мясом и рисом, приготовленные по разработанному способу, наиболее полно отвечают требованиям рационального питания, обладают повышенной биологической ценностью.
Замена варки капусты на замораживание-размораживание улучшает органолептические показатели изделия и способствует его лучшему усвоению.
Разработанная технология, позволяющая использовать
замороженную-размороженную белокочанную капусту при приготовлении голубцов с мясом и рисом, способствует расширению ассортимента выпускаемых предприятиями общественного питания блюд в соответствии с требованиями рационального питания.
Использование замороженной-размороженной капусты и растительного масла при приготовлении голубцов позволяет рекомендовать их для диетического питания.
