Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Гемостаз и тромбоз 13
1.2. Наследственные тромбофилии 19
1.3. Генетические детерминанты, определяющие состояние тромбофилии...20
1.3.1. Ген фактора V свертывания крови 20
1.3.2. Ген протромбина 22
1.3.3. Ген р-фибриногена 23
1.3.4. Ген ингибитора активатора плазминогена типа 1 25
1.3.5. Ген Ша субъединицы рецептора тромбоцитов Ilb/IIIa 27
1.3.6. Ген метилентетрагидрофолат редуктазы 30
1.3.7. Ген фактора VII свертывания крови 36
1.4. Патогенез ишемического инсульта и инфаркта миокарда 38
2. Материалы и методы 41
2.1. Характеристика обследуемых групп 41
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Выделение ДНК из периферической крови человека 43
2.2.2. Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализ 45
2.2.3. Определение биохимических показателей плазмы крови 54
2.3. Статистическая обработка результатов исследования 59
3. Результаты исследования 60
3.1. Контрольная группа 60
3.1.1. Распределение аллельных вариантов генов, определяющих склонность к тромбофилии, в контрольной группе 60
3.1.2. Анализ биохимических показателей в контрольной группе 61
3.2. Группа пациентов, перенесших ишемический инсульт 64
3.2.1. Анализ частотных распределений мутаций и полиморфизмов
изучаемых генов у пациентов, перенесших ишемический инсульт 64
3.2.2. Анализ результатов биохимического исследования в группе пациентов, перенесших ИИ 65
3.2.3. Кооперативный вклад генетических и приобретенных факторов в риск развития ИИ 76
3.2.4. Анализ аллельного распределения генов, определяющих склонность к тромбофильным состояниям, у пациентов в зависимости от семейной истории сердечно-сосудистых заболеваний 80
3.2.5. Распределение частот аллелей анализируемых генов в зависимости от количества перенесенных ИИ 82
3.2.6. Ген-генные взаимодействия в группе пациентов с ИИ 83
3.3. Группа пациентов, перенесших инфаркт миокарда в молодом возрасте.85
3.3.1. Анализ частотных распределений мутаций и полиморфизмов изучаемых генов у пациентов, перенесших ИМ в молодом возрасте 85
3.3.2. Анализ биохимических показателей в группе пациентов, перенесших ИМ 86
3.3.3. Анализ аллельных распределений исследуемых генов в зависимости от семейной истории сердечно-сосудистых заболеваний 89
3.3.4. Приобретенные факторы риска и развитие инфаркта миокарда в молодом возрасте 91
3.3.5. Анализ кооперативного вклада генетических и приобретенных факторов риска в развитие ИМ у мужчин молодого возраста 94
3.3.6. Распределение аллелей исследуемых генов у пациентов, перенесших несколько инфарктов миокарда 102
3.3.7. Ген-генные взаимодействия в группе пациентов с ИМ 103
4. Обсуждение 105
Выводы 121
Список литературы
- Гемостаз и тромбоз
- Ген фактора V свертывания крови
- Выделение ДНК из периферической крови человека
- Распределение аллельных вариантов генов, определяющих склонность к тромбофилии, в контрольной группе
Введение к работе
В последние десятилетия достигнуты впечатляющие успехи в области молекулярной генетики человека, позволившие от формального описания законов наследования перейти к полной расшифровке человеческого генома. Понимание механизмов генетического контроля протекающих в организме метаболических процессов меняет представления об этиологии и молекулярных основах патогенеза как моногенных наследственных заболеваний, так и состояний, определяющих предрасположенность к широко распространенным полигенным или мультифакториальным болезням, а также может объяснить различную чувствительность индивидуумов к неблагоприятным факторам внешней среды, инфекционным агентам и фармакологическим препаратам. Таким образом, молекулярная генетика создает базис для разработки нетрадиционных методов лечения, профилактики заболеваний и индивидуальной, генетически обоснованной фармакотерапии.
