Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о методах изучения биохимического потребления кислорода 12
1.1. Классификация методов измерения концентрации растворенного кислорода 13
1.1.1. Физические методы 13
1.1.2. Химические методы 15
1.1.3. Оптические методы 16
1.1.4. Электрохимические методы 16
1.1.5. Прочие методы 19
1.2. Полярографический метод измерения концентрации растворенного кислорода 20
1.2.1. Принцип полярографического метода 21
1.2.2. Полярографическое обнаружение кислорода и измерение его концентрации 27
1.2.3. Закрытые полярографические кислородные датчики 33
1.3. Факторы, влияющие на точность динамического измерения биохимического потребления кислорода 43
1.3.1. Автопотребление 44
1.3.2. Осмотические явления на мембранах закрытых кислородных датчиков 46
1.3.3. Диффузия атмосферного кислорода в среду инкубации 48
1.3.4. Собственная емкость закрытых кислородных датчиков 54
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 58
2.1. Объекты исследования 58
2.1.1. Кислородный датчик 58
2.1.2. Измерительная ячейка 61
2.1.3. Вспомогательное оборудование 63
2.1.4. Модельная система 66
2.2. Методы исследования 67
2.2.1. Подготовка измерительной системы 67
2.2.2. Запись кривых поглощения 70
2.2.3. Контроль поглощения кислорода объемным методом 71
2.2.4. Запись кривых насыщения 73
2.2.5. Измерение собственной кислородной емкости системы 73
2.2.6. Статистическая обработка результатов 74
ГЛАВА 3. Выявление факторов, оказывающих искажающее воздействие на результаты измерения биохимического потребления кислорода биологическими объектами 77
3.1. Анализ ошибок, допускаемых при изучении потребления кислорода биологическими объектами 77
3.2. Основные подходы к моделированию процессов, происходящих в измерительной системе во время изучения потребления кислорода биологическими объектами 89
3.2.1. Моделирование аэробного биологического объекта 89
3.2.2. Моделирование инкубационной среды 96
3.2.3. Моделирование закрытого кислородного датчика 98
ГЛАВА 4. Влияние диффузии атмосферного кислорода в инкубационную среду на результаты измерения потребления кислорода 106
4.1. Изучение динамики диффузии кислорода из атмосферы в среду инкубации 106
4.2. Калибровка измерительной системы на поступление кислорода из атмосферы в среду инкубации 115
4.3. Корректировка результатов измерения 121
ГЛАВА 5. Собственная кислородная емкость измерительной системы и ее влияние на результаты измерения потребления кислорода 129
5.1. Вычисление собственной кислородной емкости измерительной системы по косвенным данным 129
5.2. Экспериментальное определение собственной кислородной емкости измерительной системы 132
5.2.1. «Быстрая» кислородная емкость 136
5.2.2. «Медленная» кислородная емкость 142
5.3. Корректировка результатов измерения потребления кислорода на
влияние собственной кислородной емкости измерительной системы 150
Заключение 154
Выводы 157
Литература
- Химические методы
- Измерительная ячейка
- Основные подходы к моделированию процессов, происходящих в измерительной системе во время изучения потребления кислорода биологическими объектами
- Калибровка измерительной системы на поступление кислорода из атмосферы в среду инкубации
Введение к работе
Актуальность исследования Молекулярный кислород является без преувеличения важнейшим метаболитом аэробного обмена, имеющим ключевое значение в энергообеспечении организма Поэтому уровень и характер биохимического потребления кислорода обычно рассматривается как основной показатель метаболической активности тканей, клеток и субклеточных структур Современные биохимические измерительные приборы, предназначенные для регистрации данного показателя, обладают вполне приемлемыми техническими характеристиками Тем не менее реальные результаты измерения биохимического потребления кислорода, согласно литературным данным, отличаются неоправданно низкой воспроизводимостью ошибка среднего, которая в биохимических исследованиях используется для характеристики разброса показаний, при измерении метаболического потребления кислорода обычно составляет порядка 12% от измеряемой величины (Горская И.А, 1988, Капитанов А Б. и др, 1990; Меер-сон Ф 3, 1995 и др ), а довольно часто (Schurek H.J et a, 1990, Ortmann С , 2003, Suttner S et a, 2004 и др ) достигает 30 и более процентов В результате корректной оказывается только сравнительная интерпретация полученных данных
Подобное несоответствие между характеристиками оборудования и точностью полученных с его помощью результатов объясняется тем, что изменение концентрации кислорода в инкубационной среде, фиксируемое прибором, зависит не только от биохимического потребления кислорода изучаемым объектом, но и от диффузионных потоков кислорода между средой инкубации и ее окружением (Миняев М.В и др , 1996, 2001, 2005, 2006, 2007), которые по величине сравнимы, а зачастую и превышают биохимическое потребление Поэтому задача по выявлению и изучению факторов, определяющих величину и направление этих потоков, является актуальной, так как ее решение позволило бы существенно повысить точность биохимических исследований, связанных с изучением аэробного метаболизма и, как следствие, осуществить строгий количественный подход к изучению его важнейших биохимических механизмов
