Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Закономерности ответа биологических систем на
внешние воздействия. Радиостимуляция 10
Двухфазная реакция 11
Трехфазная дозовая кривая 14
Радиостимуляция растений 16
Фазные изменения всхожести после различных обработок воздушно-сухих семян 18
Объяснение природы радиостимуляции 21
Свободные радикалы в семенах 23
1.2. Старение семян 24
Формализация проблемы старения 24
Факторы, определяющие скорость старения семян
при хранении 30
1.2.3. Физиолого-биохимические нарушения в стареющих
семенах ....». 32
Хромосомные аберрации и повреждения ДНК 33.
Изменения РНК и синтеза белков 35
Изменение ферментов и запасных веществ 36
Изменение дыхания и синтеза АТФ 37
Изменение мембран при старении семян 39
Изменение мембранных белков при старении 42
Свободные радикалы и перекисное окисление
мембранных липидов у семян при старении 45
1.3. Набухание семян 51
Гидратация семени 51
Повреждение семян при набухании 55
Окислительный стресс при набухании семян 58
1.4. Люминесцентные методы анализа качества семян 60
II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 72
II. 1. Объекты
П.2. Действующие факторы
ІІ.2.1. Тепловая обработка
П.2.2. у-облучение 73
П.2.3. Лазерное облучение
ІІ.2.4. Звуковая обработка
П.2.5. Светоимпульсное облучение и обработка
электрическим полем коронного разряда
И.З. Определение всхожести семян 74
П.4. Определение жизнеспособности семян 76
Определение влажности семян 79
Измерение скорости гидратации семян 80
Измерение выхода электролитов 81
П.8. ЯМР определение свободной воды в семенах 82
П.9. Электрохимическое измерение скорости поглощения
кислорода 83
11.10. Интенсивность общего синтеза белка 84
II. 11. Анализ содержания ядерной ДНК 85
Определение состояния ДНК 86
Хемилюминесцентный контроль активных форм кислорода 87
Термохемилюминесценцию регистрировали
Регистрация фосфоресценции при комнатной температуре воздушно-сухих и набухающих семян
II. 16. Измерение спектров послесвечения воздушно-сухих и
набухших семян 88
11.17. Повторность опытов 88
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 89
III. 1. Разработка методов оценки качества индивидуальных 89
семян
III. 1.1. Люминесценция воздушно-сухих семян 90
III. 1.1.1. Исследование свойств замедленной люми
несценции воздушно-сухих семян 90
III. 1.1.2. ФКТ как метод определения влажности сухих
семян и биопрепаратов 108
III. 1.1.3. ФКТ сухих семян как метод оценки всхожести 110 III. 1.1.4. О причине возрастания ФКТ семян при
старении 114
III. 1.1.5.Распределение воздушно-сухих семян по уровню ФКТ как характеристика гетерогенности партии 115 III. 1.2. Оценка состояния набухающих семян бобовых ... 121 III. 1.2.1. Возникновение свечения у набухающих семян 121 III. 1.2.2. Спектральные характеристики свечения
набухающих семян 122
III. 1.2.3 Появление свободной воды и поглощения
кислорода набухающими семенами 124
III. 1.2.4. Свечение набухающих семян как показатель
уровня гипоксии 127
III. 1.3. Разработка термохемилюминесцентно (ТХЛ) метода обнаружения продуктов перекисного окисления липидов и содержания глюкозы в сухих семенах . . 131 III. 1.3.1. ТХЛ регистрация продуктов перекисного
окисления продуктов ненасыщенных жирных кислот в
порошке семян 132
III. 1.3.2. Определение содержания свободной глюкозы в
сухих семенах 135
111.2. Изменение всхожести семян и ФКТ после различных
воздействий 139
Ш.2.1. Всхожесть семян гороха после теплового
воздействия
Ш.2.2. Условия наблюдения парадоксального изменения
всхожести семян 142
111.2.3. Анализ кривых жизнеспособности и всхожести в
пробит координатах 144
Ш.2.4. Всхожесть семян гороха после теплового
воздействия и ФКТ 149
Ш.2.5. Изменение гетерогенности семян гороха по
физиологическим показателям и ФКТ при старении ... 151
Ш.2.6. ФКТ воздушно-сухих семян гороха и их