Одной из актуальных проблем современного здравоохранения является выяснение молекулярно-генетических основ развития сердечнососудистых заболеваний. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной летальности населения промышленно развитых стран мира. В США на ССЗ приходится 42% всех случаев смерти. Из них на ишемическую болезнь сердца приходится 51%, 27% - на сердечную недостаточность, 16% - на ишемический инсульт мозга, 6% - на другие сердечно-сосудистые заболевания (Преображенский Д.В. и соавт., 2002). По данным рабочей группы ВОЗ (1997 г.), Россия по смертности от ишемической болезни сердца и инсульта занимает одно из первых мест в Европе. Следует отметить, что в нашей стране наблюдается преобладание церебрального инсульта над острым инфарктом миокарда (Скоромец А.А., 1997). С момента создания технологий выделения индивидуальных генов из различных биологических объектов, ведутся исследования по определению структурной организации генов, определяющих функционирование метаболических циклов, нарушения в которых приводят к развитию сердечно-сосудистой патологии. В первую очередь это гены, продукты которых либо вовлечены в липидный гомеостаз, либо оперируют в системе свертывания крови, или влияют на физиологию стенки сосудов.
В основе развития инфаркта миокарда и ишемического инсульта головного мозга лежат два процесса - атеросклероз и тромбоз соответствующих артерий. При этом следует обратить внимание на тот факт, что атеросклеротические изменения сосудов характерны для лиц пожилого возраста, у молодых пациентов больший вклад в формирование патологии вносят нарушения в системе коагуляции, приводящие к повышенному тромбообразованию. Анализ эпидемиологических исследований показывает, что повышение уровня ряда факторов свертывания крови, таких как фибриноген, фактор VII свертывания крови, фактор Виллебранда, фактор VIII, увеличение агрегационных свойств тромбоцитов, изменение содержания в крови компонентов фибринолитической системы являются факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, включая инфаркт миокарда и ишемический инсульт (Folsom A.R., 2001; Баркаган З.С., 1996; Руксин В.В., 1998). Данные изменения в плазменном и тромбоцитарном звеньях гемостаза генетически детерминируются. Однако вклад мутационных повреждений генов, кодирующих факторы свертывания крови, тромбоцитарные рецепторы и компоненты системы фибринолиза, в увеличение риска развития артериальных тромбозов к настоящему времени однозначно не определен. Результаты работ, посвященных этому вопросу, носят противоречивый характер и сильно зависят от этнических, половых и возрастных особенностей исследуемых популяций (Simmonds R.E. et al, 2001; Hassan A., Markus H.S., 2000).
Известно, что инфаркт миокарда и ишемический инсульт являются полигенными заболеваниями, приобретенными факторами риска которых выступают курение, избыточный вес, нарушения липидного обмена, артериальная гипертензия, стрессы (Мартынов Ю.С., 1988; Скопина Е.И., 2001; Оганов Р.Г., 1992; Погосова Г.В., 2002). Логично предположить, что взаимодействие между различными факторами риска, включая генетические детерминанты, обусловливающие склонность к тромбофилии, будут играть ведущую роль в генезе данных заболеваний. Вопрос о том, какие именно взаимодействия приобретенных и генетических факторов, а также ген-генные сочетания, определяют предрасположенность к развитию артериального тромбоза, особенности течения и возможные рецидивы болезни, остается открытым.
Все вышесказанное явилось основой для проведения настоящего исследования.
Цель исследования:
Целью данного исследования явилось определение молекулярно-генетических основ развития предрасположенности к артериальным тромбозам церебрального и коронарного русла и выявление взаимодействий между приобретенными и генетическими факторами, которые повышают риск формирования данной патологии.
Задачи исследования:
Определить частоты встречаемости аллельных вариантов генов F5, F7, FGB, F2, GP Ilia, MTHFR, PAI-1 у здоровых мужчин молодого возраста (до 45 лет).
Определить частоты встречаемости вышеперечисленных генов среди мужчин, перенесших ишемический инсульт в молодом возрасте.
Определить частоты встречаемости вышеперечисленных генов среди мужчин, перенесших инфаркт миокарда в молодом возрасте.
Оценить влияние изучаемых генотипов на показатели гемостаза в исследуемых группах.
Определить уровень общего гомоцистеина плазмы крови у мужчин, перенесших ишемический инсульт в молодом возрасте и оценить зависимость уровня общего гомоцистеина плазмы крови от аллельных вариантов гена метилентетрагидрофолат редуктазы и приобретенных факторов риска развития артериальных тромбозов.