Решение данной задачи с использованием аэробных биологических объектов оказалось крайне затруднительным по ряду причин, основной из которых явилась невозможность определения действительного количества потребленного ими кислорода и, следовательно, расчета наиболее важной количественной характеристики метода - относительной погрешности Поэтому возникла необходимость моделирования биохимического процесса потребления кислорода с привлечением устойчивой, простой, доступной и воспроизводимой химической модели, так как действительное количество кислорода, поглощенное моделью, в отличие от биологического объекта, может быть легко проконтролировано Использование подобной модели
позволяет определять важнейшие динамические характеристики существующего оборудования, а также значительно облегчает разработку новой специальной биохимической аппаратуры, предназначенной для изучения аэробного метаболизма, что также является весьма актуальным
Целью исследования явилось выявление и изучение факторов, искажающих результаты измерения биохимического потребления кислорода биологическими объектами в малых объемах жидких инкубационных сред, и разработка специальной биохимической аппаратуры и методических подходов, позволяющих устранить или учесть влияние данных факторов для существенного повышения точности такого рода измерений
6 задачи исследования входило
1) разработать эталонную химическую модель, имитирующую биохимиче
ское потребление кислорода в жидких инкубационных средах, позволяю
щую точно контролировать действительное количество поглощенного ки
слорода,
-
путем химического моделирования метаболического потребления кислорода выявить факторы, оказывающие наибольшее искажающее влияние на результаты измерения потребления кислорода в малых объемах жидких инкубационных сред,
-
разработать конструкцию измерительной системы на базе амперометри-ческого кислородного датчика, обладающую низкой собственной кислородной емкостью и позволяющую легко изменять и точно контролировать площадь поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации
-
изучить динамику пассивной диффузии кислорода из атмосферы в инкубационную среду открытой измерительной ячейки при различной площади поверхности раздела фаз воздух-среда,
-
разработать метод учета количества кислорода, поступившего в среду инкубации из атмосферы за время проведения замера биохимического потребления кислорода, и вычисления соответствующей поправки к результату измерения,
-
изучить динамику обмена кислородом между средой инкубации и собственной кислородной емкости измерительной системы в ходе замера потребления кислорода моделью биологического объекта,
-
разработать метод определения собственной кислородной емкости измерительной системы и ее количественного вклада в погрешность измерения для вычисления соответствующей поправки к результату измерения биохимического потребления кислорода
Научная новизна полученных данных. Впервые проведено исследование, в котором, путем моделирования биохимического потребления кислорода аэробным биологическим объектом, было изучено влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы на результаты измерения потребления кислорода, полученные с помощью закрытого амперометрического кислородного датчика На осно-
вании полученных данных разработана специальная биохимическая аппаратура и комплексный методический подход, позволяющие кардинально повысить точность подобных измерений и в значительной мере устранить искажения характера регистрационных кривых биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах
Основные положения, выносимые на защиту. Неучтенный кислород, поступающий в среду инкубации из атмосферы, способствует существенному занижению результатов измерения биохимического потребления кислорода в открытых измерительных системах Предлагаемый в данной работе метод позволяет учесть поступивший из атмосферы кислород и, таким образом, снизить погрешность измерения до уровня, характерного для закрытых измерительных систем
Существующие приборы, предназначенные для измерения концентрации растворенного кислорода, обладают собственной кислородной емкостью Диффузионный обмен кислородом между средой инкубации и кислородной емкостью измерительной системы ведет к заметному искажению результатов измерения биохимического потребления кислорода Предлагаемый в данной работе метод предоставляет возможность определения как самой кислородной емкости, так и ее количественного вклада в величину погрешности результата измерения потребления кислорода, что позволяет существенно повысить точность такого рода измерений
