Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Опухолевый ангиогенез и инвазия: общие механизмы регуляции 9
1.2. Краткая история развития представлений об ангиогенезе 14
1.3. Эндостатин: физико-химические свойства, происхождение... 16
1.3.1. Коллаген ХVIII 16
1.3.2. Изоформы коллагена XVIII 19
1.3.3. Структурная организация молекулы эндостатина 23
1.3.4. Образование Р-структур 25
1.4. Механизм действия и физиологические функции эндостатина 28
1.4.1. Протеолитические пути получения эндостатина 34
1.4.2. Рецепторы эндостатина 39
1.4.3. Свойства пептидных фрагментов эндостатина 42
1.5. Перспективы клинического применения эндостатина 42
1.5.1. Общие подходы к антиангиогенной терапии 42
1.5.2. Перспективы терапевтического использования рекомбинантного человеческого эндостатина 45
Глава 2. Материалы и методы 49
2.1. Реактивы 49
2.2. Клеточные линии 49
2.3. Конструирование экспрессионного вектора эндостатина человека 49
2.4. Наращивание биомассы штамма-продуцента Е. coli 50
2.5. Получение растворимого рекомбинантного эндостатина из штамма-продуцента . coli 50
2.6. Получение липосомной формы эндостатина 51
2.7. Получение наночастиц и определение их размеров 52
2.8. Методика культивирования клеток для проведения исследований на покоящемся и пролиферирующем эндотелии 52
2.9. Определение ЦТА эндостатина в отношении культур клеток MCF-7, DU145, АВАЕ, SVEC4-10, bSMC и фибробластов человека 53
2.10. Определение ЦТА эндостатина в отношении клеток линии HUVEC 53
2.11. Оценка выживаемости клеток 53
2.12. Исследование противоопухолевой активности препаратов рекомбинантного эндостатина in vivo 54
2.13. Статистическая обработка результатов 55
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 56
3.1. Конструирование экспрессионного вектора и биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента Escherichia coli JM 109 56
3.2. Получение растворимого рекомбинантного эндостатина из Е. coli 58
3.2.1. Получение телец включения 59
3.2.2. Солюбилизация телец включения 60
3.2.3. Ренатурация эндостатина 61
3.2.4. Гель-фильтрация 62
3.3. Цитотоксическая активность рекомбинантного эндостатина в отношении эндотелиальных клеток линий HUVEC, АВАЕ и SVEC4-10 63
3.4. Цитотоксическая активность рекомбинантного эндостатина в отношении гладкомышечных, соединительнотканных и раковых клеточных линий 66
3.5. Получение наночастиц, содержащих рекомбинантный эндостатин, и исследование их терапевтического противоопухолевого потенциала в модельных экспериментах in vivo 68
3.6. Получение липосомной формы рекомбинантного эндостатина и исследование ее антиангиогенной противоопухолевой активности in vivo 71
3.7. Исследование возможности применения липосомной формы рекомбинантного эндостатина в схемах противоопухолевой комбинированной терапии 74
Выводы 77
Список цитированной литературы 78
- Опухолевый ангиогенез и инвазия: общие механизмы регуляции
- Перспективы терапевтического использования рекомбинантного человеческого эндостатина
- Конструирование экспрессионного вектора и биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента Escherichia coli JM 109
- Получение наночастиц, содержащих рекомбинантный эндостатин, и исследование их терапевтического противоопухолевого потенциала в модельных экспериментах in vivo
Введение к работе
Раковые опухоли могут расти только при условии формирования собственной сети кровеносных сосудов, обеспечивающих опухоль кислородом и нутриентами. С тех пор, как Фолкман постулировал [46] зависимость роста опухолей от их кровоснабжения, специалисты, работающие в области молекулярной медицины, пытаются бороться со злокачественным ростом, блокируя ангиогенез - процесс образования новых опухолевых кровеносных сосудов из предсуществующих [191]. Возможно, именно с помощью антиангиогенной терапии удастся обойти одно из главных препятствий в химиотерапии рака, состоящее в том, что злокачественные клетки быстро приобретают устойчивость к противоопухолевым препаратам. Опухолевый рост сопровождается одновременным формированием сосудистой сети. После сеанса химиотерапии большинство раковых клеток погибает, но некоторая их часть благодаря мутациям, хромосомным перестройкам или индукции экспрессии отдельных генов оказывается устойчивой и выживает; неповрежденными остаются и сосуды, так что опухоль снова быстро прогрессирует. При этом такая опухоль, прошедшая естественный отбор, уже обладает лекарственной устойчивостью, и повторное лечение этим препаратом не приносит терапевтического эффекта.