Определить вклад межгенных взаимодействий и взаимодействий приобретенных и генетических факторов риска в развитие предрасположенности к артериальным тромбозам церебрального и коронарного русла.
Научная новизна полученных результатов.
Впервые дана оценка распределения аллельных вариантов генов F5, F7, FGB, F2, GP Ша, MTHFR, PAI-1 среди мужчин г. Санкт-Петербурга, перенесших ишемический инсульт или инфаркт миокарда в возрасте до 45 лет. Впервые показано протективное действие инсерционного промоторного полиморфизма гена фактора VII свертывания крови в отношении развития ишемического инсульта у мужчин молодого возраста.
Подтвержден вклад РГ42 аллеля гена GP Ша в риск развития инфаркта миокарда у мужчин молодого возраста.
Установлено, что к развитию ИИ или ИМ у пациентов с семейной историей сердечно-сосудистых заболеваний и без нее предрасполагают различные генетические нарушения. Впервые показано, что лейденская мутация гена фактора V свертывания крови повышает риск развития артериальных тромбозов у мужчин в отсутствии семейной истории сердечно-сосудистых заболеваний.
Впервые в российской популяции проведен анализ зависимости показателей гемостаза от генетических детерминант, определяющих склонность к развитию ишемического инсульта и инфаркта миокарда. Показано, что функциональная активность тромбоцитов повышена у носителей Р1 аллеля гена GP Ша, уровень фибриногена плазмы крови повышается при наличии у индивидуума А аллеля гена р-фибриногена или 4G аллеля гена ингибитора активатора плазминогена типа 1. Впервые в российской популяции проанализирован уровень общего гомоцистеина у мужчин, перенесших ишемический инсульт, и определена зависимость уровня общего гомоцистеина от генотипа С677Т MTHFR у названных пациентов. Впервые установлено, что Т677 аллель гена MTHFR ассоциируется с повышенным риском развития ишемического инсульта у лиц с семейной историей сердечно-сосудистых заболеваний.
Впервые проанализировано взаимодействие между приобретенными факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и генетическими детерминантами, определяющими склонность к тромбофилии, у лиц мужского пола г. Санкт-Петербурга. Показан кооперативный эффект курения и F V Leiden или PI GP Ша, десятикратно повышающий риск развития инфаркта миокарда. Установлено, что сочетание F V Leiden и нарушения обмена липидов увеличивает риск развития артериальных тромбозов церебрального и коронарного русла.
Впервые в мировой практике проведен анализ межгенных взаимодействий семи вышеуказанных детерминант у пациентов, перенесших ишемический инсульт или инфаркт миокарда, и оценен вклад сочетанных генотипов в риск развития артериальных тромбозов различной локализации. Показано, что риск развития ишемического инсульта и инфаркта миокарда возрастает при сочетанном носительстве pjAl/A2 Gp Ша и С677Т MTHFR или р1А1/А2 Gp ІПа и А1/А2 5,p7j кроме того в риск развития ишемического инсульта вносят вклад неблагоприятные сочетания А1/А2 5Т7 и С677Т MTHFR, а в риск развития инфаркта миокарда - Р1А1/А2 GP Ша и 4G/5G PAI-1 или С677Т MTHFRh4G/5GPAI-1.
Практическая значимость работы.
На основании полученных результатов показана целесообразность определения наличия генетических детерминант, обусловливающих склонность к повышенному тромбообразованию, в первую очередь pjA1/A2 полиморфизма гена GP Ша и лейденской мутации гена фактора V, у курящих мужчин с целью профилактики развития инфаркта миокарда.
Для определения группы высокого риска развития ишемического инсульта и инфаркта миокарда у мужчин с нарушениями обмена липидов рекомендовано определение лейденской мутации гена фактора V.
Для определения группы высокого риска развития ишемического инсульта среди лиц, имеющих отягощенный семейный анамнез по этому заболеванию, рекомендовано определение мутации С677Т MTHFR. Это даст возможность проводить генетически обоснованную фармакотерапию повышенными дозами фолиевой кислоты и витаминами Вб и В]2 с целью предотвращения повышения уровня общего гомоцистеина плазмы крови.
