Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Транспорт нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих 8
1. 1.1. Механизмы транспорта нуклеиновых кислот в клетки 8
1.1.2. Методы изучения транспорта нуклеиновых кислот в клетки 12
1.1.3. Проблемы, связанные с использованием флуоресценции для изучения
транспорта нуклеиновых кислот в клетки, 14
1.1.3.1. Тушение флуоресценции 14
1.1.3.2. Использование реагентов, предотвращающих выгорание флуорохрома 16
1.1.3.3. Флуоресценция флуорохрома в составе нуклеиновых кислот 19
1.1.4. Транспорт флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов в клетки 23
1.2. Участие белков в транспорте нуклеиновых кислот в клетки 28
1.2.1. Выявление белков, участвующих в транспорте нуклеиновых кислот 28
1.2.2. Идентификация белков, участвующих в транспорте нуклеиновых кислот 39
1.2.2.1. Связывание нуклеиновых кислот с глицеральдегид-3*-фосфатдегидрогеназой .39
1.2.2.2. Связывание нуклеиновых кислот с альбумином 41
1.2.2.3. Белки, ответственные за транспорт нуклеиновых кислот в сперматозоиды 41
1.2.2.4. Связывание G-богатых олигонуклеотидов с пуклеолипом 43
1.2.2.5. Эзрин и моезин - компоненты транспортной системы 44
1.2.2.6. NACh - мембранный канал, транспортирующий короткие одноцепочечные
нуклеиновые кислоты 44
1.2.2.7. Каналы для транспорта нуклеиновых кислот могут формироваться из факторов транскрипции 45
1.2.3.7. MNAB - мембранный белок, связывающий нуклеиновые кислоты 45
1.2.2.7. Гепарин-связывающий интегрин Мас-1 46
1.2.2.10. Белки, участвующие в реализации иммуностимулирующего действия CpG ДНК 47
1.2.2.11. Участие скавенджер-рецептора в связывании и транспорте нуклеиновых кислот 48
1.2.2.12. Заключение 50
2. Материалы и методы 52
2.1. Материалы 52
2.2. Получение и очистка 2Р — меченых олигонуклеотидов 52
2.3. Синтез модифицированных олигонуклеотидов 53
2.4. Клетки и условия их культивирования 58
2.5. Приготовление слайдов и микроскопия .58
2.6. Аффинная модификация белков, связывающих нуклеиновые кислоты 59
2.7. Исследование специфичности аффинной модификации белков 60
2.8. Исследование локализации белков, связывающих нуклеиновые кислоты 60
2.9. Влияние целостности клеточной мембраны па модификацию белков, связывающих нуклеиновые кислоты, и внутриклеточный транспорт олигонуклеотидов 60
2.10. Определение констант диссоциации комплексов олигонуклеотид-белок и определение количества олигонуклеотид-связывающих белков на клетках 61
2.11. Получение и характеризация антител против флуоресцеина 61
2.12. Иммуноферментиое окрашивание 62
2.13. Аффинная хроматография олигонуклеотид-связывающих белков, модифицированных Flu-lys-p(N)i6-deg-Uo на ультрагелс А2 с иммобилизованными антителами против флуоресцеина 62
2.14. Синтез пептидов и изготовление конъюгатов этих пептидов с бычьим сывороточным альбумином 63
2.15. Приготовление человеческого сывороточного альбумина для иммунизации кроликов 65
2.16. Синтез сорбентов для выделения специфических антител против пептидов и человеческого сывороточного альбумина 65
2.17. Получение и характеризация антител против К1, К2е и альбумина 66
3. Результаты и обсуждение 67
3.1. Аффинная модификация реакционноспособными производными олигонуклеотидов поверхностных белков клеток различного тканевого происхождения 67
3.2. Влияние условий инкубации аффинных реагентов с клетками на аффинную модификацию олигонуклеотид-связывающих белков 76
3.3. Влияние ингибиторов активного транспорта на модификацию белков 78
3.4. Исследование локализации модифицированных белков 80
3.5. Влияние состояния клеточной мембраны на аффинную модификацию олигонуклеотид-связывающих белков и транспорт олигонуклеотидов в клетки 82
3.6. Оценка количества олигонуклеотид-связывающих белков на поверхности клетки 86
3.7. Реакционноспособные олигонуклеотидные реагенты 87
3.8. Исследование транспорта флуоресцентно-меченых производных олигонуклеотидов в клетки различных линий 91
3.9. Исследование эффективности модификации поверхностных белков клеток линии А431 различными производными олигонуклеотидов 94
3.10. Исследование модификации клеток линии А431 реакционноспособными производными флуоресцентно-меченого олигонуклеотида 98
3.11. Получение антител против флуоресцеина и их взаимодействие с флуоресцеин-содержащимиолигонуклеотидами 100
3.12. Оптимизация условий выделения модифицированных белков, связывающих нуклеиновые кислоты, на сорбенте с антителами против флуоресцеина 102
3.13. Выделение белков, связывающих нуклеиновые кислоты 103
3.14. Идентификация олигонуклеотид-связывающих белков 105
3.15. Изготовление конъюгатов и сорбентов па основе пептидов 106
3.16. Получение и тестирование антител против альбумина и пептидов р19ир13 107