Особый интерес в качестве мишени химиотерапии представляют собой клетки, выстилающие внутренние стенки сосудов, образующие эндотелий. У вновь образовавшихся капилляров эндотелиальные клетки имеют маркеры, отличающие их от эндотелиальных клеток полностью зрелых сосудов. Это важно, поскольку позволяет вести поиск лекарственных препаратов, специфически разрушающих только новообразованные сосуды, не повреждая остальные. Важно также, что клетки эндотелия доброкачественны и генетически стабильны и поэтому не обладают способностью к быстрому приобретению устойчивости. Таким образом, при проведении антиангиогенной терапии после сеанса лечения разрушается не сама опухоль, а питающая ее кровеносная сеть, что является причиной быстрой регрессии опухоли, лишенной оксигенизации и источников питания. При прекращении проведения терапии может наблюдаться повторный рост опухоли, однако лекарственная устойчивость не возникает.
Среди известных в настоящее время ингибиторов ангиогенеза одним из наиболее перспективных является эндостатин, который представляет собой С-концевой протеолитический фрагмент коллагена XVIII. Даже при длительном терапевтическом применении эндостатин не вызывает возникновения резистентности у опухолевых клеток и при этом обладает ярко выраженным терапевтическим эффектом. Необходимо заметить, что этот антиангиогенный агент может быть использован не только в противоопухолевой терапии, но и при лечении других болезней, связанных с нарушением ангиогенеза. Важной особенностью антиангиогенной терапии является возможность ее комбинированного применения с другими видами терапии, такими как радио-, иммуно- или химиотерапия.
Широкие терапевтические перспективы диктуют необходимость разработки эффективных систем получения растворимого рекомбинантного эндостатина. Так как в системе экспрессии Escherichia соН получение рекомбинантного эндостатина в растворимой форме, предпочтительной для использования в клинической практике, представляет собой трудно разрешимую проблему, в настоящее время для клинических исследований в США и Нидерландах используется рекомбинантный человеческий эндостатин, полученный в дрожжевой системе экспрессии (Pichia pastor is). Однако в дрожжевой системе экспрессии выход целевого белка невысок и недостаточен для массового использования в клинической практике [26], а системе Е. coli. белок экспрессируется в виде нерастворимых в физиологических условиях телец включения. Поэтому по-прежнему остается актуальной проблема разработки метода получения растворимого рекомбинантного эндостатина в системе клеток Е. coli., которая по сравнению с другими [116,133,134,158,165, 175,177,188] является наименее затратной и наиболее технологически простой, способной обеспечить высокие выходы биологически активного белка. Важной задачей является также исследование возможностей повышения биодоступности и терапевтической эффективности эндостатина при его применении в составе наночастиц и липосом.
Опухолевый ангиогенез и инвазия: общие механизмы регуляции
Ангиогенез представляет собой процесс формирования новых кровеносных сосудов из существующих. Недавно была предложена гипотеза, согласно которой новые сосуды также могут быть сформированы из циркулирующих в крови предшественников эндотелиальных клеток -ангиобластов [42]. Во взрослом организме в норме ангиогенез наблюдается только при заживлении ран [4], а также при образовании жёлтого тела, эндометрия и плаценты [44, 167]. В период эмбрионального развития [132] происходит также васкулогенез - образование сети кровеносных сосудов у эмбриона и плода de novo.