Конструкции выпускаемых промышленностью электрохимических измерительных приборов, предназначенных для регистрации метаболического потребления кислорода, не позволяют в достаточной мере учесть влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы на результаты измерения, чем обусловлена неоправданно высокая погрешность при их использовании в биохимических исследованиях Предлагаемая в данной работе измерительная система дает возможность снизить погрешность динамического измерения биохимического потребления кислорода до уровня погрешностей используемого оборудования
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят определенный вклад в экспериментальную биохимию аэробного метаболизма, позволяя с иной точки зрения взглянуть на интерпретацию результатов измерения биохимического потребления кислорода, что дает возможность отдифференцировать биохимические и физико-химические причины регистрируемых изменений измеряемой величины при изучении потребления кислорода биологическими объектами Большинство из выявленных в работе закономерностей являются универсальными, то есть в той или иной мере присущими любым измерительным системам, предназначенным для изучения биохимического потребления кислорода, вне зависимости от принципа их действия Поэтому предлагаемый комплекс методических подходов может быть использован с любым
биохимическим оборудованием подобного назначения, как существующим, так и перспективным
Предложенный в работе подход к корректировке результатов измерения позволяет существенно повысить точность методов измерения биохимического потребления кислорода, что дает возможность обратиться к изучению тонких биохимических механизмов аэробного метаболизма, а также к исследованию биологических объектов, характеризующихся низким потреблением кислорода Результаты исследования позволяют систематизировать подходы к выбору существующих и конструированию новых электрохимических датчиков и ячеек, предназначенных для биохимических и биоэнергетических исследований
Разработанное оборудование, методы и полученные результаты используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре биомедицины Тверского государственного университета в курсе лекций, большом практикуме, а также при подготовке курсовых и дипломных работ студентов
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на научных конференциях студентов и аспирантов биологического факультета ТвГУ в 1995,1998,1999,2000 и 2003 годах
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 статей
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, 5 глав, заключение, выводы, список литературы Работа изложена на 179 страницах, документирована таблицами (25) и иллюстрирована рисунками (37) Список литературы включает 114 отечественных и 84 зарубежные работы
Химические методы
Методы определения концентрации растворённого кислорода, по заложенным в них принципам, обычно подразделяются на три основные группы: физические, химические и физико-химические [6, 8, 87, 143, 176]. Но подобную классификацию, при всей её методологической строгости, нельзя признать удобной, так как практическая реализация методов, относящихся к различным группам, зачастую весьма сходна, например, среди объёмных методов встречаются как физические, так и химические [8]. С другой стороны, методы, объединённые общим принципом (спектрометрические) могут существенно различаться по исполнению: масс-спектрометрические [133, 150, 197], парамагнитные [41, 153], оптические [19, 59, 184 и др.]. По этой причине более удобной с практической точки зрения является классификация, рассмотренная в обзоре А.Ш.Гройсмана и Н.Е.Хомутова [28], в основу которой положены не только принципы методов, но и особенности их практической реализации. По этой классификации методы измерения концентрации кислорода подразделяются на следующие группы: физические, химические, оптические, электрохимические и прочие.
В основе гравиметрического метода лежит реакция окисления водорода кислородом исследуемой газовой смеси. Образовавшаяся вода поглощается соответствующим поглотителем. Содержание кислорода в смеси вычисляется по значению разности масс поглотителя до и после поглощения воды. Погрешность определения концентрации кислорода гравиметрическим методом обычно находится в пределах 0,1 - 3,0% [8].
Волюмометрический метод [151] также основан на сожжении водорода в исследуемой газовой смеси, которое проводится либо путем взрыва, либо путем пропускания исследуемой смеси и водорода через раскаленный платиновый капилляр [18, 194]. В обоих случаях расходуются один объем кислорода исследуемой газовой смеси и два объема водорода с образованием воды, то есть содержание кислорода составляет 1/3 от убыли объема газовой смеси [8]. Погрешность волюмометрических методов составляет 0,3 - 0,7% [28]. Гравиметрический и волюмометрический методы в принципе могут быть использованы и для определения растворённого кислорода, но в этом случае кислород должен быть предварительно выделен из раствора [28].
