Содержание к диссертации
Введение
1. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРЕДШЕСТВУЮЩИХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
1.1 Гидразины и активные формы кислорода (АФК) - биологические свойства 14
1.2 Гидразины - онкология — мутагенез 16
1.3 Канцерогенные продукты, образующиеся при распаде (окислении) гидразинов 19
1.4. Компоненты клетки, являющиеся объектами атаки гидразинов и продуктов их окисления 20
1.5 Образование АФК в клетке , 22
1.6 Участие АФК в процессах митоза и апоптоза 23
1.7 ДНК - вторая очевидная мишень АФК в клетке 24
1.8 Активные формы кислорода (АФК) - экологически значимые составляющие окружающей среды 25
2. ВЫБОР МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ, ОБОРУДОВАНИЯ И РЕАКТИВОВ.
2.1 Выбор методов и средств аналитического контроля для проведения исследований 30
2.2 Методики 31
2.3 Оборудование иприборы 34
2.4 Реактивы иматериалы 35
3. РАЗРАБОТКА ТЕОРЕТИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1 Гептил, как фактор, изменяющий нормальный уровень АФК в водных системах 36
3.2 Проблема «внешней» токсичности 37
3.3 Конкретная задача работы 38
3.4 Роль гомеостаза АФК 39
3.5 Базовая реакция. Образование АФК в воде 40
4. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1 Качественная характеристика водных систем, как генераторов Н202 43
4.1.1 Особенности процесса образования Н202 в чистой воде 43
4.1.2 Влияние органических добавок на процессы генерации Н202 в воде 54
4.1.3 Влияние света на уровень Н202 в системе «вод а-растение». 59
4.2 Генерация Н202 в водных системах, содержащих гептил 64
4.2.1 Влияние низких концентраций гептила на генерацию Н202 в дистиллированной воде 64
4.2.2 Исследование влияния света на генерацию Н202 в системе «гептил - вода» 70
4.2.3 Совместное влияние гептила и углеродсодержащих органических примесей на генерацию АФК в водных системах на свету и в темноте 71
4.2.4 Изучение влияния гептила на образование Н202 в системе «вода - растение — гептил» 74
4.2.5 Поиск соединений, снижающих эффект гептила на уровень АФК в водных средах 80
5. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДНЫХ СРЕД ЗАГРЯЗНЕННЫХ ГЕПТИЛОМ.
5.1 Использования метода биолюминесцентного анализа при экологическом мониторинге территорий загрязненных гептилом 89
5.2 Результаты экспериментальной отработки метода в полевых условиях 97
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 101
ЛИТЕРАТУРА 105
Введение к работе
Как известно [18, 28, 34, 35] на многих отечественных и зарубежных ракетах-носителях (РН), разгонных блоках (РБ), космических аппаратах (КА), межконтинентальных баллистических ракетах (МБР) в качестве одного из компонентов ракетного топлива (КРТ) десятки лет используется и будет продолжать использоваться еще длительный период несимметричный диметилгидразин (НДМГ), другое название - гептил.
НДМГ относится к первому классу опасности. Токсичен при любых путях поступления в организм — через желудочно-кишечный тракт, органы дыхания, кожу и слизистые [11, 111, 120, 130], Обладает отдаленными эффектами воздействия. Потенциальная опасность при попадании в объекты окружающей среды определяется высокой летучестью, неограниченной растворимостью в воде, способностью к миграции, накоплению, высокой стабильностью в глубоких слоях почвы, образованием при разложении не менее опасного вещества - нитрозодиыетиламина (НДМА) и ряда других менее опасных.