При развитии опухолевого процесса и ангиогенной стимуляции покоящиеся эндотелиальные клетки зрелого сосуда активируются, делятся (скорость удвоения их популяции возрастает почти в 100 раз) и образуют эндотелиальную почку, которая прорывает базальную мембрану и внедряется в соединительную ткань. В дальнейшем из активно пролиферирующих и мигрирующих эндотелиоцитов формируются новые капилляры. Активацию эндотелиальных клеток обеспечивают факторы роста, которые экспрессируются в опухоли и самих эндотелиальных клетках, а также компоненты внеклеточного матрикса. Индукция экспрессии ангиогенных факторов происходит под действием таких факторов, как гипоксия, низкие значения рН, действие цитокинов и факторов роста, активация онкогенов или нарушение функций генов опухолевых супрессоров. Прекращение действия этих факторов оказывает стабилизирующее действие на кровеносные сосуды, возвращая эндотелиальные клетки в состояние покоя.
Механизм ангиогенеза достаточно сложен и при его индукции в различных клетках, участвующих в этом процессе, происходят изменения в характере экспрессии генов, продукции про- и антиангиогенных белковых факторов, цитокинов и митогенов. Важнейшую роль при ангиогенезе играют межклеточные взаимодействия и внеклеточный протеолиз, подготавливающий почву для миграции клеток. В ходе ангиогенеза происходят процессы пролиферации, миграции эндотелиальных клеток и формирование сосудистой трубки. В капиллярах, лишенных гладкомышечного слоя, эндотелиоциты активно взаимодействуют с внеклеточным матриксом и ремодулируют его путем секреции протеаз в процессе миграции и формирования нового кровеносного сосуда. Активированные эндотелиоциты образуют новые кровеносные сосуды двумя путями. Они либо распространяются вдоль существующих сосудов в новом направлении (рост в длину), либо формируют сосудистые почки внутри капилляра, образуя ответвления. Этот процесс требует тонкой регуляции, поскольку при нарушении межэндотелиальных контактов или контактов эндотелиоцитов с внеклеточным матриксом может быть индуцирован процесс программированной клеточной гибели. Особенно важную роль в регуляции клеточной активности и межклеточных взаимодействий в процессе ангиогенеза играют молекулы адгезии (интегрины, кадгерины, селектины), а также эфрины и рецепторы факторов роста [191].
Взаимодействия между эндотелиоцитами, перицитами и гладкомышечными клетками сосудов осуществляются путем секреции различных цитокинов, среди которых особенно важную роль играют ангиопоэтины. Ангиопоэтин-1 секретируется перицитами (мезенхимальными клетками, поддерживающими и стабилизирующими эндотелий сосудов) и стимулирует ангиогенез. Ангиопоэтин-2 связывается с тем же рецептором, что и ангиопоэтин-1, однако является его антагонистом. Действие ангиопоэтина-2 вызывает атрофию сосудов, однако в присутствии эпидермального фактора роста (EGF) этот фактор выступает уже в роли стимулятора ангиогенеза. Таким образом, ангиопоэтины могут оказывать разнонаправленное действие на сосуды, которое in vivo, вероятно дополнительно регулируется другими ангиогенными факторами. Помимо факторов роста течение ангиогенеза определяет активность плазмина, поскольку эта протеиназа расщепляет белки внеклеточного матрикса (ВКМ), такие как фибрин, фибронектин и ламинин, и облегчает миграцию эндотелиоцитов [23].
Во взрослом здоровом организме ангиогенез находится под жестким контролем регуляторных систем организма, обеспечивающих баланс между позитивными и негативными регуляторами ангиогенеза (табл. 1), и, в основном, поддерживается на низком уровне или носит периодический и кратковременный характер [45, 191]. В настоящее время известен целый ряд биологически активных молекул, участвующих в регуляции ангиогенеза.