3.17. Исследование клеточной локализации выделенных белков 110
3.18. Компьютерный анализ структуры альбумина 113
Выводы 116
Список литературы 118
- Методы изучения транспорта нуклеиновых кислот в клетки
- Участие скавенджер-рецептора в связывании и транспорте нуклеиновых кислот
- Синтез модифицированных олигонуклеотидов
- Влияние ингибиторов активного транспорта на модификацию белков
Введение к работе
Регуляция экспрессии генов за счет воздействия на нуклеиновые кислоты клетки интенсивно исследуется в последнее время [1, 2]. В частности, для регуляции экспрессии генов было предложено использовать антисмысловые олигонуклсотиды и их химические аналоги [3,4, 5]. В экспериментах на культурах тканей было показано, что антисмысловые олигонуклеотиды ингибируют экспрессию генов за счет комплементарных взаимодействий [6, 7, 8, 9, 10], препятствуя процессу транскрипции [11] или трансляции [12]. Комплементарные олигонуклеотиды были успешно использованы для коррекции точечных мутаций [13] и ошибок сплайсинга [14]. В последнее время для ингибирования экспрессии генов используется явление РНК интерференции - избирательного подавления экспрессии генов под действием двуцепочечных РНК [15], строго гомологичных мРНК мишени [16]. РНК интерференция стала мощным механизмом исследования роли определенных генов не только у простейших организмов, но и у млекопитающих [17]. Молекулы ДНК также могут вносить вклад в регуляцию экспрессии генов, поскольку могут выступать в качестве кодирующих последовательностей для синтеза белков. Продемонстрирована способность генноинженерных конструкций экспрессировать в клетках организма чужеродные белки, что позволяет корректировать генетические дефекты [18] и создавать генноинженерные вакцины для защиты организма от инфекционных заболеваний [19]. В ряде работ отмечены такие эффекты нуклеиновых кислот, как активация иммунной системы под действием рибонуклеиновых кислот, CpG богатых ДНК [20, 21] и олигонуклеотидов [22, 23], а также влияние фосфоротиоатных олитонуклеотидов на гемопоэз, сердечный ритм и артериальное давление [24].
Очевидно, что для специфического взаимодействия с нуклеиновой кислотой — мишенью - антисмысловые олигонуклеотиды или интерферирующая РНК должны попасть в клеточные компартменты, в то время как другие эффекты могут быть вызваны специфическим связыванием нуклеиновых кислот - аптамеров — с рецепторами клеточной поверхности. Поскольку кератиноциты способны поглощать олигонуклеотиды в значительных количествах и накапливать их в ядре [25], эти клетки представляют собой прекрасную модель для изучения природных механизмов транспорта нуклеиновых кислот и белков, отвечающих за их рецепцию и транспорт.
Исследование взаимодействия нуклеиновых кислот с клетками различных тканей, выявление механизмов естественного транспорта нуклеиновых кислот в клетки позволит разработать универсальные подходы к борьбе с инфекционными, онкологическими и наследственными заболеваниями. Кроме того, исследование природных механизмов транспорта нуклеиновых кислот представляет огромный интерес в связи с открытием внеклеточных нуклеиновых кислот, роль и функции которых в настоящее время практически неизвестны [26].
Центральную роль в транспорте молекул через биологические мембраны занимают белки, которые, собственно, и осуществляют рецепцию и транспорт. В настоящее время описаны клеточные белки, экспонированные на плазматической мембране и участвующие в связывании нуклеиновых кислот. Однако в силу того, что для выявления и идентификации белков были использованы клетки различных тканей, использованы различные подходы к визуализации белков и различные по последовательности и химическому строению олигонуклеотиды, до сих пор не ясно, насколько выявленные белки универсальны и какова их роль в рецепции и транспорте нуклеиновых кислот.
Целью настоящей работы было исследование поверхностных белков клеток различного тканевого происхождения и в том числе кератиноцитов, участвующих в узнавании и транспорте нуклеиновых кислот в клетки.
В процессе выполнения поставленной цели необходими было решить следующие задачи:
Выяснить, являются ли олигонуклеотид-связывающие белки универсальными или же различные клетки экспрессируют различные олигонуклеотид-связывающие белки.
Определить, какие факторы могут влиять на модификацию белков производными олигонуклеотидов и транспорт олигонуклеотидов в клетки.
Разработать метод выделения поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков, участвующих в транспорте нуклеиновых кислот в клетки.
Выделить и идентифицировать данные белки.
Получить против идентифицированных белков антитела и с их помощью исследовать локализацию этих белков в клетке и их роль в транспорте нуклеиновых кислот.
