Клеточная структура и характер накопления запасных белков и углеводов в эндосперме кукурузы с различной плотностью зерна Филичкин Сергей Андреевич

Содержание к диссертации

С.

ВВЕДЕНИЕ.. 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II

I.I Запасающие образования эндосперма кукуру
зы и их основные свойства II

1.1.1 Белковые тела II

1. Ультраструктура . . 12

2. Биохимический состав 15

3. Возникновение и формирование. . . 16

4. Плавучая плотность 18

1.1.2 Крахмальные гранулы 20

5. Структура и онтогенез 20

6. Химический состав и синтез. . . . 22

7. Удельная масса 24

1.2 Изменение физических, структурных и био
химических свойств эндосперма кукурузы -
под действием гена опак-2 25

8. Физико-механические свойства . ...25

9. Структура и ультраструктура ... 27

10. Белки и свободные аминокислота. . 29

11. Крахмал и крахмальные гранулы . . 33

3. Улучшение структуры и физических свойств опак-2 эндосперма 35

4. Заключение но аналитическому обзору . . . 36

2. ОБЪЕКТ И МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИЙ 38

1. Растительный материал 38

2. Подготовка препаратов для световой и электронной микроскопий 39

с.

3. Определение плотности запасающих клеточных образований 39

4. Выделение фракций белков 40

5. Изоэлектрофокусирование зеина ... 41

6. Определение крахмала и амилозы . . 41

7. Аминокислотный состав 41

8. Измерение удельной массы зерна и

эндосперма 42

2.9 Статистическая обработка результа
тов . . 42

3. РЕЗУЛЪТАШ ИССЛЕДОВАНИЙ 44

3.1 Изменение клеточной структуры и ультра
структуры эндосперма под действием гена
опак-2 45

1. Морфология клеток в различных гистологических слоях эндосперма нормальной и опак-2 кукурузы ... 45

2. Ультраструктура клеток нормальной и мутантной кукурузы 53

2. Определение компонентного состава прола-минов кукурузы с различной плотностью зерна 60

3. Измерение плотности запасающих образований эндосперма 63

1. Белковые тела 63

2. Крахмальные гранулы 66

3.4 Биохимический состав различающихся по
плотности гистологических зон эндосперма
высоколизиновой и обычной кукурузы ... 68

С.

3.5 Зависимость между биохимическим соста
вом эндосперма линий, гибридов и мутан
тов кукурузы и удельной массой зерна . . 75

3. Содержание лизина и белка .... 76

4. Фракционный состав белков .... 79

5. Содержание крахмала и амилозы . . 79

3.6 Статистический анализ результатов .... 81
4. ОБСУЦДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕЩОВАНЙЙ 84

вывода И ПРЕДЛОЖЕНИЯ 96

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 99

ПРИЛОЖЕНИЯ 114

Введение к работе

На ХХУІ съезде КПСС перед сельским хозяйством поставлен ряд задач, направленных на создание прочной кормовой базы / I /. В СССР кукуруза на зерно возделывается на.площади 3,5...4 млн.га, в Краснодарском крае - на 185...200 тыс.га. В целом по стране урожайность за последние годы составила 30...36 ц/га. В Постановлении Щ КПСС и Совета Министров о Продовольственной программе СССР предусмотрено увеличить валовой сбор зерна кукурузы в 1985 году до 17 млн.тонн, в 1990 - до 20 млн.тонн /2 /. При этом большое значение уделяется усилению работ по созданию новых сортов с высоким качеством зерна и повышенной устойчивостью к неблагоприятным условиям среды.

За последние 20 лет в ряде стран, в том числе в СССР, значительное развитие получили исследования по улучшению аминокислотного состава белка кукурузы. Этому способствовало открытие мутантних форм с повышенным содержанием лизина и триптофана. В Краснодарском НИИСХ под руководством академика ВАСХНШГ М.И.Хад-жинова были созданы и районированы высоколизиновые гибриды олак-2 кукурузы. Содержание лизина у них повышено на 50...60 %. По Краснодарскому краю к 1985 году планируется,довести плошадь посевов высоколизиновой кукурузы до НО тыс.га. Актуальность вопроса состоит еще и в том, что широкое производство зерна высоколизиновой кукурузы затруднено в связи с падением удельной массы и механической прочности опак-2 эндосперма, вызванного заменой стекловидных частей эндосперма рыхлой мучнистой тканью. Как следствие, опак-2 зерно имеет меньшую механическую прочность, травмируется при уборке и хуже хранится. К отрицательным свойствам высоколизиновой кукурузы относится также снижение урожайности. По данным Томова /25/, снижение урожая зерна в резуль- тате интродукции гена Og по 300 гибридам составляет в среднем 8,2 %, а к числу наиболее тесно связанных с этим признаком показателей автор относит плотность и массу 1000 зерен.