На определенных этапах развития опухоли злокачественные клетки начинают усиленно экспрессировать и секретировать ангиогенные факторы роста, инициирующие ангиогенез. Нередко экспрессия различных онкогенов связана с экспрессией ангиогенных факторов. Например, повышенная экспрессия онкогенов k-ras, h-ras и v-рЗк приводит к синтезу больших количеств VEGF [41]. Интересно, что при этом клетки злокачественных опухолей продуцируют не только индукторы ангиогенеза, но и ингибиторы, однако, уровень экспрессии ингибиторов сравнительно низок.
Опухолевый ангиогенез и образование метастазов протекают при интеграции и взаимодействии множества сигнальных путей между нормальными и опухолевыми клетками (рис. 1).
Перспективы терапевтического использования рекомбинантного человеческого эндостатина
Свидетельством огромного интереса к работам, связанным с изучением эндостатина как антиангиогенного препарата, может служить заявление Нобелевского лауреата Дж. Уотсона о том, что «Фолкман может излечить рак в течение 2-х лет», опубликованном в газете «The New York Times». Вслед за этим в конце 1990-х начались клинические испытания эндостатина, финансируемые частной компанией EntreMedlnc. (Rockvill, Maryland) и Американским Национальным Институтом Рака («NCI») [33, 58]. К настоящему времени накоплен обширный ряд фактов, подтверждающих эффективность рекомбинантного эндостатина при терапии многих видов опухолей, в том числе аденокарциномы легкого, тироидной карциномы, лейкемии, рака поджелудочной железы человека, нейробластомы человека, рака молочной железы и других [8, 11, 55, 67, 80, 86, 91, 152, 153, 181, 184]. Карцинома молочной железы значительно сильнее ингибируется мутантной формой эндостатина с заменой Ала125 на Про125, чем природной формой эндостатина [15]. Глиосаркома у крыс заметно ингибируется даже после 10-ти дней терапии относительно низкими (0,3 мг/кг) дозами мышиного эндостатина [154]. В работе [59] в биопсии опухолей после 8-ми недель применения эндостатина было выявлено значительное увеличение апоптоза опухолевых и эндотелиальных клеток. Особо значим тот факт, что ни в одном случае терапии эндостатином не было выявлено ни токсических эффектов, ни возникновения резистентности к препарату. Однако важным условием эффективной терапии является постоянное присутствие препарата в крови. Так 24-часовое применение человеческого эндостатина против рака поджелудочной железы человека у иммунодефицитных мышей было в 10 раз более эффективным, чем прием препарата один раз в день [80].
Показан терапевтический эффект эндостатина и при некоторых неонкологических заболеваниях. Так недавно в модельных экспериментах на мышах впервые была показана эффективность применения рекомбинантного эндостатина по предотвращению развития симптомов хронической формы аллергической астмы [160].
Эндостатин циркулирует в кровотоке здоровых людей, и его концентрация в сыворотке составляет 4-40 нг/мл. Между тем терапевтически эффективные в отношении торможения опухолевого роста концентрации эндостатина находятся в пределах 0,2-20 мг/мл. Существует мнение, что антиангиогенные и противоопухолевые эффекты эндостатина могут представлять собой фармакологический эффект высоких доз препарата, не связанный с физиологическими функциями белка [114]. Подтверждением этому служит тот факт, что физиологические уровни эндостатина не оказывают влияния на рост фибросарком и меланом у мутантных мышей, дефектных по коллагену XVIII и эндостатину [47]. С другой стороны, имеются факты того, что повышение уровня содержания эндостатина в организме снижает риск возникновения онкологических заболеваний. Так, противоположными результатам работы [47] являются данные о том, что шансы на лучший прогноз у больных гепатоклеточной карциномой гораздо выше, если у них высокий уровень экспрессии коллагена XVIII в опухолевых клетках [105]. Интересен также тот факт, что у больных с синдромом Дауна понижен риск образования солидных опухолей. В то же время у них наблюдается повышенное содержание эндостатина в сыворотке крови [189].