Методы изучения транспорта нуклеиновых кислот в клетки
Для того чтобы выяснить механизм транспорта нуклеиновых кислот и механизм их воздействия на процессы, происходящие в клетке, необходимо в первую очередь определить, через какие компартмепты пролегает путь нуклеиновых кислот и что является конечным пунктом назначения. Одним из методов определения локализации радиоактивно-меченых олигонуклеотидов, проникших в клетки, является разделение клеток на фракции [54]. Для получения фракций могут использоваться различные физические параметры (электрический заряд при разделении электрофорезом) или биологические свойства (аффинность лигандов при выделении при помощи антител) [55]. Наибольшее распространение получил метод разделения на фракции при помощи центрифугирования. На первой стадии, как правило, клетки гомогенизируют и осаждают ядра при 3000g. ПолученыЙ супернатант можно разделить различными способами. Во-первых, при помощи высокоскоростного центрифугирования (lOOOOOg) можно осадить все мембранные структуры. Таким образом, получается разделение на три фракции: ядро, мембранная фракция и цитозоль [56, 57]. Во-вторых, полученный после осаждения ядер супернатант можно фракционировать, используя центрифугирование в градинте плотности [58]. Этот метод был успешно использован для разделения ранних и поздних эндосом [59], выделения интактного аппарата Гольджи [60, 61] и транспортных везикул [62]. Распределение мембранных структур в градиенте плотности зависит, большей частью, от соотношения липидов и белков, так, например, внутренняя мембрана митохондрий обогащена белками и за счет этого имеет большую плотность, а эндосомальные мембраны, наоборот, содержат много липидов и, соответственно, имеют малую плотность. С другой стороны, содержимое везикул также влияет на распределение, так, например, секреторные липопротеины низкой плотности, содержащиеся в аппарате Гольджи, уменьшают его плотность, а белки, содержащиеся в секреторных гранулах, увеличивают плотность. Также влияют и различные компоненты, связанные с мембранами - рибосомы на шероховатом ЭПР или клатрин на окаймленных везикулах [55]. Кроме того, даже состав градиента может влиять на распределение фракций. Наиболее часто используется центрифугирование в градиенте сахарозы, однако такие вещества, как Ficoll, Percoll, Nycodenz или Metrizamide, также нашли свое применение [61, 63, 64]. Несмотря на свое широкое распространение, метод фракционирования имеет ряд ограничений. Во-первых, если разделение на мембранно-цитозольнуто и ядерную фракции представляется достаточно простой процедурой, то получение фракций различных органелл и везикулярных структур требует специального оборудования и представляет собой отдельную задачу. Во-вторых, клеточные фракции, как правило, не удается получить в чистом виде, они могут содержать примеси других фракций [65]. В-третьих, нет гарантии, что олигонуклеотиды в процессе приготовления этих фракций останутся в тех же компартментах и, таким образом, картина распределения олигопуклеотидов по полученным фракциям не будет отличаться от картины распределения в интактной клетке.
Методы микроскопического исследования лишены опасности перераспределения нуклеиновых кислот между клеточными компартментами в связи с нарушением их целостности, хотя очевидно, что процесс пробоподготовки может влиять на интенсивность и распределение сигнала от нуклеиновых кислот в клетке. Тем не менее, при использовании электронной микроскопии уровень разрешения и достоверность результатов резко повышается [66, 67]. Однако данный метод редко используется из-за сложности технического и аппаратурного исполнения.
Флуоресцентная микроскопия, казалось бы, является идеальным методом для исследования проникновения флуоресцентно-меченых нуклеиновых кислот. Это достаточно простой и не дорогой метод (по крайней мере, флуоресцентный микроскоп гораздо доступнее электронного). Однако на достоверность данных, полученных при помощи флуоресцентной микроскопии, также может влиять ряд факторов, которым и посвящена следующая глава.
К тушению флуоресценции может приводить множество процессов, в том числе реакции в возбужденном состоянии, перенос энергии, образование комплексов (статическое тушение) и тушение при столкновении (динамическое тушение).
К настоящему моменту известно множество тушителей флуоресценции. Один из наиболее известных динамических тушителей - молекулярный кислород, который тушит флуоресценцию почти всех известных флуорофоров. Другие диффузионные тушители: ксенон, пероксид водорода [68], акриламид, оксид диазота, иитрометаи, иитроксиды [69], ионы BKV [70] и Г [71]. Кроме того, тушителями являются многие галоген содержащие вещества: хлороформ, трихлорэтанол [72], бромбензол, хлорид метилртути [73] и различные соединения, содержащие более одного атома хлора. Так, индол, карбазол и их производные уникально чувствительны к тушению хлорированными углеводородами [74] и акцепторами элсктронов, такими, как протоны, гистидип, цистеин, фумарат, NO3", Си2+, Pb2+, Cd2+ и Мп2+ [75]. Тушение этими веществами, вероятно, включает перенос электрона от флуорофора на тушитель. Кроме того, индол, триптофан и их производные тушатся сукцинимидом, дихлорацетамидом, гидрохлоридами пиридина и имидазола, метионином, Fe3+,Ag+,HCs+[76].