Применение гептила на ракетах носителях типа «Протон», «Циклон», «Космос», «Днепр», «Рокот», разгонных блоках типа «Бриз», «Фрегат» и др., обуславливает необходимость специальных мер защиты персонала при работе на наземных объектах, стендово-испытательной базе, космодромах, хранилищах и т.п. Многолетний опыт эксплуатации токсичных КРТ показывает, что комплекс разработанных и внедренных технологий, а также организационно-технических мероприятий, в основном, обеспечивает их безопасную транспортировку, хранение, заправку и слив из изделий. Несмотря на это в процессе эксплуатации имеют место небольшие проливы и газообразные выбросы при заправках различных типов изделий и испытаниях их двигателей на стендах [ 34, 35].
В последние годы начаты работы по санитарно-гигиенической оценке экологической ситуации и анализу заболеваемости в районах, загрязненных токсичными компонентами ракетных топлив. Однако пока практически не разработаны санитарно-токсикологические критерии комплексной оценки опасности загрязненных объектов окружающей среды. Существенные климато-географические и социально-экономические различия регионов, где расположены загрязненные территории, обуславливают необходимость разработки специфических подходов к проведению эколого-гигиенических обследований с учетом особенностей конкретных районов. Полученные предварительные гигиенические нормативы допустимого содержания загрязненных веществ и продуктов их трансформации в почвах, водоемах, растительности, продуктах питания требуют экспериментального подтверждения и теоретического обоснования [34].
Проливы и выбросы значительных количеств токсичных КРТ могут происходить в районах падения (РП) отработавших ступеней ракет носителей и при авариях РН (на старте, в полете, при транспортировке).
Проведенные в последние годы исследования состояния экосистем в местах проливов токсичных КРТ свидетельствует о серьезности экологической ситуации на территориях РП первых ступеней РН «Протон»,
7 «Космос», «Циклон» [26]. В местах падения ступеней в ряде случаев выявлены геохимические аномалии НДМГ и его метаболитов в растительном покрове, почве и донных отложениях с содержаниями, превышающими нормативные показатели (ПДК, ОБУВ) [8, 9, 10, 15, 16, 25, 27,]. В результате атмосферного переноса паров и аэрозолей КРТ может происходить вторичное загрязнение растительного покрова и почвы низкими концентрациями НДМГ. Имеются случаи обнаружения НДМГ в кормовой растительности, овощах, что может приводить к попаданию его в организм человека.
Таким образом, гептил, как большинство ксенобиотиков, нарушает экологический статус среды [13, 14, 17, 23] и токсичен для человека. Гептил относительно быстро исчезает с поверхности почвы и из водоемов, однако гептил в низких концентрациях в донных отложениях и под поверхностным слоем почвы сохраняется достаточно долго и может оказывать влияние на экологический статус территорий.
Такие свойства гептила требуют выяснения механизмов действия низких концентраций его на живые системы, а также определяют необходимость разработки эффективных методов анализа его токсичности на местности.
Токсикология и фармакология выделяют два типа воздействия физиологически активных соединений на организмы. К первому типу веществ, которые условно можно назвать факторами прямого действия, относятся вещества, непосредственно взаимодействующие с системами основного метаболизма клетки. Соединения второго типа воздействуют на системы регуляции клетки, нарушают или усиливают гормональные сигналы системы передачи информации на уровне клетки и целого организма.
Такая классификация отчасти условна, однако она удобна тем, что отражает различные принципы формирования биологического ответа живой системы на внешнее химическое воздействие.
Примером биологически активных соединений первой группы являются, например, различные электрофильные агенты (аналоги иприта), структурные аналоги субстратов основного метаболизма (препараты сульфамидного ряда, структурные аналоги пуринов и пирамединов и другие типы ксенобитиков). Ко второй группе соединений относятся аналоги гормонов (например, аналоги стероидных гормонов, гормонов растений и т.д.), а также соединения, нарушающие синтез гормонов и прохождение гормональных сигналов.
Совершенно очевидно, что воздействие на гормонозависимые, сигнальные системы является мощным фактором, влияющим на функционирование организма и клетки. Сигналы гормонов в живом организме часто имеют системы усиления. Благодаря этому гормоны и их медиаторы вызывают весьма значительный биологический эффект, в очень низких концентрациях они очень эффективны как регуляторы метаболизма.