По-видимому, подход к терапии эндостатином каждого конкретного случая рака должен быть строго индивидуализирован и зависеть от типа опухоли, стадии заболевания и ряда других параметров. Например, в экспериментах in vitro с использованием культур эндотелиоцитов и перицитов [173] было показано, что при инкубации клеток в условиях гипоксии протеолитическое выщепление эндостатина из коллагена XVIII резко снижается, а экзогенный эндостатин деградирует значительно быстрее. Механизм этого явления неизвестен, однако этот факт следует учитывать при лечении препаратами эндостатина больных с опухолями, характеризующимися обширными участками с пониженным содержанием кислорода в тканях.
Одними из перспективных можно назвать исследования, направленные на изучение эффективности эндостатина в сочетании как с другими антиангиогенными агентами, так и другими методами противоопухолевой терапии, и традиционными, и новыми [57, 64, 121, 184]. В экспериментах на мышах эндостатин значительно усиливает терапевтический эффект радиотерапии, если используется одновременно с ионизирующим излучением, но не по отдельности [54]. Предположительно этот эффект вызван тем, что поврежденный под действием радиации опухолевый эндотелий не может восстанавливаться в присутствии ингибитора ангиогенеза. Эндостатин может также усиливать эффективность иммунотерапии [24] и химиотерапии [155]. В настоящее время остается дискутируемым вопрос о расчете необходимых доз антиангиогенных и химиопрепаратов и схеме терапии для определенного вида опухоли.
Заслуживает внимания тот факт, что содержание эндогенного эндостатина в организме человека может служить диагностическим показателем при некоторых онкологических заболеваниях, а также атеросклерозе [3,162].
Антиангиогенная терапия имеет ряд существенных отличий от традиционных видов терапии злокачественных новообразований [44, 138, 191, 195,196]. Например, в случае классической химиотерапии ее задачами являются уменьшение размеров опухоли или ее разрушение и, в итоге, достижение полной ремиссии. При проведении антиангиогеннои терапии чаще всего достигается стабилизация течения болезни и длительный период блокирования прогрессии опухоли, что в конечном итоге ведет к значительному увеличению продолжительности жизни пациентов. Хотя уже само достижение стабилизации онкологического заболевания является клинически значимым фактом, представляется, что эффективность антиангиогеннои терапии может быть существенно повышена, и ее итоги могут быть значительно более радикальными. К такому оптимистическому взгляду подталкивают результаты преклинических исследований антиангиогенных препаратов, часто демонстрирующие частичную, а в некоторых случаях и полную регрессию опухоли. Уверенность в большом будущем антиангиогеннои терапии вселяют и все чаще появляющиеся в литературе факты успешного применения антиангиогеннои терапии в комбинации с другими, традиционными видами лечения онкологических заболеваний, такими как радио-, иммуно- и химиотерапия, а также терапия с помощью препаратов направленного действия, состоящих из векторного и цитотоксического компонентов. Чрезвычайно важно учитывать, что для успешного проведения антиангиогеннои терапии, также как и других видов противоопухолевой терапии, определяющим фактором является стадия развития заболевания. Чем раньше начато лечение, тем больше шансов на успех. В этом контексте первостепенное значение приобретает диагностика онкологических заболеваний.
Конструирование экспрессионного вектора и биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента Escherichia coli JM 109
Осадок клеток продуцента получали центрифугированием культуральной жидкости в течение 10 мин при 2500 g и 4С с последующим ресуспендированием в буфере А, содержащем 0,1 М раствор трис-гидрохлорида, рН8.0. Затем к суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 50 мкг/мл. Раствор инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Суспензию подвергали обработке ультразвуком в течение 2 мин (импульс 0,3 сек) при 0С в присутствии 0,1% раствора дезоксихолата натрия, затем центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Осадок снова ресуспендировали в буфере А, содержащем 0,1% раствор дезоксихолата натрия. Процедуру ультразвуковой обработки препарата повторяли еще дважды. Полученные тельца включения замораживали при -70С и лиофильно высушивали.