Ароматические и алифатические амины являются эффективными тушителями для флуоресценции большинства незамещенных ароматических углеводородов. Например, флуоресценция антрацена эффективно тушится диэтиленанилином за счет образования комплекса с переносом заряда.
Кроме того, тушителями могут быть также пурины и пиримидины, N-метилникотинамиды и N-алкилпиридиниевые и пиколиниевые соли [77]. Например, флуоресценция FAD и восстановленного NADH тушится адениновой частью молекулы. Различают два типа процессов, приводящих к тушению флуоресценции: статический и динамический. Тушение флуоресценции ф лавина происходит вследствие как статистических, так и динамических процессов, в то время как тушение дигидроникатинамида является в основном динамическим. При динамическом тушении происходит уменьшение времени затухания флуоресценции, поскольку тушение представляет собой дополнительный конкурирующий процесс, дезактивирующий возбужденное состояние без испускания флуоресценции. При статическом тушении часть флуорофоров не возмущена, поскольку находится в комплексе с тушителем, и, следовательно, время затухания не зависит от присутствия статического тушителя. При увеличении температуры усиливается диффузия, что приводит к более частым столкновениям динамических тушителей с флуорофором. Стабильность комплексов статических тушителей при росте температуры уменьшается и, как следствие, меньшее количество флуорофоров находится в комплексе с тушителем. Таким образом, при росте температуры увеличивается динамическое тушение и уменьшается статическое. Следует отметить, что динамическое тушение влияет только на возбужденные состояния и не изменяет спектры поглощения. В противоположность этому образование комплексов в основном состоянии при статическом тушении часто приводит к возмущению спектра поглощения флуорофора.
Участие скавенджер-рецептора в связывании и транспорте нуклеиновых кислот
Kimura и соавторы обнаружили, что олигопуклеотиды, обладающие иммуностимулирующим действием, ингибируют связывание ацетилированного липопротеипа со скавенджер-рецептором мышиных спленоцитов. Добавление декстран сульфата и поливинил сульфата ингибировало активацию спленоцитов олигонуклеотидами. Было высказано предположение, что для реализации иммуностимулирующего действия олигонуклеотидов необходимо их связывание со скавенджер-рецептором [183]. Впоследствии появился ряд работ, подтверждающих взаимодействие скавенжер-рецепторов и нуклеиновыми кислотами. Так, Bijsterbosch и соавторы показали, что при инъекции крысам антисмысловах фосфоротиоатных олигонуклеотидов основная масса радиоактивного материала быстро накапливается в печени, костном мозге и почках (время полувыведения олигонуклеотидов из кровотока 24 минуты). Распределение введенных олигонуклеотидов по тканям печени строго соответствовало распределению ацетилированного липопротеина низкой плотности (классического лиганда для скавенджер-рецептора типа AI/AII), максимальное накопление фосфоротиатов наблюдалось в эндотелиальных клетках печени. Для проверки гипотезы об участии скавенджер-рецептора типа AI/AII в накоплении олигонуклеотидов авторы предварительно вводили крысам poly-l и poly-A [184]. Ранее было показано, что poly-I и poly-G являются лигандами для скавенджер-рецептора, a poly-C и poly-A имеют другую четвертичную структуру и поэтому не взаимодействуют со скавенджер-рецептором [185]. С другой стороны, Suzuki и соавторы показали, что четвертичная структура важна только для образования агрегатов олигонуклеотидов, которые, в свою очередь, и связываются со скавенжер рецептором, а не образующие агрегатов олигонуклеотиды со скавенжер рецептором не связываются вне зависимости от своей структуры [186]. Bijsterbosch и соавторами было показано, что введение poly-I значительно препятствует выведению олигонуклеотидов из крови, в то время как poly-Л не оказывает заметного влияния на фармакокинетику. Накопление олигонуклеотидов печенью и костным мозгом было насыщаемым и ингибировалось poly-I, но не poly-A, что, по мнению авторов, свидетельствует о том, что в этих органах связывание и интернализация олигонуклеотидов обусловлены скавенджер-рецепторами типа AVAIL Интересно, что в почках накопление, наоборот, ингибировалось poly-А, но не poly-I, что заставило авторов предположить наличие в почках другого типа скавенджер-рецептора. Поглощение олигонуклеотидов селезенкой, мышцами и кожей было незначительным, слабо зависело от дозы олигонуклеотидов и не ингибировалось ни poly-I, ни poly-A [184]. Аналогичные результаты были получены Steward и соавторами, которые показали, что введение мышам известных субстратов для скавенджер-рецептора (декстран сульфат, фукоидан и poly-I) значительно уменьшает накопление фосфоротиоатных олигонуклеотидов печенью и селезенкой и незначительно увеличивает накопление скелетными мышцами. Введение полианионов, не являющихся субстратом для скавенджер-рецептора (хондроитин сульфат и poly-C), не влияет на распределение олигонуклеотидов по тканям. Введение декстран сульфата крысам также уменьшает накопление фосфоротиоатных олигонуклеотидов печенью и увеличивает накопление скелетными мышцами. При этом накопление олигонуклеотидов в почках уменьшается, однако увеличивается количество олигонуклеотидов, выводимых с мочой, что, как было показано, связано с уменьшением реабсорбции олигонуклеотидов в проксимальных канальцах. Добавление декстран сульфата и фукоидана также значительно уменьшает накопление фосфоротиоатных олигонуклеотидов клетками линии J774 (мышиные макрофаги), а хондроитин сульфат не влияет на связывание олигонуклеотидов с клетками [187].