На протяжении последнего десятилетия происходит качественное изменение наших представлений о гормонах как эндогенных регуляторах метаболических процессов клетки и организма, быстро накапливаются
9 экспериментальные результаты, свидетельствующие о том, что соединения, непрерывно синтезирующиеся во внешней среде - в воде и воздухе, играют в живых системах роль гормонов - клеточных медиаторов самого высокого ранга. Речь идет об активных формах кислорода (АФК), которые по современным данным [44, 66, 82, 83, 88] контролируют процессы деления клеток и апоптоз - так называемую программируемую клеточную смерть, вызываемую специальной программой разборки клетки и присутствующей в эукариотических организмах. При этом АФК включены в каскады многих сигнальных систем клеток [45, 47, 63, 65, 82, 99, 104, НО, 118, 123].
Активными формами кислорода принято называть высок ореакционноспособные молекулы, образующиеся в природе из кислорода и воды. К таковым относятся синглетный кислород (02Т)> гидроксил-радикал (ОН), супероксид-радикал (62Н), который часто существует в форме супероксид-иона - ( 02 ), и перекись водорода (Н202) — наиболее устойчивая молекула в ряду этих соединений. Из них могут образовываться все остальные формы АФК. Иногда к группе АФК причисляют озон (03). Известно, что АФК образуются внутри клеток и тканей [76], существуют ферменты, которые их эффективно разлагают. Традиционно считалось, что АФК - это побочный продукт метаболизма, который разрушает биологические структуры, а соответствующие ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза и др.), разрушающие АФК, - защищают клетку от окисления.
10 Эти представления сейчас сохраняют свою силу только в условиях образования очень высоких концентраций АФК, которые иногда имеют место при атаке клетки - мишени лимфоцитами.
В нормальных условиях реакции синтеза и разрушения АФК вполне физиологичны - соответствующие ферменты обеспечивают поддержание необходимого уровня АФК в клетке при различных режимах метаболизма.
Для настоящего исследования наиболее существенным является следующее обстоятельство: по новым данным [12] не только эндогенные АФК, но также АФК, образующиеся вне организма, во внешней среде, оказываются жизненно необходимыми для нормального функционирования организмов теплокровных живых существ.
Эти наблюдения заставляют по-новому рассмотреть характер взаимодействия организма со средой. Настоящий этап развития знаний свидетельствует в пользу того, что среда (в широком смысле) синтезирует гормоны-медиаторы, непосредственно управляющие функционированием стволовых биохимических процессов клетки и гормональными системами высших организмов.
Последнее обстоятельство потребовало нового подхода к оценке токсичности гептила.
Если раньше рассматривался только эффект прямого действия гептила на организм, то новая, более широкая, формулировка, представленная в настоящей работе, акцентирует внимание на возможности воздействия гептила на процессы генерации гормонов-медиаторов (АФК) в окружающей среде, определенный уровень которых стабилизирует нормальное существование организмов.
Таким образом, все вышесказанное свидетельствует об исключительной актуальности задачи всестороннего исследования влияния гептила, включая его низкие концентрации, на различные объекты окружающей среды и, в первую очередь, на воду, присутствующую практически во всех природных средах.
Исходя из этого, сформулирована цель настоящей работы - исследовать теоретически и экспериментально продемонстрировать эффект влияния гептила на уровень АФК в окружающей среде, прежде всего в водных системах.