всхожесть под влиянием ионизирующего облучения .. 157
Ш.2.7. Примеры изменения ФКТ-распределений
воздушно-сухих семян, подвергнутых действию
разных факторов 160
Ш.2.8. Переход семян из фракции во фракцию скачком .. 163
111.3. Свойства семян разных фракций на примере гороха .. 170
Ш.3.1. Поглощение воды семенами разных фракций .... 171
IIL3.2. Взаимосвязь между скоростью набухания и
возникновением дефицита кислорода у семян гороха .. 175 Ш.3.3. Первичные повреждения при гидратации семян и
гипоксия 178
111.3.4. Синтез общих белков 181
Ш.3.5. Процесс репликации ДНК на стадии подготовки
клеток зародышевых осей к первому делению 183
III.3.6. Пост-гипоксический окислительный стресс 186
111.4. Механизм изменения скорости поглощения воды при
переходе из одной фракции в другую. Аквапорины 190
Ш.4.1. Проницаемость клеточных мембран семян для
воды зависит от открытости водных каналов 192
Ш.4.2. Влияния парахлормеркурий бензоата на
набухание семян 194
Ш.4.3. Влияние NaF (ингибитора фосфатазы) на
набухание семян 197
III.5. Последействие в сухих семенах. Механизм
стимуляции всхожести 201
Ш.5.1. Изменение всхожести семян при хранении 201
III.5.2. Изменение всхожести семян при хранении после
у-облучения 207
Ш.5.3. Возможный механизм стимуляции всхожести под
действием внешних факторов 211
IV. ОБСУЖДЕНИЕ 216
ВЫВОДЫ 228
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 230
Приложение - Математическая модель парадоксального
изменения всхожести семян 272
Введение к работе
Актуальность исследования. Существует проблема
разнонаправленного действия больших и малых доз ионизирующей радиации. Если причины повреждающего действия больших доз достаточно хорошо изучены, то вопрос о стимулирующем действии малых доз до сих пор остается открытым, несмотря на многочисленные исследования в этой области. Интерес к проблеме вызван перспективой использования явления радиационной стимуляции растений в сельском хозяйстве с целью увеличения продуктивности растений и получения более высокого урожая.
Большинство работ по радиостимуляции растений выполнено путем облучения элитных семян, результат наблюдают по урожаю. Однако урожай в первую очередь зависит от всхожести семян, ее уменьшение даже на 10-20% приводит к двух-трех-кратному снижению урожая.
При хранении семена старятся, качество и всхожесть семян снижаются, поэтому в партии семян, хранившейся несколько лет, присутствуют сильные семена, слабые (живые, но не прорастающие) и мертвые.
Известны приемы предпосевной обработки семян, с помощью которых можно увеличить всхожесть семян, утраченную при хранении. Ионизирующая радиация в малых дозах, озвучивание, кратковременная тепловая и ударно-волновая обработки, экспонирование в электрическом и магнитных полях, лазерное облучение, предпосевное замачивание в растворах биологически активных веществ и др. могут увеличить всхожесть семян, скорость роста растений и урожай на 15-25%.
Возникает естественный вопрос, каким образом воздушно-сухие семена, которые годами старели, накапливали повреждения и теряли всхожесть, в результате кратковременной предпосевной обработки приобретают способность прорастать. Для того чтобы ответить на этот вопрос, надо, прежде всего, иметь представление, какие изменения в стареющих семенах приводят к снижению всхожести - появлению не прорастающих, но живых семян. Всхожесть может быть увеличена только за счет этих семян.
Старение и гибель семян обусловлены нарушением целостности клеточных мембран и повреждением ДНК. Предполагают, что это вызвано продуктами свободнорадикального перекисного окисления мембранных липидов. Процесс старения семян уподабливают окислительному стрессу. В последние годы обратили внимание на то, что старение семян, как и животных и человека, сопряжено с процессом неферментативного гликозилирования белков и нуклеиновых кислот (реакция Амадори-Майларда).