Однако работы последних лет заставили пересмотреть роль скавенжер-рецепторов в связывании и транспорте нуклеиновых кислот. Так, Benimetscaya и соавторы показали, что такие лиганды для скавеижер-рецептора, как окисленный или ацетилированный липопротеин и метилированный БСА, не влияют на связывание флуоресцеин-меченого 28-звенного цитидинового фосфоротиатного олигонуклеотида с макрофагами и клетками микроглии человека [167]. Такакига и соавторы показали, что поглощение плазмидной ДНК культивируемыми ооцитами китайского хомячка (СНО), экспрессирующими скавенджер-рецептор класса A (SRA), незначительно и практически идентично уровню поглощения клетками СНО дикого типа, а макрофаги из мышей, дефицитных по SRA, связывают и поглощают плазмидную ДНК так же, как и макрофаги из контрольных мышей. В обоих типах макрофагов связывание и поглощение плазмидной ДНК значительно ингибировалось немеченой ДНК, poly-I и декстран сульфатом, но не ингибировалось poly-A и ацстилированным липопротеином. Эти данные, по мнению авторов, свидетельствуют о том что связывание и поглощение плазмидной ДНК перитонеальньши макрофагами обусловлено механизмом, схожим с механизмом связывания полианионов скавенджер-рецептором, но собственно скавенджер-рецептор не имеет отношения к связыванию и поглощению плазмидной ДНК [188]. Аналогичные данные были получены Butler и соавторами при сравнении мышей, дефицитных по SRA и дикого типа. Было показано, что при внутривенном введении фосфоротиатных олигонуклеотидов картина их накопления и распределения в тканях и клетках идентична для обоих типов мышей, кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды против A-raf уменьшали уровень м-РНК A-raf в одинаковой степени. Аналогичные данные были получены на перитонеальных макрофагах из тех же линий мышей [189]. Fu-Gang Zhu и соавторы на макрофагах из мышей, дефицитных по SRA и дикого типа, показали, что CpG олигонуклеотиды и бактериальная ДНК стимулировали производство IL-12 в макрофагах обоих типов, а контрольные олигонуклеотиды и ДНК из тимуса теленка не обладали иммуностимулирующим действием. При помощи конфокальной микроскопии было показано, что флуоресцентно- меченые олигонуклеотиды накапливались в цитоплазме и были коллокализованы с декстран сульфатом, который транспортировался в клетки по механизму пиноцитоза. Уровень проникновения олигонуклеотидов и картина распределения были идентичны для макрофагов обоих типов. Эти данные позволили авторам сделать вывод, что хотя SRA и способен связывать ДНК, этот рецептор не важен для поглощения CpG олигонуклеотидов и бактериальной ДНК и проявления их иммуностимулирующих свойств [190].
Следует отметить, что история со скавенджер-рецептором - это далеко не единственный случай, когда сделанное открытие впоследствии не подтверждается другими работами. В области исследования белков, осуществляющих рецепцию и транспорт нуклеиновых кислот в клетки, это становится правилом. Так, например, Diesback и соавторы выделили клеточный белок с мол. массой 66 кДа из гепатоцитов линии HepG2 (карцинома печени человека) при помощи фотоаффинной модификации биотинилированным конъюгатом олигонуклеотида с бензофеноном. Было показано, что связывание олигонуклеотидного реагента с выделенным белком является насыщаемым и конкурентно ингибируется немеченой ДНК. Практически весь модифицированный белок с мол. массой 66 кДа находился в мембранной фракции. Около половины связанного с олигонуклеотидом белка подвергалось поверхностному протеолизу, что предполагает локализацию этого белка как на клеточной поверхности, так и в везикулярных цитоплазматических структурах. Сиквенирование выделенного пептида методом деградации по Эдману не выявило гомологии с известными белками человека [191]. Впоследствии авторами было показано, что олигонуклеотиды проникают в клетки HepG2 двумя различными путями и накапливаются в эндосомоподобных структурах двух типов, сильно отличающихся от обычных эндосом или л изо сом [192], что противоречило данным других авторов. Впоследствии все эти данные получили простое объяснение -выяснилось, что линия клеток HepG2, с которой работали авторы, была заражена Mycoplasma hyorhinis, которая, как было показано, изменяла картину проникновения олигонуклеотидов в клетки. Более того, белок 66 кДа, ранее выделенный из клеток HepG2 как мембранный рецептор для нуклеиновых кислот, оказался инвариантным мембранным белком из Mycoplasma hyorhinis [193].