Научная новизна исследований заключается в следующем: - выявлена определяющая роль АФК в протекании биологических процессов в окружающей среде при воздействии малых и сверхмалых концентраций НДМГ; -показано, что низкие и очень низкие концентрации гептила резко изменяют нормальный уровень АФК в водных системах; - предложен новый подход к определению токсичности гептила, основанный на его способности к восстановлению кислорода до супероксид- аниона и на изменении гомеостаза АФК в воде;
Практическая значимость проведенных исследований в том, что: - предложен механизм воздействия НДМГ на биологические формы жизни, оценено влияние гептила на уровень АФК (Н202) в водных системах;
12 -установлено воздействие НДМГ на биологические формы вплоть до очень низких концентраций (ЮМ); предложена методика оценки интегральной токсичности объектов окружающей среды, загрязненных, в первую очередь, гептилом и продуктами его превращения; - предложена программа создания «антидотов гептила» для снижения уровня воздействия гептила на обслуживающий персонал и население на объектах и территориях, загрязненных гептилом.
Результаты исследований реализованы: при формировании программы НИР и ОКР Росавиакосмоса в части разработки технических заданий на проведение оценок влияния гептила на окружающую среду и обоснования методов и характеристик средств экологического мониторинга загрязненных гептилом территорий (комплексная НИР «Эколог», ОКР «Экое — К» [24 , 33]); при определении облика и состава технических средств системы экологического мониторинга, создаваемой в рамках совместной Российско -Казахстанской программы «Оценка влияния запусков ракет-носителей с космодрома «Байконур» на окружающую среду» [1,30].
На защиту представляются: - новый подход к определению токсичности гептила, заключающийся в том, что гептил нарушает свойства АФК во «внешней» среде, приводящие, в свою очередь, к нарушениям функционирования гормональных систем живых организмов; - результаты экспериментального подтверждения значимости АФК, образующихся и трансформирующихся во внешней среде под воздействием гидразинов, как «внешних» регуляторов «внутренних» биохимических систем организмов; - предложения по программе создания «антидотов гептила» для снижения уровня влияния гептила на здоровье персонала, работающего с гептилом, и населения, временно находящегося на загрязненных территориях.
Обзорная и теоретическая части исследования, а также экспериментальная отработка метода определения токсичности объектов окружающей среды в условиях эксплуатации выполнены автором во ФГУП ЦЭНКИ. Экспериментальные исследования по оценке влияния гептила на АФК в различных экологических системах проводились в НТЦ «Экон ЦНИИМаш», с использованием лабораторной базы химфака МГУ им. М.В. Ломоносова. Автор выражает искреннюю благодарность специалистам этих организаций за содействие и помощь в проведении исследований.
Гидразины - онкология — мутагенез
Наиболее полно изучено биологическое действие и свойства гидразина [39, 49, 61, 68, 73, 75]. Объектами пристального изучения являются мутагенные [106] и канцерогенные [81] свойства арилгидразинов, а также канцерогенные свойства алкилгидразинов [50], и в первую очередь -несимметричного диметилгидразина (НДМГ). Особое внимание к НДМГ связано с его широким использованием во всем мире в качестве ракетного топлива и потому биологические повреждения [52], вызываемые НДМГ в организмах и экосистемах, имеют первостепенное значение. Гигиенические нормативы НДМГ [ 32 ] приведены в таблице 1.
До сих пор в общеизвестной литературе по экологии гидразины не рассматривались как соединения, обладающие пролонгированным канцерогенным действием. В тоже время в специальной литературе постепенно сформировалось мнение о том, что гидразины обладают ярко выраженным канцерогенным эффектом. На протяжении последнего десятилетия появились работы, согласно которым НДМГ практически не обладает канцерогенным эффектом [116], работы, в которых указывалось слабое канцерогенное действие НДМГ [70] и, наконец, наиболее поздние работы, показавшие, что НДМГ обладает максимально возможным канцерогенным действием, вызывая индицирование опухолей печени у 100% опытных животных [50]. До этой работы было известно только одно такое соединение - диметилнитрозоамин, которое использовалось в качестве эталона при сопоставлении относительной активности канцерогенов печени [50]. Последние экспериментальные работы и статистика заболеваний людей, находящихся в зонах загрязнения гидразинами (гидразином, 1,1-диметилгидразином и 1,2-диметилгидразином) привели к тому, что Департамент здоровья США, Международное Агентство изучения рака и Всемирная организация здравоохранения классифицировали вышеуказанные производные гидразина как потенциальные канцерогены. Обзор источников, связанных с этой проблемой, приведен в работе [57].