С целью профилактики развития инфаркта миокарда в молодом возрасте необходимо раннее выявление лиц мужского пола, являющихся носителями Р1А1/А2 полиморфизма гена GP Ша. Это имеет большое практическое значение, так как лица с различными генотипами PI GP Ша могут обладать различной чувствительностью к антиагрегантной терапии аспирином.
Основные положения, выносимые на защиту:
Инсерционный промоторный полиморфизм гена фактора VII свертывания крови (А1/А2 5Т7) встречается достоверно реже среди пациентов мужского пола, перенесших ишемический инсульт в возрасте до 45 лет, по сравнению с контрольной группой. Данный полиморфизм является протективным в отношении развития церебрального артериального тромбоза и его отсутствие повышает риск развития ишемического инсульта.
Полиморфизм P1A1 ^2 гена GP Ша является фактором риска развития инфаркта миокарда у мужчин в возрасте до 45 лет. Риск развития инфаркта миокарда у носителей данного полиморфизма значительно возрастает при сочетании с курением.
Лейденская мутация фактора V свертывания крови вносит вклад в риск развития артериального тромбоза в церебральном и коронарном русле при взаимодействии с нарушениями обмена липидов.
Апробация работы.
Результаты работы были доложены на V Всероссийской конференции "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения" (Москва, Россия, 2000), на конференции, посвященной 100-летию Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, Россия, 2000), на юбилейной конференции СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова "100-лет кафедре факультетской терапии им. акад. Г.Ф. Ланга, важнейшие достижения и верность традициям!" (Санкт-Петербург, Россия, 2000), на VI Всероссийской конференции "Атеротромбоз и артериальная гипертензия" (Москва, Россия, 2001), на 10-ом Международном конгрессе по генетике человека (Вена, Австрия, 2001), на 10-ой научно-практической конференции неврологов "Нейроиммунология" (Санкт-Петербург, Россия, 2001), на научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в рамках Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, Россия, 2002), на 17-ом Международном конгрессе по тромбозам (Болонья, Италия, 2002). По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 статьи.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц, иллюстрирована 17 рисунками и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 224 научных источника (25 - на русском языке и 199 - на иностранном).
Гемостаз и тромбоз
Гемостатический процесс начинается с травмы или разрыва сосуда, а заканчивается образованием тромбоцитарно-фибриновой сетки, так называемой гемостатической пробки. Она предотвращает дальнейшую кровопотерю и служит центром для восстановления поврежденных тканей. Реакция на повреждение сосуда включает взаимодействие между сосудистым эндотелием, тромбоцитами, коагуляционными факторами крови, их ингибиторами и фибринолитической системой. Дисбаланс гемостаза может сопровождаться либо чрезмерным кровотечением, либо образованием тромба.
Тромб образуется внутрисосудистой массой фибрина и клеток крови. Артериальные тромбы, формирующиеся при высокой скорости потока, состоят в основном из тромбоцитарных агрегатов, которые удерживаются вместе нитями фибрина. Это белые тромбы. Венозные тромбы или красные, возникающие в зоне стаза, включают большое количество эритроцитов, фибрина, но содержат относительно мало тромбоцитов. В зонах медленного и умеренного кровотока образуются смешанные тромбоцитарно-фибриновые тромбы. Тромбы могут локализоваться в венах, артериях, сердце или микрососудах органа. Тромб в любой части сосудистой системы приводит к развитию ишемии за счет окклюзии сосуда или эмболизации.
Патофизиология тромбообразования включает три взаимосвязанных фактора, определенных более 150 лет назад Рудольфом Вирховым: изменения в сосудистой стенке, замедление кровотока, нарушение свертываемости крови (Баркаган З.С., 1996). Повышенная свертываемость крови или гиперкоагуляционные состояния, называемые также предтромботическими, определяются как склонность к тромбозу в условиях, которые не привели бы к таковому у здоровых индивидуумов.
Идентифицирован ряд наследственных и приобретенных факторов риска развития тромбозов (Рисунок 1).