Синтез модифицированных олигонуклеотидов
Клетки линий А431, HaCat и HeLa рассаживали на 8-луночную камеру (Chamber Slide, Nunc Inc.) из расчета 2-Ю4 клеток на лунку за 1-2 дня до эксперимента. По достижении 60 70% монослоя клетки трижды отмывали средой ДМЕМ без сыворотки и инкубировали в среде ДМЕМ без сыворотки с 1мкМ раствором родамин- или флуоресцеин-меченого олигонуклеотида и в контроле с ЗмкМ раствором родамина (или флуоресцеина) в течение 1 часа при 37С в СОг-инкубаторе. После инкубации клетки трижды отмывали от избытка реагента средой ДМЕМ без сыворотки, фиксировали 3.7% формалином в ДМЕМ в течение 15 мий, дважды отмывали физраствором и окрашивали в растворе Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, МО) (50 нг/мл) в течение 5 мин. После окрашивания клетки трижды отмывали физраствором, отделяли предметное стекло с клетками от камеры, удаляли избыток физраствора фильтровальной бумагой, наслаивали среду для поддержания флуоресценции (DACO Fluorescent mounting medium), накрывали покровным стеклом и анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии. Использовались фильтры: возбуждение -BP340-380nm, испускание - ІЛЧЗОшп для Hoechst; возбуждение - BP515-560nm, испускание - LP-590nm для родамина pH 10,0 и восстанавливали основание Шиффа раствором NaBbU (0.4 мг/мл) 10 мин. Полученный коньюгат отделяли от компонентов реакционной смеси гель-фильтрацией на Сефадексе G-25 и инкубировали с флуоресцешшзотиоцианатом (FITC) или родаминизотиоционатом (RITC) в 0.1 М №гСОз в течение 4-х часов при комнатной температуре. Полученные реагенты отделяли от компонентов реакционной смеси гель-фильтрацией на сефадексе G-25 и очищали электрофорезом в 20% ПААГ с 7 М мочевиной с последующей электроэлюцией, как описано ранее. Выход полученных производных составлял 50-60%. Для присоединения флуорссцсина и родамина к (N)i6-Nll и p(N)i6-NH инкубировали олигонуклеотиды с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) или родаминизотиоционатом (RITC) в 0.1 М NazCCh в течение 4-х часов при комнатной температуре. Полученные реагенты отделяли от компонентов реакционной смеси гель-фильтрацией на сефадексе G-25 и очищали электрофорезом в 20% ПААГ с 7 М мочевиной с последующей электроэлюцией, как описано ранее. Выход полученных производных (12-15) составлял 95%. Для присоединения к олигонуклеотиду остатка малеимида (МаМ) по 5 -копцевому фосфату (производное 4) к активированному фосфату присоединяли 1,5-диаминопентан, как описано ранее. Модифицированный олигонуклеотид выделяли гель-фильтрацией на Сефадексе G-25 и инкубировали в 50% ДМСО с трехкратным мольным избытком 4-(Ы-малеимидометил)циклогексан-1 -карбоновой кислоты N-гидроксисукцинимидиого эфира [202]. Избыток реагента удаляли гель-фильтрацией на Сефадексе G-25. Концентрацию малеимидных групп определяли по уменьшению оптической плотности на 412 нм ( 6 - 13600 для 2-иитро-5-бензоата) в реакции реактива Эллмана (5-5 -дитиобис(2-нитробензойной кислоты)) с 2-меркаптоэтанолом в отсутствии и в присутсвии модифицированного олигонуклеотида. Для присоединения к олигопуклеотидам остатка малеимида по 3 - концу (производные 6 и 7) окисляли p(N)i6-deg-rU или Flu-p(N)i6-deg-rU 0,01 М NaI04 в течение 10 мин при комнатной температуре, инкубировали 1час при комнатной температуре с 0,1 М лизином рН 10,0 и восстанавливали основание Шиффа раствором NaBbLt (0.4 мг/мл) 10 мин. Полученный коньюгат отделяли от компонентов реакционной смеси гель фильтрацией на Сефадексе G-25 и инкубировали в 50% ДМСО с трехкратным мольным избытком 4-(М-малеимидометил)циклогексан-1 -карбоновой кислоты N-гидроксисукцинимидіюго эфира [201]. Избыток реагента удаляли гель-фильтрацией на Сефадексе G-25 и определяли концентрацию малеимидных групп, как описано ранее. В работе использовались клеточные линии, перечисленные в Таблице 5. Клетки культивировали в среде ДМЕМ (Sigma), содержащей 10% ЭТС и антибиотики (пенициллин и стрептомицин, 100 ед/мл). Для экспериментов по аффинной модификации клетки рассевали в лунки 24-ячеечных планшетов за 2-3 дня до эксперимента. Монослойные культуры клеток использовали в плотности не более 70% от монослоя, суспензионные в плотности не более 0,8х106 кл/мл. Жизнеспособность клеток определяли окрашиванием клеток трипановым синим. Клетки линий А431, HaCat и HeLa рассаживали на 8-луночную камеру (Chamber Slide, Nunc Inc.) из расчета 2-Ю4 клеток на лунку за 1-2 дня до эксперимента. По достижении 60 70% монослоя клетки трижды отмывали средой ДМЕМ без сыворотки и инкубировали в среде ДМЕМ без сыворотки с 1мкМ раствором родамин- или флуоресцеин-меченого олигонуклеотида и в контроле с ЗмкМ раствором родамина (или флуоресцеина) в течение 1 часа при 37С в СОг-инкубаторе. После инкубации клетки трижды отмывали от избытка реагента средой ДМЕМ без сыворотки, фиксировали 3.7% формалином в ДМЕМ в течение 15 мий, дважды отмывали физраствором и окрашивали в растворе Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, МО) (50 нг/мл) в течение 5 мин. После окрашивания клетки трижды отмывали физраствором, отделяли предметное стекло с клетками от камеры, удаляли избыток физраствора фильтровальной бумагой, наслаивали среду для поддержания флуоресценции (DACO Fluorescent mounting medium), накрывали покровным стеклом и анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии. Использовались фильтры: возбуждение -BP340-380nm, испускание - ІЛЧЗОшп для Hoechst; возбуждение - BP515-560nm, испускание - LP-590nm для родамина.