Манометрический метод основан на измерении изменения давления пробы анализируемой газовой смеси в постоянном объёме при избирательном поглощении кислорода [8, 148]. В качестве поглотителей кислорода в газовых смесях или растворах обычно используются фосфор, щелочной раствор пирогаллола, хлористый хром и другие вещества [18, 23]. Особой разновидностью манометрического метода является широко применяемый в биохимических исследованиях метод Варбурга [24], который основан на определении изменения давления воздуха над раствором, где происходит потребление кислорода. Для поглощения образующейся при этом углекислоты обычно используются растворы NaOH, КОН или карбо-натно-бикарбонатные буферные растворы [97], а для поглощения аммиака -растворы кислот [24]. Обычная ошибка манометрического определения 5 -10% [97].
Сравнительно высокой точности физических методов сопутствует ряд существенных недостатков, затрудняющих работу с биологическими объектами, к которым относятся необходимость использования больших объёмов проб и дегазации жидкости, многократной градуировки, контроля чистоты кислорода, создания больших термостатов, длительность и трудоёмкость анализа, невозможность непрерывного контроля содержания кислорода и др. [24, 28].
Среди химических методов определения концентрации растворенного кислорода наибольшее распространение получил метод Винклера [18, 146, 165]. В его основе лежит реакция окисления Мп(ОН)2 молекулярным кислородом, растворенным в исследуемой жидкости в сильнощелочной среде. При подкислении в присутствии иодида выделяется свободный йод в количестве, эквивалентном концентрации растворённого кислорода, который определяют титрованием тиосульфатом натрия [28]. Погрешность определения содержания растворенного кислорода этим методом составляет 0,5% [60, 143]. Чувствительность и точность метода могут быть заметно улучшены при использовании потенциометрического и амперомет-рического титрования [101, 143].
Основными недостатками метода Винклера являются высокая чувствительность к примесям [54, 60] и невозможность использования для измерений in situ [28], по этой причине данный метод обычно используется лишь для градуировки приборов, а также для проверки других методов [123,124].
Измерительная ячейка
Следует отметить, что в зависимости от химической природы частицы, состава электролита и материала электрода, для начала электрохимической реакции ее восстановления требуется своя определенная энергия активации, поэтому для каждого вещества существует свое минимальное значение потенциала катода Е, начиная с которого процесс восстановления протекает с измеримой скоростью. Таким образом, для каждого способного к восстановлению вещества (деполяризатора) при соответствующем потенциале электрода на вольт-амперной кривой будет обнаруживаться скачок тока (диффузионный ток), что позволяет идентифицировать каждый компонент раствора.
С другой стороны, скорость электрохимической реакции на катоде, а значит и ток в ячейке, будут пропорциональны потенциалу катода лишь при условии неограниченной доступности деполяризатора. А так как в ходе электрохимической реакции происходит его потребление, концентрация деполяризатора у поверхности катода падает тем ниже, чем выше потенциал. В этих условиях ток в ячейке начинает лимитироваться уже не потенциалом катода, а скоростью диффузии деполяризатора из толщи раствора к поверхности электрода. Скорость переноса вещества к электроду стационарной диффузией описывается уравнением площадь сечения раствора, через которое происходит диффузия (примерно равна площади электрода); Со и Cs - концентрации деполяризатора в объеме раствора и у электрода, D - коэффициент диффузии, д - толщина диффузионного слоя. Подставляя значение скорости диффузионного переноса вещества в уравнение 5 и принимая, что концентрация деполяризатора у электрода Cs с увеличением потенциала стремится к нулю, получим выражение: согласно которому, при высоких значениях потенциала электрода ток в полярографической ячейке пропорционален концентрации деполяризатора в растворе и не зависит от потенциала, что на вольт-амперной кривой должно отражаться в виде отлогого участка (предельный ток). Таким образом, анализ вольт-амперных кривых, полученных в полярографической ячейке, даёт информацию как о химической природе деполяризатора, так и о его концентрации в растворе. Типичная форма кривой изменения тока в зависимости от потенциала индикаторного электрода полярографической ячейки (полярографическая волна) схематически изображена на рисунке 1.
Участку а - 6 на рисунке соответствует остаточный ток, наличие которого объясняется присутствием в растворе легковосстанавливающихся примесей [41] и некоторыми другими причинами [48]. Участок б - г отражает изменение диффузионного тока, который в точке в достигает предельного значения. Последующее увеличение тока в точке г объясняется началом восстановления следующего компонента раствора {разряд фона) [8, 24, 48]. Потенциал электрода Еу„ при котором ток составляет половину предельного (потенциал полуволны) не зависит от концентрации и являет 25 ся своего рода константой, позволяющей определить химическую природу вещества, восстанавливающегося на катоде [8, 41].