В норме эндотелий проявляет антикоагулянтные свойства, то есть обладает тромборезистентностью, он способен нейтрализовать активные факторы свертывания крови, ингибировать адгезию и агрегацию тромбоцитов, активировать фибринолиз. При патологических состояниях пораженный эндотелий, например в месте разрыва атероматозной бляшки, трансформируется в мощную прокоагулянтную поверхность. Это происходит за счет выделения прокоагулянтных веществ, включая тканевой фактор и фактор Виллебранда, а также за счет обнажения субэндотелиальных коллагеновых структур. Все это приводит к активации тромбоцитов, изменению их формы, адгезии и агрегации. Тканевой фактор активирует внешний путь системы свертывания крови. Хотя патогенез тромбообразования одинаков в различных участках системы кровообращения, существует значительная разница в механизме формирования артериального и венозного тромба. Одним из основных факторов образования артериального тромба является активация тромбоцитов в месте повреждения эндотелия сосудов. Венозный тромбогенез отличается от артериального типом нарушения равновесия между тромбогенными и защитными механизмами. При венозном тромбозе ведущую роль играет повышенная системная гиперкоагуляция, т.е. активация свертывания с недостаточностью процессов ингибирования, и стаз крови. Активация тромбоцитов имеет второстепенное значение. Поражение стенки сосуда необязательно, однако является способствующим фактором. В ряде случаев в основе тромботического процесса лежит нарушенный фибринолиз (Шиффман Ф.Дж., 2000).
Стадии активации свертывания крови, приводящие к образованию тромбоцитарных агрегатов и фибрина, одинаковы как при формировании гемостатической пробки, так и при тромбообразовании.
Система свертывания крови представляет собой каскад взаимосвязанных реакций, протекающих с участием протеолитических ферментов, ведущих к образованию тромбина - ключевого компонента коагуляции, превращающего фибриноген в фибрин (Рисунок 2). Деление механизма коагуляции на внешний и внутренний путь условно, так как не имеет места in vivo, но такой подход облегчает интерпретацию лабораторных тестов и объяснение процесса свертывания крови.
Ген фактора V свертывания крови
У 40-60% пациентов с диагносцированным тромбозом наблюдается резистентность к активированному протеину С (АПС-резистентность), которая проявляется отсутствием ингибиторного эффекта при добавлении активированного протеина С в плазму больного. В норме активированный протеин С расщепляет активный фактор V в трех позициях - Arg506, Arg306 и Arg679, а также инактивирует фактор Villa (Dahlback В. et al, 1993, Dahlback В., 1995, Hooper W.C., Evatt B.L., 1998). В основе АПС-резистентности лежит точечная мутация - замена G на А в 1691 нуклеотидной позиции гена фактора V свертывания крови, названная лейденской (F V Leiden) (Bertina R.M. et al, 1994). Результатом лейденской мутации является замена аргинина на глутамин в 506 положении аминокислотной последовательности белка, что нарушает сайт расщепления фактора V активированным протеином С. Таким образом не происходит регулирования образования тромбина по принципу обратной связи. Частота встречаемости данной мутации в европейской популяции колеблется от 2% до 7%, однако крайне редка в странах Азии и Африки (Rees D.C. et al, 1995). У пациентов с тромбозом глубоких вен частота F V Leiden достигает 20%, относительный риск развития заболевания у гетерозиготных носителей возрастает в 7 раз, а у гомозиготных - в 80 раз (Rosendaal F.R. et al, 1995). Данные о влиянии лейденской мутации фактора V свертывания крови на развитие артериальных тромбозов носят противоречивый характер. Так, ряд исследователей говорят о повышенном риске развития инфаркта миокарда у носителей F V Leiden, тогда как другие отрицают влияние этого мутационного повреждения на формирование коронарного тромбоза (Boekholdt S.M. et al, 2001). F V Leiden чаще встречается у пациентов, перенесших инфаркт миокарда в пожилом возрасте (Marz W. et al, 1995; Baranovskaya S. et al, 1998). Неоднозначное мнение сложилось и о вкладе лейденской мутации в развитие ишемического инсульта. Частота F V Leiden варьирует у больных, перенесших инсульт, в зависимости от возраста, пола, критериев отбора в исследуемую группу (Ridker P.M. et al, 1995; Margaglione M. et al, 1999; Gunther G. et al, 2000; Madonna P. et al, 2002). В 1998 году были описаны еще две мутации фактора V - F V Cambridge и F V Hong Kong. Данные мутации приводят к замене аргинина в 306 положении на треонин или глицин. Их частота встречаемости мала и вклад в развитие АПС-Р невелик, но следует учитывать тот факт, что полная инактивация фактора Va возможна только при разрезании его АПС по всем трем сайтам (Williamson D. et al, 1998; Chan W.P. et al, 1998). Мутационным повреждением фактора V объясняется примерно 95% случаев АПС-резистентности. Состояния АПС-Р могут быть также связаны с повышенным уровнем в крови фактора VIII, антифосфолипидными антителами, приемом оральных контрацептивов, беременностью (Dahlback В., 1997; Hooper W.C., Evatt B.L., 1998). Кроме того ковалентное соединение гомоцистеина с активным фактором V является одной из причин АПС-Р при гипергомоцистеинемии (Undas A. et al, 2001). На антикоагулянтную активность протеина С влияет уровень фосфолипидных компонентов плазмы крови - дефицит этих компонентов снижает антикоагулянтные свойства комплекса АПС-протеин S и может служить фактором риска развития тромбозов (Deguchi Н. et al, 2001).