Способность поверхностных белков клеток линии А431 взаимодействовать с олигонуклеотидами исследовали при помощи аффинной модификации реакционноспособными производными олигонуклеотидов. Клетки дважды промывали PBS или средой ДМЕМ и инкубировали с 1 мкМ раствором производного олигонуклеотида в PBS (или в ДМЕМ) в течение 1 ч при 37 С, 5% СОг. После инкубации клетки трижды промывали PBS (или ДМЕМ), соскабливали скрепером, осаждали клетки центрифугированием в течение 3 мин при 3000 об/мин и ресуспендировали осадок клеток в 25 мкл лизирующего буфера, содержащего 0.6% Nonidet Р-40, 50 мМ трис-HCl рН 7.5, 0.15 М NaCl, 5 мМ NaF, 1 мМ PMSF, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na2Mo04 [203]. Клетки инкубировали 5 мин на льду и центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин для разделения мембранно-цитозольной (МЦ) и ядерной (Я) фракций. Супернатант, содержащий мсмбраино-цитозольную фракцию, переносили в другие пробирки, добавляли равный объем буфера нанесения, прогревали 5 мин при 100 С и центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Осадок ядер ресуспендировали в 25 мкл лизирующего буфера, добавляли равный объем буфера нанесения, прогревали 5 мин при 100 С и центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Образцы приготавливали из равного количества клеток. Белки анализировали при помощи SDS-дискэлектрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ. После высушивания геля белки, модифицированные радиоактивно-меченым производным олигонуклеотида, визуализировали при помощи радиоавтографии. Так как модификация белков олигонуклеотидами приводит к изменению подвижности белков, в качестве маркеров мол. массы использовали белки известной мол. массы (лактоферрин, лизоцим и мышиный IgGl), модифицированные тем же олигонуклеотидным реагентом [204].
Для выяснения специфичности связывания белков с реакционноспособными производными олигонуклеотидов клетки инкубировали с 1 мкМ [32Р]-мечеными реакционноспособными производными олигонуклеотидов в присутствии избытка немеченого p(N)i6 (50 мкМ), флуоресцеина (50 мкМ), АТФ (100 мкМ), poly 1С (50 мкг/мл), оц-ДНК (150 мкг/мл), плазмидной ДНК (150 мкг/мл), гепарина (50 мкг/мл) и дскстран сульфата (10 мкг/мл). Приготовление фракций и разделение белков электрофорезом выполняли, как описано в предыдущем разделе.
Влияние ингибиторов активного транспорта на модификацию белков
Аффинный олигонуклеотидный реагент, пригодный для аффинной модификации поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков клеток, с целью последующего выделения ковалентных олигонуклеотид-белковых комплексов должен удовлетворять следующим требованиям. Этот реагент должен нести реакционную группу, позволяющую эффективно модифицировать искомые белки, не уменьшая при этом специфичности аффинного связывания. Реагент должен позволять следить за процессом аффинной модификации, т.е. содержать изотоп Р и нести гаптенную группу для последующего взаимодействия с аффинным сорбентом. В качестве гаптена было предложено использовать молекулу флуоресцеина, поскольку против флуоресцеина можно получить специфические антитела и с помощью флуоресцентной микроскопии следить за распределением в клетке модифицированных флуоресцеином олигопуклеотидов. В качестве реакционных групп были исследованы малеимид, окисленный рибоуридин и C1R. В предварительных экспериментах было обнаружено, что олигонуклеотиды, содержащие рибоуридин, присоединенный через фосфат, слабо модифицировал поверхностные белки (данные не представлены), что было, по-видимому, связано с малым эффективным радиусом действия окисленного рибоуридина в составе олигонуклеотида. Для увеличения эффективного радиуса действия рибоуридин был присоединен через диэтиленгликолевый (deg) или тетраэтиленгликолевый (teg) линкеры.