Схема классической полярографической установки с ртутно-капельным электродом представлена собой стеклянный сосуд с электролитом 6. В ячейке помещены два электрода: ртутно-капельный катод 1 и анод 2, представляющий собой слой ртути на дне ячейки. Отсутствие поляризации анода в данном случае объясняется его большой площадью. Довольно часто в качестве анода применяют и другие неполяризующиеся электроды: хлорсеребряный или каломельный. Напряжение (2 - 4 В) от внешнего источника питания 6 через реостат 5 подается на ртутные электроды полярографической ячейки. Ток, проходящий через ячейку, измеряют микроамперметром 4, а напряжение, подаваемое на ячейку, регулируют перемещением движка на реостате 5 от нуля (крайнее нижнее положение) до максимума (крайнее верхнее положение).
Современные полярографы включают в себя принципиально те же элементы, которые были предусмотрены в конструкции Гейровского и Шикаты [25]. Такими элементами являются: источник питания электродов, делитель напряжения (реохорд), прибор для измерения силы тока в цепи и различные вспомогательные механизмы [8, 22, 48 и др.]. По характеру источника питания электродов различают постояннотоковые [8, 41, 43 и др.] и переменнотоковые (импульсные) полярографы [14, 32, ПО и др.]. В первых поляризующее напряжение подается на электроды от аккумулятора, сухих батарей или схемы, представляющей собой стабилизированный выпрямитель. В переменнотоковых полярографах на электроды, кроме постоянной составляющей, подается переменное напряжение с различной формой импульса. По характеру измерения силы тока в цепи электродов все существующие в настоящее время полярографы можно разделить на три основных типа [48, 89]: I - полярографы с непосредственным измерением сигнала; II - полярографы с предварительным усилением сигнала и регистрацией при помощи автоматических потенциометров (электронные полярографы); III - осциллографические полярографы. Все типы полярографов предназначены для физико-химического анализа различных органических и неорганических веществ и вполне пригодны для измерения концентрации или парциального давления кислорода в растворах.
Основные подходы к моделированию процессов, происходящих в измерительной системе во время изучения потребления кислорода биологическими объектами
Постоянство температуры измерительной и вспомогательной ячеек (37С) поддерживалось подключенным к их водяным рубашкам термостатом UTU-4/84 (ПНР). Схема подключения ячеек к термостату изображена на рисунке 14.
Постоянная температура жидкости в более инертной измерительной ячейке регулировалась контактным термометром термостата, а температура в дополнительной ячейке устанавливалась путем регулировки тока воды из термостата зажимом грубой настройки. Более точная регулировка осуществляется зажимом точной настройки, ограничивающем отток теплоносителя через шунт. Контроль за температурой жидкости в ячейках осуществляется при помощи двух калиброванных лабораторных термометров ( в дополнительной ячейке постоянно, а в измерительной - только при подготовке системы к работе).
Для приготовления бескислородных растворов и удаления кислорода из инкубационной среды без изменения ее солевого состава использовался баллон с азотом, снабженный редуктором [166]. Для предотвращения испарения воды из жидкостей, через которые продувался азот, его предварительно прогревали примерно до 37С и насыщали водяным паром, продувая через колбу, заполненную водой, погруженную в теплоноситель термостата.
Такой же сосуд использовался для подогрева и насыщения водяным паром воздуха в процессе приготовления инкубационной среды. В этом случае подача воздуха осуществлялась при помощи перистальтического насоса 372.С (Пр-во ПНР). Кроме того, насос использовался для удаления отработанной среды и промывной жидкости из измерительной ячейки, а также для создания разряжения в процессе приготовления промывной жидкости.
В качестве модели, имитирующей потребление кислорода биологическим объектом, использовалась система, состоящая из инкубационной среды и поглотителя кислорода.
Модельная инкубационная среда представляла собой насыщенный кислородом раствор КС1 с концентрацией 60 г/л. Состав среды и концентрация ее компонентов определялись свойствами электролита датчика (КС1 60 г/л + КНСОз 0,3 г/л) таким образом, чтобы среда, с одной стороны, не содержала примесей, способных повлиять на взаимодействие поглотителя с растворенным в среде кислородом, а с другой - чтобы осмотические свойства электролита и среды практически не различались.