Существует гипотезы, объясняющие стимуляцию жизнедеятельности растительного организма, слабыми воздействиями. Одна из них предполагает, что уровень метаболизма возрастает из-за ослабления контроля со стороны регуляторных механизмов, которые в норме ограничивают функциональную активность клетки, то есть имеет место проявления правила Арндта-Шульца. Согласно другой распространенной гипотезе стимуляция роста и развития растения трактуется как следствие гиперфункции репарационных процессов в ответ на первоначальное повреждение и появление малых количеств клеточных токсинов.
У организмов в состоянии метаболического покоя (воздушно-сухие семена, пыльца, споры и др.) считают, что облучение в малых дозах и другие физические воздействия оставляют в клетках скрытые
(потенциальные) повреждения, которые реализуются во время перехода клеток в жизнедеятельное состояние. Естественно, что предполагаемые механизмы стимуляции могут включаться у семян только во время их прорастания. Но еще до набухания в облученном семени развиваются пострадиационные физико-химические процессы. Так, после больших доз облучения состояние семян в процессе хранения ухудшается, они теряют всхожесть («эффект хранения»). Эффект стимуляции растений из семян, облученных в малых дозах, при затягивании сроков высева пропадает.
Для стимуляции всхожести воздействию обычно подвергают неоднородные партии хранящихся семян, состоящие из фракций сильных, слабых и мертвых. Поскольку увеличить всхожести партии семян можно лишь за счет живых семян, которые не прорастают при данных условиях, то для исследования механизма стимулирующего действия у-радиации и других факторов необходимо иметь воздушно-сухие семена однородные по качеству. Но задача деления партии таких семян на фракции разного качества до проращивания до сих пор практически не была решена.
Цель и задачи исследования
Целью работы было выявить, каким образом сухие семена, которые годами накапливали повреждения и теряли всхожесть, в результате кратковременной обработки приобретают способность прорастать.
В задачи работы входило:
разработка люминесцентного метода анализа качественного состава партий воздушно-сухих семян и прогнозирования их всхожести без проращивания;
установление взаимосвязи между люминесцентными характеристиками индивидуальных сухих семян и качеством
вырастающих из них проростков;
исследование влияния ионизирующей радиации и других факторов, обычно используемых для стимуляции всхожести, на качественный состав партии сухих семян;
выяснение причины, препятствующей прорастанию ослабленных семян и роли окислительного стресса в образовании проростков с морфологическими дефектами;
исследование динамики всхожести семян в период после действия на семена ионизирующего излучения и тепловой обработки.
В результате нашей работы разработан люминесцентный метод —
регистрация фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) для фракционирования воздушно-сухих семян по их качеству. С его
помощью в распределении партии семян по уровню ФКТ можно выделить три дискретные фракции. Из сильных семян фракции I высокого качества вырастают нормальные проростки, из слабых семян фракции II - проростки с морфологическими дефектами, семена фракции III — мертвые. При стимулирующем всхожесть воздействии число семян во фракции I растет за счет сокращения количества их во фракции II.
Уменьшение всхожести семян бобовых (горох, соя) при старении обусловлено увеличением проницаемости клеточных мембран для воды вследствие нарушения функции аквапориновых каналов. Открытые при хранении клеточные водные каналы у семян фракции II не закрываются во время набухания из-за прекращения дефосфорилирования аквапоринов. Быстрое набухание семени создает дефицит кислорода у зародыша и последующий пост-гипоксический окислительный стресс (повреждение мембран и деградация ДНК).
Стимуляция всхожести семян низкого качества факторами разной природы вызвана замедлением их набухания после необратимого
закрывания водных каналов, вызванного, по-видимому,
неферментативным гликозилированием белков.
Гликозилирование белков является первой стадией известного процесса старения - необратимой реакции Амадори-Майларда не только семян, но и человека и животных. Отсюда следует, что стимуляция всхожести семян происходит не из-за восстановления возникших ранее повреждений, а является дальнейшим их развитием. Именно поэтому «улучшенные» семена теряют всхожесть и жизнеспособность значительно быстрее, чем не стимулированные любыми факторами.