Рибоуридин связан с олигонуклеотидом через диэтиленгликолевый или тетраэтиленгликолевый линкер в процессе синтеза на автоматическом ДНК-синтезаторе, как описано в «Материалах и методах». Для получения реакционной группы на 3 -конце производных на основе p(N)i6-deg-rU окисляли рибозу концевого рибоуридина 0.01 М NaIC 4 в течение 10 мин непосредственно перед использованием. После модификации клеточных белков полученным производным или присоединения лизина (в процессе синтеза различных производных) восстанавливали основание Шиффа раствором NaBR» (0.4 мг/мл) 10 мин.
Алкилирующую группировку, 4-[(М-2-хлорэтил-М-метил)-амино]бензиламин (таблица 2), присоединяли к 5 -концсвой фосфатной группе олигонуклеотида согласно [198]. Выход производных в синтезе и анализ наличия активного хлора в алкилирующей группировке производных определяли по реакции с 0,5 М тиосульфатом натрия с последующим анализом продуктов реакции электрофорезом в 20% ПААГ с 7 М мочевиной. Выход реакционноспособиых алкилирующих производных по данным электрофоретического анализа реакционной смеси составлял не менее 90%.
Для получения 5 -модифицированных олигонуклеотидов активировали 5 -концевой фосфат, как описано ранее [198], присоединяли 1,5-диаминопентана (DAP) или метиловый эфир лизина и модифицировали полученный коньюгат флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), родаминизотиоционатом (RITC) или 4-(К-малсимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты N-гидроксисукцинимидным эфиром [202]. Полученные реагенты очищали электрофорезом в 20%» ПААГ с 7 М мочевиной с последующей электроэлюцией, как описано ранее. Выход полученных производных составлял не менее 85%. Для присоединения к олигонуклеотиду остатка малеимида или флуоресцеина по 3 концу окисляли концевой рибоуридин, как описано ранее, присоединяли лизин и модифицировали полученный коньюгат флуоресцеинизотиоцианатом, родаминизотиоционатом или 4-(К-малеимидометил)циклогексан-1 -карболовой кислоты N-гидроксисукцинимидным эфиром [202]. Полученные реагенты очищали электрофорезом в 20% ПААГ с 7 М мочевиной с последующей электроэлюцией, как описано ранее. Выход полученных производных составлял 50%, что было связано с низкой эффективностью присоединения лизина к рибоуридину. Концентрацию малеимидных групп определяли но уменьшению оптической плотности на 412 нм (б = 13600 для 2-нитро-5-бензоата) в реакции реактива Эллмана (5-5 -дитиобис(2-иитробензойной кислоты)) с 2-меркаптоэтанолом в отсутствии и в присутсвии модифицированного олигонуклеотида. Полученные производные представлены в таблице 4. Поскольку при присоединении флуоресцентной группы к олигонуклеотиду может наблюдаться уменьшение флуоресценции [97, 98], мы решили протестировать полученные производные олигонуклеотидов, содержащие флуоресцеин, в различных условиях.
Было обнаружено, что флуоресценция флуоресцеина в составе олигонуклеотида увеличивается с ростом рН, как и флуоресценция свободного флуоресцеина (рис. 11), при этом в составе олигонуклеотида флуоресценция в среднем в 2 раза ниже (в зависимости от рН и состава буфера), что согласуется с литературными данными [97, 98]. Использование DAB СО (реагент для предотвращения выгорания, использующийся в флуоресцентной микроскопии) приводит к сильному снижению флуоресценции свободного флуоресцеина, причем с увеличением рН флуоресценция уменьшается, а не увеличивается, за исключением области низких рН, в которой наблюдается даже усиление флуоресценции. При этом флуоресценция флуоресцеина в составе олигонуклеотида также снижается, но не столь драматически, более того, при добавлении DAB СО флуоресцеин свободный и в составе олигонуклеотида флуоресцирует почти одинаково. По-видимому, DABCO элиминирует взаимодействия флуоресцеина с олигонуклеотидом, приводящие к тушению флуоресценции, за счет чего и наблюдается выравнивание уровня флуоресценции свободного флуоресцеина и в составе олигонуклеотида. Аналогичная картина наблюдалась при сравнении всех производных олигонуклеотидов с флуоресцеином. Таким образом, DABCO можно использовать для уменьшения чувствительности флуоресцеина к понижению рН, что может быть полезно при транспорте олигонуклеотидов в лизосомы. Однако если олигоиуклеотид транспортируется в компартменты с нейтральным или щелочным рН, то DABCO будет скорее мешать детекции олигонуклеотида, поскольку понижает уровень флуоресценции.