Инкубационная среда использовалась не только для проведения реакции, но также для промывки измерительной ячейки между замерами и для калибровки измерительной системы (установка 100%). Объем инкубационной среды во всех, представленных в данной работе, замерах составлял 3,5 мл, что существенно облегчало сопоставление результатов различных экспериментов.
В качестве модели аэробного биологического объекта использовался -0,01М свежеприготовленный раствор Na2S03, концентрация которого перед каждым замером уточнялась путем трехкратного титрования [66]. Объем поглотителя во всех, представленных в данной работе, замерах составлял 100 мкл. Действительный объем поглотителя в каждом эксперименте уточнялся путем гравиметрической калибровки микродозатора.
Для сохранения солевого состава реакционной смеси во время калибровки измерительной системы (запись кривых насыщения) к инкубационной среде добавлялся имитатор поглотителя, в качестве которого использовался 0,01М раствор Na2SOi.
Во избежание ускоренного старения электродов кислородного датчика во время длительных ( 6 часов) перерывов в работе, измерительную ячейку заполняли поглощающим кислород раствором Na2S03 (50 г/л) и хранили при комнатной температуре. Таким образом, в исходном состоянии измерительная система (ячейка + датчик) не содержали кислорода и имели температуру окружающей среды. По этой причине подготовка системы к работе должна была включать следующие этапы:
Установка исходного кислородного режима. Необходимость третьего этапа объясняется тем, что раствор Na2S03 извлекает из электролита датчика только кислород, тогда как парциальное давление азота в электролите на всех этапах хранения и работы датчика сохраняется примерно равным его парциальному давлению в атмосфере. По этой причине, по мере прогрева электролита от комнатной до рабочей температуры (37С), происходит снижение растворимости азота в электролите и его частичный переход в газовую фазу, что проявляется как возникновение пузырьков в резервуаре датчика.
Под кислородным режимом в данном случае подразумевается содержание кислорода в собственной кислородной емкости измерительной системы. Использованное в работе оборудование дает возможность поддержания двух различных исходных кислородных режимов:
Режим «100» являлся исходным для всех замеров потребления кислорода, а режим «0» использовался в качестве исходного при записи кривых насыщения и прямом определении кислородной емкости системы. В зависимости от необходимости установки того или иного кислородного режима, процесс подготовки системы к работе существенно видоизменялся, что заключалось в изменении порядка следования этапов, а также в совмещении отдельных этапов подготовки.
Установка исходного кислородного режима «100».
При помощи перистальтического насоса из измерительной ячейки извлекают раствор сульфита натрия, после чего ячейку дважды промывают инкубационной средой. Затем обе ячейки (измерительную и дополнительную) заполняют инкубационной средой, включают магнитные мешалки, дополнительную ячейку закрывают пробкой с воздушным холодильником и включают термостат.
Спустя 30-40 мин, когда температура в измерительной ячейке достигнет 32 - 35С, начинают извлечение газовых пузырьков. Для этого ячейку трижды промывают инкубационной средой, предварительно выдержанной при разрежении, создаваемом перистальтическим насосом, при температуре около 40С. Каждую порцию промывной жидкости выдерживают в ячейке до тех пор, пока кислородомер не покажет возрастание концентрации кислорода на 10% от исходного значения. Предварительные эксперименты, сопряженные с частичной разборкой измерительной системы для визуального контроля, показали, что изложенный метод гарантирует надежное удаление самопроизвольно возникающих в электролите датчика газовых пузырьков перед началом работы, но по мере использования датчика пузырьки возникают вновь, что по-видимому связано с очень медленным прогревом электролита в нетермостатированном корпусе модельного датчика (ПКЕ).
Калибровка измерительной системы на поступление кислорода из атмосферы в среду инкубации
Одним из факторов, заметно искажающих результаты измерения потребления кислорода, может являться постоянный обмен кислородом между средой инкубации и атмосферой (гл. 3). По этой причине нами была предпринята попытка изучения динамики диффузии кислорода в среду в зависимости от площади поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации с использованием модели закрытого кислородного датчика (ПКЕ). Чтобы исключить искажения результатов, связанные с осмотическими явлениями на мембране кислородного датчика, замеры производились в модельной инкубационной среде (п. 3.2.2, гл. 3), изоосмотической по отношению к электролиту датчика.
