Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирусы семейства Flaviviridae являются возбудителями опасных инфекционных заболеваний человека и животных, таких как желтая лихорадка, геморрагическая лихорадка Денге, японский энцефалит, клещевой энцефалит и др. Актуальность изучения вирусов этого семейства обусловлена их постоянной циркуляцией в природных очагах, приводящей к периодическим вспышкам вызываемых этими вирусами заболеваний.
Характерной особенностью флавивирусов, существенно затрудняющей их молекулярно-биологаческое изучение, является опасность работы для исследователя с вирусным материалом, инфекционность РНК, низкие уровни продукции вирусспецнфи-ческого материала при культивировании флавивирусов. Вызванная этими обстоятельствами ограниченная доступность очищенных препаратов вирусной РНК и белков отрицательно сказалась на изучении фундаментальных основ развития флавивирусных инфекций в клетках и организме, а также на решении практически важных проблем - создании эффективных средств диагностики и профилактики флавивирусных заболеваний.
Применение современных методов иммунологии и генной инженерии позволило значительно продвинуться в изучении флавивирусов на молекулярном уровне: получены данные о структуре геномов, антигенной структуре белка оболочки вирионов, определены нуклеотидные последовательности вирусных РНК, созданы библиотеки клонов, содержащие фрагменты кДНК вирусных геномов. Однако функции некоторых вирусных белков, а также роль клеточных компонентов на разных этапах репродукции вируса остаются
невыясненными. Одним из новых перспективных подходов к изучению биологии и патогенеза вирусов является направленное изменение вирусных геномов. Необходимым этапом для этого является создание стабильного кДНК-клона, с которого вирусная РНК может быть синтезирована in vitro.
Цель работы. Цель настоящей работы состояла в конструировании и клонировании в составе плазмидного вектора в E.coli стабильной полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ для синтеза in vitro индивидуальной вирусной РНК и изучения ее взаимодействіи с вирусспецифическими и клеточными белками. Для этого было необходимо синтезировать и клонировать в плазмидном векторе недостающие фрагменты вирусной кДНК, которые соответствуют нетранслируемым областям геномной РНК, разработать стратегию и осуществить клонирование полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ, ввести в структуру рекомбинантной плазмиды участки, необходимые для транскрипции вирусной РНК in vitro, осуществить транскрипцию вирусной РНК in vitro с использованием в качестве матрицы клонированной кДНК ВКЭ, выявить при помощи синтетического транскрипта РНК-связывающие белки, присутствующие в контрольных и инфицированных ВКЭ клетках.
Научная новизна и практическая ценность работы. В процессе работы синтезированы и клонированы в плазмидном векторе фрагменты кДНК нетранслируемых областей генома ВКЭ (штамм Софьин), исследована их нуклеотидная последовательность. Впервые для флавивирусов показана гетерогенность З'-нетранслируемой области вирусной РНК по длине и первичной структуре внутри одного штамма вируса.
На основе имеющейся библиотеки кДНК ВКЭ с использованием
вновь клонированных фрагментов кДНК некодирующих областей впервые для вируса клещевого энцефалита сконструирована стабильная полноразмерная ДНК-копия генома. Вирусная кДНК клонирована под контроль промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага SP6, что обеспечивает возможность получения индивидуальной вирусной РНК.
При использовании полноразмерной ДНК-копни генома ВКЭ в качестве матрицы и ДНК-зависимых РНК-полимераз бактериофагов SP6 и Т7 осуществлен синтез полноразмерной РНК ВКЭ в системе транскрипции in vitro. Радиоактивно меченый транскрнпт использован для изучения взаимодействия вирусной РНК с вирусспеиифическими и клеточными белками. Выявлены два клеточных РНК-связывающих белка с молекулярными массами ЗОкДа и 22кДа, которые взаимодействуют с синтезированной in vitro РНК ВКЭ как в присутствии (зараженные ВКЭ клетки), так и в отсутствие вирусных белков (незараженные клетки).
Конструирование стабильной полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ, обеспечивающей синтез вирусной РНК in vitro, открывает широкие возможности для исследования генетической экспрессии и репликации вируса, изучения функций отдельных вирусспецифических белков и роли клеточных компонентов в вирусном патогенезе. Модификация генома ВКЭ на уровне кДНК при помоши сайт-направленного мутагенеза, делеций, вставок позволит продвинуться в изучении молекулярных основ патогенности вируса, что в перспективе может привести к созданию ослабленных (аттенуированных) вариантов вируса, пригодных в качестве живых вакцин.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, получено авторское свидетельство на изобретение. Результаты работы были представлены на 3-ем международном симпозиуме "Positive strand RNA viruses" (Флорида, 1992 г.), 1-ом европейском совещании по вирусологии (Вюрцбург,
-
г.), Х-ом международном конгрессе по вирусологии (Иерус&тим,
-
г.), международной научной конференции "Вирусные, риккет-сиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами" (Иркутск, 1996 г.).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 111 страницах, включающих 24 рисунка, 5 таблиц и список литературы (170 ссылок). Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и выводов. Глава 1 - "Инфекционные транскрипты и кДНК-клоны РНК-содержаших вирусов" (Литературный обзор). Глава 2 содержит изложение и обсуждение результатов, полученных в работе. Глава 3 -экспериментальная часть.