Осадок телец включения растворяли в буфере, содержащем 0,1 М раствор трис-гидрохлорида (рН 8.0) и 6 М раствор мочевины. Инкубировали 30 мин при 4С, затем центрифугировали 15 мин при 13 400 g и 7С. Супернатант разводили в буфере, содержащем 0,1 М раствор трис-гидрохлорида (рН 8.0), 6 М раствор мочевины и 1% раствор D-маннитола, до конечной концентрации эндостатина -0,02 мг/мл. Полученный препарат диализовали против 200 объемов буфера, содержащего 0,1 М раствор трис-гидрохлорида, (рН8.0), 1 М раствор мочевины, 1% раствор D-маннитола, 1 мМ раствор глутатиона окисленного (GSSG) и 5 мМ раствор глутатиона восстановленного (GSH), в течение 4 сут. Центрифугировали диализат 15 мин при 13 400 g и 7С. Супернатант диализовали против 200 объемов буфера, содержащего 0,1 М раствор трис-гидрохлорида (рН8.0), в течение 1 сут. Центрифугировали диализат 15 мин при 13 400 g и 7С. Супернатант анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ с использованием стандартного протокола [90]. Определение содержания свободных SH-групп проводили по методу Эллмана с использованием стандартного протокола [36].
Липосомы, содержащие эндостатин, получали методом экструзии [92]. На 1 мл липосомной дисперсии в круглодонную колбу помещали 20,5 мг оволецитина и 4,5 мг холестерина в мольном соотношении 7/3 соответственно, растворённые в хлороформе. Смесь растворов липидов упаривали на роторном испарителе до постоянного веса при 38С. Остатки растворителя удаляли под вакуумом в течение 2 ч. Полученную липидную пленку растворяли в 3 мл диэтилового эфира и добавляли 1 мл раствора эндостатина (4 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере (рН7.4). Через колбу продували аргон и обрабатывали дисперсию ультразвуком на водяной бане при 10С в течение 3 минут. Затем упаривали диэтиловый эфир на роторном испарителе при комнатной температуре. Полученную липидную дисперсию продавливали 15 раз через ядерный поликарбонатный фильтр с размером пор 100 нм. Получали 0,9 мл суспензии липосом с размером везикул 100 нм.
Наночастицы на основе модифицированного поли-К-винилпирролидона с эндостатином были получены, как описано в работе [149]. Для определения степени включения вещества в наночастицы полученные препараты осаждали ультрацентрифугированием и измеряли в супернатанте концентрацию не включенного вещества спектрофотометрическим методом.
Распределение размеров наночастиц определяли методом динамического светорассеяния на широкоугловом лазерном фотометре рассеянного света ALV-5 (Германия). Через термостатируемую (20С) кювету с раствором препарата наночастиц пропускали монохроматическое излучение от гелий-неонового лазера при длине волны 632,8 нм. Рассеянный под углом 90 свет падал на фотодетектор. Обработку данных осуществляли с помощью 280-канального коррелятора PhotoCor.
Эндотелиальные клетки культивировали в среде 199 с солями Эрла, содержащей 20 мМ HEPES, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (все реактивы фирмы "Gibco"), 50 мкг/мл фактора роста эндотелиальных клеток и 5 ед/мл гепарина ("Sigma"). Первичные конфлюэнтные культуры отмывали сбалансированным солевым раствором Эрла ("Gibco"), снимали 0.05% трипсином-0.02% ЭДТА ("Gibco"), ресуспендировали в среде культивирования и пересевали на предварительно покрытые 0.2% желатиной ("Sigma") культуральные планшеты ("Costar") с разведением 1:4 (низкая плотность) и 1:2 (высокая плотность) от исходной плотности монослоя. Через 18 ч и затем каждые 48 ч проводили смены среды культивирования на свежую. К началу эксперимента эндотелиальные клетки оценивались как находящиеся в логарифмической стадии роста (пролиферирующие) и как находящиеся в состоянии монослоя (конфлюэнтные), соответственно.