Эксперимент заключался в том, что измерительную ячейку в исходном кислородном режиме «0» (п. 2.2.1, гл. 2) заполняли 3,5 мл модельной инкубационной среды, добавляли 100 мкл имитатора поглотителя (0,01М Na2S04), чтобы вызвать снижение концентрации солей в среде, описанное в п. 3.2.1 главы 3, и продували азотом, насыщенным водяным паром, до тех пор, пока перо регистратора не устанавливалось на нуле. После этого продувку прекращали, закрывали ячейку плавающей перегородкой и производили непрерывную регистрацию изменения парциального давления кислорода в инкубационной среде за счет ее пассивного насыщения кислородом из атмосферы (п. 2.2.4, гл. 2). Когда парциальное давление кислорода в среде достигало 70% от парциального давления кислорода в атмосфере, регистрацию останавливали.
Использование в данном эксперименте измерительной системы в исходном кислородном режиме «0» объясняется тем, что исходно «пустая» кислородная емкость на всем протяжении насыщения ячейки сможет выступать только как дополнительный потребитель кислорода, тогда как емкость, исходно насыщенная кислородом, на ранних этапах (при высоких скоростях насыщения среды) окажется дополнительным источником, а на более поздних, когда среда будет близка к насыщению, - дополнительным потребителем кислорода. В подобном случае кривая насыщения характеризовалась бы наличием перелома, что вызвало бы существенные затруднения при ее обработке.
Для оценки влияния площади поверхности раздела фаз на скорость диффузии кислорода, эксперимент проводился в трех вариантах: 1) при площади контакта 183 мм («открытая» ячейка); 2) при площади контакта 89 мм2 («полузакрытая» ячейка); 3) при площади контакта 16 мм («закрытая» ячейка).
Площадь контакта инкубационной среды с атмосферой вычислялась как разность площади внутреннего сечения измерительной ячейки и площадей плавающих полиэтиленовых перегородок (п. 2.1.2, гл. 2) различного диаметра [72]. Кривизна мениска жидкости при вычислении площади не учитывалась. Запись кривых насыщения каждого из трех вариантов производилась в десятикратной повторности.
Усредненные варианты полученных кривых насыщения показаны на рисунке 21, где цифрами 7, 2 и 3 здесь и далее обозначены кривые, полученные соответственно в открытой, полузакрытой и закрытой ячейках.
Кривые насыщения инкубационной среды атмосферным кислородом в открытой (1), полузакрытой (2) и закрытой (3) ячейках (по средним значениям).
Как видно из рисунка, скорость насыщения инкубационной среды атмосферным кислородом проявляла отчетливую зависимость от площади поверхности раздела фаз: время насыщения системы до 70%-ого уровня колебалось от 10 минут для открытой ячейки до более чем 3 часов для закрытой. Тем не менее было показано, что даже при предельном сокращении площади поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации, скорость насыщения среды оставалась вполне ощутимой.
Так как одной из задач настоящего исследования является разработка метода учета количества кислорода, поступающего из атмосферы в среду инкубации во время измерения потребления кислорода биологическими объектами, нами была предпринята попытка выявить зависимость между парциальным давлением кислорода в среде и скоростью его диффузии из атмосферы, на которой могло бы базироваться вычисление соответствующей поправки к результату измерения.
Поэтому обработку полученных кривых насыщения производили следующим образом: фрагмент кривой (30 - 70%) разбивали на участки (дЛ; АРЇ, Д/ З;...И Т.Д.), как показано на рисунке 22, каждый из которых соответствовал двухпроцентному изменению парциального давления кислорода в среде (от 28 до 30%; от 30 до 32%; от 32 до 34%;...и т.д. до 70%). Затем по кривой насыщения определяли время, необходимое для двухпроцентного изменения парциального давления кислорода на каждом из участков (Atu At2; д 3;...и т.д.).
Результаты, полученные при обработке 30 кривых насыщения (для каждой площади контакта инкубационной среды с атмосферой записывалось по 10 кривых) сведены в таблицу 12, где в графе «участок кривой», представлены границы «двухпроцентных» участков. Как видно из таблицы, время насыщения инкубационной среды атмосферным кислородом значительно увеличивалось по мере снижения площади поверхности раздела фаз воздух-среда. При этом наиболее заметные различия (в абсолютном выражении) наблюдались при высоких значениях парциального давления кислорода в среде инкубации.