Тромбин, являясь основным ферментом коагуляционного каскада, не только превращает фибриноген в фибрин, но и активирует факторы V, VIII, XI и XIII, а также тромбоциты. Логично, что высокий уровень в крови предшественника тромбина - протромбина будет служить фактором риска тромбозов. При изучении пациентов с семейной историей тромбофилии непонятного генеза была обнаружена замена G на А в 20210 позиции 3 -нетранслируемого региона гена протромбина (F2). У гетерозиготных носителей этого полиморфизма было отмечено повышение уровеня протромбина на 50% (Poort S.R. et al, 1996). Мутация G/A 20210 локализована в области эндонуклеазного разрезания пре-мРНК и полиаденилирования. В 2001 году Gehring et al показали, что данная замена ведет к накоплению мРНК и увеличению синтеза белка (Gehring N.H. et al, 2001). F2 G20210A редко встречается в популяции (1-4%), но частота встречаемости полиморфизма среди больных с венозными тромбозами достигает 20% (Rosendaal F.R. et al, 1998; Leroyer С. et al, 1998). Риск развития тромботических осложнений особенно растет при сочетании F2 G20210A с F V Leiden, а у женщин - при приеме оральных контрацептивов (Martinelli I. et al, 1999). Кроме того, у пациентов с комбинацией лейденской мутации и мутации в гене протромбина тромбозы развиваются в более молодом возрасте и имеют атипичную локализацию (Ehrenforth S. et al, 1999). В отличии от венозных тромбозов, вклад F2 G20210A в риск развития тромбозов артериальных варьирует в различных исследованиях. Мета-анализ для инфаркта миокарда показал очень противоречивые данные, особенно в группе больных до 55 лет - OR колебался от 0.76 до 2.48 (Boekholdt S.M. et al, 2001). Аналогичные результаты получены и в отношении развития тромботического ишемического инсульта. Только De Stefano V. получил подтверждение взаимосвязи между полиморфизмом протромбина и риском цереброваскулярных заболеваний у молодых пациентов, причем гетерозиготное состояние увеличивало риск церебральной ишемии в 3.8 раза, а гомозиготное - в 208 раз (De Stefano V. et al, 1998), остальные исследователи не нашли подобной ассоциации (Longstreth W.T. et al, 1998; Ferraresi P. et al, 1997; Ridker P.M. et al, 1999). He обнаружено увеличение риска развития ишемического инсульта у новорожденных с сочетанием F2 G20210A и других генетических нарушений, тогда как асфиксия, сепсис, диабет у матери играли роль ведущих пусковых факторов (Gunther G. et al, 2000).
Выделение ДНК из периферической крови человека
У мужчин всех исследуемых групп был осуществлен забор крови из локтевой вены в объеме 5-10 мл в стерильные пластиковые пробирки, содержащие 100 мкл 0.5М ЭДТА рН8.0 в качестве антикоагулянта. Собранная таким образом кровь замораживалась и хранилась при -20С.