Важно указать, что в природе НДМГ эффективно окисляется, и в этом процессе принимают участие бактерии [4, 14, 56], Возникающий при окислении НДМГ формальдегид образует с избытком этого соединения шиффовы основания - гидразоны, обладающие токсическими свойствами [90, 98].
Сведения о низкой токсичности гидразонов важны для данного исследования, поскольку растительная клетчатка является полисахаридом, и при ее распаде образуются карбонилсодержащие продукты, образующие с НДМГ не очень устойчивые гидразоны. А уже при их распаде вновь выделяется НДМГ. Таким образом, реакция с альдегидами и кетонами переводит НДМГ в скрытую латентную и токсичную формы. Возможно, благодаря этой реакции на зараженной местности сохраняется токсичность, тогда как сам НДМГ не определяется.
Были проведены подробные фармакодинамические исследования, связанные с распределением НДМГ по органам животного и нарушениями ДНК в клетках различных органов [121]. В первую очередь изучались нарушения в митохондриальной ДНК. При этом было обнаружено, что в относительно малых дозах НДМГ не затрагивает геном клеток легких (в отличие от всех остальных тканей). По понятной причине в этом органе резко усилена система защиты ДНК от возникающих нарушений. Высокие же концентрации гептила вызывают нарушения ДНК во всех органах, включая легкие [121].
Методики
В работе использованы две методики: методика определения низких концентраций перекиси водорода и методика определения гептила по тушению люминесценции.
Содержание перекиси водорода определяли по методу Шувалова [3, 35] в модификации Брускова [5]. Особенность этого метода заключается в его очень высокой чувствительности.
Для обнаружения АФК, индицируемых теплом, использован высокочувствительный метод определения перекиси водорода с помощью люминол-пероксидазной хемилюминесценции, усиленной пара-йодофенолом с количественной регистрацией величины хемилюминесценции жидкостным сцинтиллярционным счетчиком (Бета-1, СССР) для измерения бета-излучения, работающим в режиме счетчика одиночных фотонов.
В полиэтиленовые флаконы «Beckman» (США) вносили по 10 мл счетного раствора, содержащего 10"2 М ТРИС-НС1, буфера с рН 8-5, 5 10"5
М 4-йодофенола (ICN), 5 10"5 М люминола и 10"10 М пероксидазы хрена «Sigma». Чувствительность метода позволяет определять концентрации не менее 1 нМ перекиси водорода и менее 10 пикомоль в образце. Для учета эффектов гашения и усиления хемилюминесценции в присутствии различных веществ, вначале строились калибровочные графики. Использовались заданные концентрации перекиси водорода и определялось поглощение Н202 при длине волны 240 нм в присутствии указанных веществ. При этом коэффициент экстинции Н202 принят 43,6 литр/моль-см. Измерения проводились спектрофотометрическим методом и параллельно проводились контрольные измерения этих проб на «Бета-1».
Метод определения степени заражения гептилом местности (водоемов) по тушению люминисценции бактерий имеет три специфические особенности:
а) высокая чувствительность,
б) возможность быстрого приготовления образцов для испытаний,
в) использование критерия токсичности (воздействие на живые организмы - бактерии). Суммарного токсического действия НДМГ и продуктов его трансформации.
Эта особенность метода весьма существенна для определения степени зараженности объекта окружающей среды гептилом, поскольку сам гептил неустойчив и относительно быстро исчезает, превращаясь в долгоживущие токсические продукты.