Клетки за 1 сут до эксперимента рассевали в 96-луночные планшеты для микротитрования (Corning, США) в среде для культивирования в плотности 5000-7000 клеток в лунку. Раствор эндостатина стерилизовали фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore Corporation, США) и добавляли к клеткам. Инкубировали клетки в стандартных условиях 72 ч, после чего определяли их выживаемость.
Клетки линии HUVEC за 1 сут до эксперимента рассеивали в покрытые желатином 24-луночные планшеты (Corning, США) в среде для культивирования и инкубировали 12 ч. Затем заменяли среду для культивирования на среду М199 (Sigma, США), содержащую 25% сыворотки крови человека, 25 мкг/мл гепарина и 2,5 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF). Раствор эндостатина стерилизовали фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore Corporation, США) и добавляли к клеткам. Инкубировали клетки в стандартных условиях 72 ч, после чего определяли их выживаемость.
Получение наночастиц, содержащих рекомбинантный эндостатин, и исследование их терапевтического противоопухолевого потенциала в модельных экспериментах in vivo
В последние годы все большее внимание привлекает использование полимерных мицелл, представляющих собой амфифильные сополимеры, формирующие мицеллы в водных растворах. Такие мицеллы могут быть использованы для улучшения терапевтических свойств различных противоопухолевых агентов, таких как доксорубицин, цисплатин, таксол [77, 108]. Полимерные мицеллы имеют ряд преимуществ над другими видами наночастиц (наносферы, нанокапсулы, липосомы и др.). Полимерные мицеллы характеризуются наилучшей термодинамической стабильностью в физиологических растворах, являющейся следствием низкого уровня мицеллярной критической концентрации, который обусловливает их стабильность и препятствует быстрой диссоциации мицелл in vivo [72,142, 190, 194]. Полимерные мицеллы характеризуются узким диапазоном распределения по размерам и уникальной структурой, в которой гидрофобные сегменты локализованы в коровой части мицеллы, а гидрофильные - образуют наружную оболочку. Полимерные мицеллы являются чрезвычайно перспективными средствами для системной доставки как водорастворимых, так и слаборастворимых в воде веществ. В зависимости от физико-химических свойств при получении полимерных мицелл противоопухолевые препараты могут встраиваться как в гидрофобный кор, так и в наружный гидрофильный слой мицелл, формирующих стабильные дисперсии в водной среде, которые с успехом могут быть использованы для внутривенного введения. Размеры полимерных мицелл (как правило, около 100 нм и меньше) позволяют рассматривать их в качестве перспективных систем доставки, которые не подвергаются быстрому выведению через почки и поглощению ретикуло-эндотелиальной системой. Кроме того, мицеллы эффективно проникают через опухолевые кровеносные сосуды и накапливаются непосредственно в местах локализации солидных опухолей [106, 108]. Накопление полимерных мицелл в злокачественных тканях является следствием значительных нарушений проницаемости опухолевых сосудов и повреждений лимфатической дренажной системы [96, 183]. Таким образом, представляется актуальным поиск перспективных противоопухолевых агентов для включения в состав полимерных мицелл и исследование терапевтического потенциала полученных препаратов in vivo.
В результате работы были получены наночастицы с соотношением [активное вещество/полимер] 1:2. При данном соотношении веществ степень включения эндостатина в наночастицы составляла -85%. Данные о распределении размеров наночастиц, полученные методом динамического светорассеяния, представлены на рис. 30. Диапазон размеров наночастиц составлял от 17 до 100 нм. Усредненный диаметр наночастиц составлял 55,8 нм (рис. 31).