ДНК выделяли из лейкоцитов крови стандартным фенол-хлороформным методом (Маниатис Т. и соавт., 1984). Лизис клеток проводили по методу Канкеля (Lahiri D.K. et al, 1992).
К 500 мкл крови добавляли 500 мкл раствора для лизиса эритроцитов (29 мМ Tris-HCl рН7.4, ЮмМ NaCl, ЗмМ MgCl2, 5% сахароза, 1% тритон Х100), инкубировали в течении 5 мин., осторожно перемешивая, и центрифугировали 10 мин. при +9С, 4000 об./мин. Супернатант сливали и осадок лейкоцитов ресуспендировали в растворе для лизиса мембран (29мМ Tris-HCl рН7.4, ЮмМ NaCl, 1мМ MgCl2, 0.25М сахароза). Смесь центрифугировали при тех же условиях, супернатант сливали. К осадку добавляли 300 мкл раствора для протеиназы К (0.01М Tris-HCl, 0.01М NaCl, 0.01М ЭДТА рН8.0), ЗОмкл 30% SDS и протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл. Смесь инкубировали в течении 2-3 часов при +50С для протеолиза. Получившийся в результате протеолиза гомогенный раствор последовательно обрабатывали 300 мкл фенола, 300 мкл смеси фенол-хлороформ в соотношении 1/1, 300 мкл хлороформа. После каждой экстракции в течении 10 мин. при аккуратном перемешивании смесь центрифугировали 10 мин. при +20С, 4000 об./мин. и отбирали водную фазу. По окончании экстракции к водной фазе добавляли 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и 2 объема 96% этанола. Осадок ДНК центрифугировали при +9С, 10000 об./мин. в течении 10 мин. Затем осадок дважды промывали 70% этанолом при тех же условиях центрифугирования, высушивали на воздухе и растворяли в 100 мкл стерильной воды. Выход ДНК составлял 40-50 мкг ДНК из 500 мкл цельной крови.
В процессе выделения ДНК использованы реактивы фирмы "Вектон", Санкт-Петербург, Россия и "Serva", Германия.
Для идентификации полиморфных аллелей в генах фактора V свертывания крови, р-фибриногена, протромбина, рецептора агрегации тромбоцитов ПЬ/Ша и метилентетрагидрофолат редуктазы (F V Leiden, G/A -455FGB, F2 G/A 20210, Р1А1/А2 GP Ша, С677Т MTHFR) использовали амплификацию соответствующих участков генов методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом, в генах фактора VII свертывания крови и ингибитора активатора плазминогена типа 1 (А1/А2 5 F7, 4G/5G PAI-1)- методом ШДР. Продукты ПЦР и рестрикционного анализа подвергали электрофоретическому разделению при ЗОмА (150В) в ПААГ соответствующей концентрации в трис-боратном буфере (0.9М Tris-OH, 0.9М борная кислота, 20мМ ЭДТА), продолжительность электрофореза определяли по движению в ПААГ красителей ксилен-цианола и бромфенолового синего, входящих в состав буфера для нанесения проб (водный раствор 0.25% ксилен-цианола, 0.25% бромфенолового синего, 30% глицерина), результаты визуализировали в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием (Маниатис Т. и соавт., 1984).
Амплификацию проводили на амплификаторе "Терцик" (термостат программируемый четырехканальный для проведения ПЦР анализа ТП4-ПЦР-01 - "Терцик" ТУ 9452-001-46482062-98) в микроцентрифужных полипропиленовых пробирках с крышкой объемом 500 мкл ("ФинБио") при помощи термостабильной высокопроцессивной рекомбинантной Taq ДНК полимеразы фирмы "Fermentas" (Литва).
В исследовании использовали реактивы следующих фирм: "Fisherbiotech Laboratories", США (акриламид, бисакриламид), "Serva", Германия (Tris-OH, ЭДТА, персульфат аммония, бромистый этидий), "Reanal Laboratories", Венгрия (TEMED), "Вектон", Санкт-Петербург, Россия (борная кислота), "Fermentas", Литва (смесь трифосфатов (dNTP), бычий сывороточный альбумин (BSA), рестрикционные ферменты и буферы для них), "Promega", США (буфер для ПЦР, MgCl2 для ПЦР).