Методика основана на измерении интенсивности свечения бактерий Photobacterium leiognathi и оценке степени его подавления в присутствии токсического вещества. Бактериальную культуру поддерживали путем пересева на плотной питательной среде следующего состава: натрий хлористый - 30,0 г/л, гидролизат кильки - 17,9 г/л, глицерин — 3,0 г/л, агар - 11,2 г/л, при рН— 7.3.
Перед анализом клетки переводили с плотной среды в 3%-ный раствор хлорида натрия. Затем в опытный образец добавляли исследуемую пробу воды, а в контрольный — такую же дозу чистой воды.
При проведении анализов можно также использовать лиофилизированные культуры фотобактерий. Для этого ампулу с культурой вскрывают, высушенную культуру регидратиругот и полученную суспензию клеток используют для анализов в течение 10-15 часов.
После этого суспензию опытных и контрольных клеток поочередно помещают в прибор «Биотокс-7».
О токсичности исследуемой среды судят по подавлению бактериальной люминесценции в опытном образце в сравнении с контролем.
С этой целью на приборе «Биотокс-7» измеряли интенсивность свечения контрольного и опытного образцов. После чего с помощью встроенного в прибор микропроцессора рассчитывается показатель токсичности исследуемого образца.
Основным измеряемым параметром методики является интенсивность свечения клеточной суспензии (далее - КС) фотобактерий. Основными расчетными параметрами методики являются индекс токсичности опытного образца и его усредненное значение.
Проблема «внешней» токсичности
Из вышеизложенного очевидно, что вопросы, которые обычно рассматриваются только в рамках проблемы экологии, на настоящем этапе развития наших знаний могут и, очевидно, должны рассматриваться как вопросы, связанные с прямым токсическим воздействием на организм.
Параллельно расширяется смысл понятия токсического воздействия вещества. Раньше это понятие всегда связывалось только с прямым действием на организм. Соответственно, испытания на токсичность всегда проводились путем введения вещества в организм животных. Однако теперь становится ясно, что, в принципе, возможны ситуации, когда вещество при введении в организм малотоксично, но обладает «внешним» токсическим эффектом; это может иметь место, в частности, когда оно изменяет уровень внешних гормонов медиаторов (АФК) в среде обитания организма [6]. Вообще говоря, в настоящее время понятие «внешнего токсического эффекта» пока не имеет достаточно полного обоснования и всеобщего признания в науке и в существующей в настоящее время практике. Тем не менее, оно используется в настоящем исследовании для того, чтобы подчеркнуть остроту быстро изменяющейся ситуации в экологии, которая становится все более значимой в мире по мере увеличения нашего понимания роли внешней среды для живых организмов и нарастания степени антропогенных загрязнений. В настоящей работе сделана попытка проследить влияние низких концентраций гептила на уровень АФК (Н202) в водных системах, с целью продемонстрировать влияние одного из антропогенных факторов загрязнения среды, характерного для ракетно-космической деятельности, на уровень «внешних» гормонов-медиаторов в водных системах.
Решение этой задачи позволит определить одно из направлений для нормирования допустимого уровня загрязнения природной среды с точки зрения сохранения биоценоза. Такие подходы могут являться приоритетными для районов падения отделяющихся частей ракет носителей, так как на этих территориях отсутствуют населенные пункты и как правило не ведется хозяйственная деятельность.
Подобного рода исследования также могут применяться при определении ущерба окружающей природной среде от химического загрязнения и влиянии на природные ресурсы с точки зрения изменения их свойств.
Анализ результатов предшествующих исследований в данной области показывает, что АФК очень интенсивно образуются в грунтовых водах [128], в атмосферной влаге — в облаках [79, 108, ИЗ, 117, 134], а также присутствуют в воздухе [12].
Иными словами, живые системы находятся под постоянным воздействием этих высокореакционноспособных частиц, их образование часто связано с реакцией восстановления кислорода по типу реакции (13).