Известно, что эндогенные полипептидные ингибиторы ангиогенеза подвержены быстрому удалению из организма посредством системы почечной фильтрации [143]. Применение подобных препаратов в составе полимерных наночастшд, очевидно, должно продлить время пребьшания их в организме за счет постепенного высвобождения из «наноконтейнеров» и, соответственно, повысить эффективность их действия. Проведенные в настоящей работе исследования противоопухолевой активности полученных препаратов показали, что применение эндостатина в составе наночастиц на основе поли-Ы-винилпирролидона в течение 20 дней в дозах 100 мг/кг веса животного приводит к значительному снижению интенсивности опухолевого роста по сравнению не только с нелеченным контролем, но и с животными, получавшими гомогенный препарат эндостатина (рис. 32). Так, показатель ТРО на день отмены курса терапии наночастицами с эндостатином составлял 66%. Аналогичный показатель для гомогенного белка составлял 41%. Применение препарата наночастиц с эндостатином приводило также к значительному УСПЖ животных по отношению как к контролю, так и к группе животных, которым вводили гомогенный ингибитор (табл. 6). Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что применение эндостатина в составе полимерных наночастиц способствует повышению эффективности реализации его терапевтического действия, что выражается в более интенсивном торможении роста опухолей и увеличении средней продолжительности жизни экспериментальных животных, получавших препарат наночастиц, по сравнению с применением гомогенного препарата. Очевидно, что для поиска наиболее эффективных схем терапевтического применения наночастиц, содержащих рекомбинантный эндостатин, требуются углубленные дополнительные исследования.
Использование липосом для транспорта и целенаправленной доставки противоопухолевых препаратов является одним из перспективных направлений в современной онкологии. В настоящее время известно, что фармакокинетика инкапсулированных в липосомы лекарств определяется взаимодействием двух факторов: скоростью выведения из плазмы липосомного препарата и стабильностью соединения липосом с лекарством в кровяном русле [192]. Данный процесс зависит от свойств препарата и липосомного носителя, а именно: от размера липосом и их физико-химических свойств, проницаемости отдельных тканей, природы связи между липосомой и лекарственным веществом. Специфическое строение опухолевых кровеносных сосудов и небольшой размер липосом обеспечивают пассивную направленную доставку, устойчивое накопление липосомного лекарственного вещества в опухоли, что обусловливает повышение терапевтической эффективности препаратов [192, 194].
В экспериментах по изучению противоопухолевой активности эндостатина in vivo применяли как гомогенный белок, так и его липосомную форму. Для получения липосомной формы эндостатина применяли метод экструзии. Липосомы получали ультразвуковой обработкой дисперсии оволецитин-холестерин-белок с последующим многократным продавливанием через ядерный поликарбонатный фильтр. Суммарное содержание липидов (оволецитина и холестерина) в липосомах составило 25 мг/мл суспензии, содержание эндостатина - 3,4 мг/мл суспензии. Размер полученных липосом был строго фиксированным и составлял 100 нм. Поскольку капилляры, образовавшиеся в результате опухолевого неоангиогенеза, характеризуются наличием в слое эндотелия большого количества пор размером до 800 нм, липосомы при циркуляции в кровотоке будут проникать преимущественно в солидные опухоли [2], обеспечивая направленный транспорт антиангиогенного препарата. Липосомный и гомогенный эндостатин вводили мышам с опухолями меланомы В16, начиная с 7-го дня после прививки опухоли. Терапию осуществляли в течение 20-ти дней, вводя препараты внутривенно каждый день в дозе (по белку) 100 мг/кг. Размер солидных опухолей измеряли один раз в 2-3 дня. Необходимо отметить, что курсовая противоопухолевая терапия эндостатином предполагает более частые инъекции препаратов: каждые 12 или 24 ч в течение ряда недель [17, 143]. Однако применение липосомных форм полипептидных препаратов должно позволить значительно увеличить время их полужизни в организме и повысить терапевтическую эффективность.