Распределение аллельных вариантов генов, определяющих склонность к тромбофилии, в контрольной группе
Для анализа частот мутационных повреждений генов фактора V свертывания крови, протромбина, Р-фибриногена, фактора VII свертывания крови, РАІ-1, рецептора тромбоцитов ІІЬЯІІа и MTHFR (F V Leiden, F2 G/A 20210, G/A -455FGB, 4G/5G PAI-1, P1A1/A2 GP Ilia, C677T MTHFR, A1/A2 5 F7) в контрольной группе нами было проведено генотипирование вышеперечисленных детерминант у 199 здоровых мужчин. Распределение генотипов, а также частоты мутантных аллелей в группе контроля приведены в таблице 3.
Распределение генотипов исследуемых мутаций и полиморфизмов находится в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга. Не было выявлено ни одного носителя FV Leiden и 20210G/A F2 в гомозиготном состоянии.
Частоты полиморфных аллелей генов факторов свертывания крови V и VII, GP Ilia, MTHFR и РАІ-1 в контрольной группе здоровых мужчин не отличаются от таковых в популяции г. Санкт-Петербурга (Шейдина A.M., 2000; Волкова М.В., 2000). Частоты -455А-аллеля гена Р-фибриногена и 20210А-аллеля гена протромбина в данной контрольной группе меньше, чем в популяции: 24.1% и 27.9% (р=0.06), 0.3% и 2.7% (р=0.01), соответственно (Schwartz E.I. etal., 1999).
Чтобы определить зависимость данных фенотипических признаков от генетических и внешних факторов анализировали: 1)уровень ФГ при различных генотипах FGB и PAI-1, а также в зависимости от курения, нарушения липидного обмена, индекса массы тела (ИМТ, кг/м ) и семейной истории ИМ; 2)максимальную скорость агрегации тромбоцитов при разных генотипах GP Ша, в зависимости от курения, нарушения липидного обмена, индекса массы тела (ИМТ, кг/м2) и семейной истории ИМ; 3)антиген фактора Виллебранда, как маркер повреждения эндотелия, при генотипах MTHFR и в зависимости от курения, нарушения липидного обмена, индекса массы тела (ИМТ, кг/м2) и семейной истории ИМ. Результаты приведены в таблице 5. Уровень фибриногена плазмы крови в контрольной группе был выше у лиц с семейной историей сердечно-сосудистых заболеваний, с 4G4G генотипом PAI-1 и избыточным весом. Максимальная скорость агрегации тромбоцитов была больше у мужчин с нарушением обмена липидов. У носителей ТТ генотипа MTHFR наблюдалась тенденция к повышению антигена фактора Виллебранда.
Частоты аллелей вышеперечисленных генов не отличались в ИИ группе и в контроле, за исключением А1/А2 5 F7. Мутация фактора VII свертывания крови была детектирована у пациентов только в гетерозиготном состоянии. Инсерционный аллель гена фактора VII свертывания крови встречался у ИИ больных реже, чем в контрольной группе - 7.7% и 13.6%, различия были статистически достоверны (р 0.05). Носительство данной мутации уменьшало риск острого ишемического инсульта вдвое - OR=0.52 (СІ 95% 0.29-0.94), соответственно отсутствие А2 аллеля увеличивало риск развития ИИ у мужчин молодого возраста - OR=l .91 (СІ 95% 1.06-3.43).
Среди ИИ больных не было найдено ни одного носителя лейденской мутации фактора V и РГ 2 полиморфизма гена GP Ша в гомозиготном состоянии. Кроме того, ни у кого из обследуемых не был обнаружен 20210G/A полиморфизм гена протромбина.
У пациентов с ИИ измерялись следующие биохимические параметры: уровень фибриногена плазмы крови (ФГ, г/л), уровень общего гомоцистеина в плазме крови (tHcy, мкмоль/л), а также показатели внутрисосудистой активации тромбоцитов (ВАТ). Полученные результаты сравнивали с установленными нормальными значениями и уровнем в контрольной группе. Одновременно, анализировали влияние генетических и приобретенных факторов риска развития сосудистых заболеваний на уровень фибриногена, гомоцистеина и активацию тромбоцитов. Отдельно рассматривались значения ФГ, tHcy и ВАТ у лиц с повторными ИИ.