В настоящее время селекция высоколизиновой кукурузы направлена на повышение урожайности и улучшение структуры зерновки: получение форм с плотным стекловидным эндоспермом при сохранении высокой питательной ценности белка, В литературе накопилось много сообщений о создании опак-2 аналогов с модифицированным (частично стекловидным) эндоспермом /11,31,61,63,64,65/. Методы, которыми достигается модификация, различны (обработка мутагенами, отбор мозаичных форм, использование двойных мутантов и др.), однако конечный результат одинаков: в рыхлом опак-2 эндосперме появляются стекловидные участки с высокой плотностью. При этом, как правило, ухудшается биологическая ценность белка /61,64,84/.

Несмотря на то, что в последние годы получен ряд линий высоколизиновой кукурузы с частично роговидным эндоспермом, селекция на плотнозерность ведется без учета структурных и биохимических особенностей формирования стекловидной ткани. Например, основное внимание в известных нам работах уделялось изучению содержания фракций белков и аминокислот, тогда как накопление крахмала и его фракций остается за пределами внимания большинства исследователей. В то же время гены siu , wx , ае и некоторые другие используются селекционерами для получения высоколизиновой кукурузы с твердым роговидным эндоспермом /14,95/, а механизмы улучшения мучнистой структуры опак-2 зерновки в этих случаях остаются невыясненными.

Много спорных и неизученных вопросов имеется также в области структурных особенностей накопления белка и крахмала в клетках эндосперма высоколизиновой кукурузы. Так, неясно какие именно изменения структуры приводят к преобразованию стекловид- ной ткани в рыхлую, мучнистую и снижению плотности опак-2 эндосперма, насколько соизмерим вклад в ллотнозерность отдельных запасающих образований, какие особенности клеточной и субклеточной организации обеспечивают развитие роговидных участков ткани в эндосперме двойных рецессивных мутантов опак-2/шугари-2 и опак-2/вэкси, можно ли выделять плотнозерные высоколизиновые формы с помощью белков - маркеров и т.д.

Основная цель настоящей работы - изучить структурные и биохимические особенности формирования зерна с высокой плотностью в связи с проблемой улучшения физических свойств эндосперма кукурузы опак-2. Исходя из этого, были сформулированы следующие задачи исследования : выявить специфические изменения в клеточной и субклеточной структуре, приводящие к снижению плотности при введении гена олак-2; установить роль отдельных запасающих образований в формировании стекловидного эндосперма с высокой плотностью; определить связь собственной плотности основных запасающих образований с фракционным ( компонентным)составом локализованных в них веществ; выявить возможности идентификации плотнозерных форм вы-соколизиновой кукурузы с помощью белковых маркеров; изучить накопление фракций белков, лизина, крахмала ( в том числе амилозы и амилопектина ) у ряда линий, мутантов, гибридов и установить характер связи содержания этих веществ в эндосперме с признаком плотнозерности; объяснить причины улучшения структуры опак-2 эндосперма при интродукции генов - модификаторов SU2, wx, Sup 1, и других; определить биохимические критерии отбора для проведения селекционных работ по улучшению физических свойств зерна опак-2 кукурузы.

Научная новизна работы. Показано, что плотность зерна кукурузы является сложным количественным признаком, зависящим от характера упаковки клеток эндосперма белковыми телами и крахмальными гранулами. Белковые тела крахмалоносного эндосперма кукурузы являются концевыми расширениями гранулярной эндоплазматической сети, окруженные одинарной мембраной, к цитоплазматической стороне которой прикреплены полирибосомы.Зеиы белковых тел развивающегося эндосдерла содержит изоэлектрические компоненты, идентичные компонентам, выделенным из проламинов зрелого зерна. лимитирующим фактором признака плотности зерна является накопление гранул крахмала , имеющих максимальную среди запасающих образований плотность, величина которой не зависит от соотношения в крахмале амилозы и амилопектина. Глютелиновые белки играют незначительную роль при формировании плотного эндосперма. Мучнистая часть эндосперма нормальной кукурузы отличается от роговидной по клеточной структуре, содержанию и изоэлектрическим спектрам проламинов, количеству лизина и крахмала. Причиной снижения плотности опак-2 кукурузы является торможение накопления крахмальных гранул и белковых тел в клетках субалейроновой зоны эндосперма. Изоэлектрические спектры зеина опак-2 кукурузы отличаются от обычной, однако прямо не маркируют высоколизиновые формы с плотным зерном. Повышение плотности зерна опак-2 кукурузы может быть достигнуто путем отбора форм с увеличенным абсолютным содержанием крахмала в эндосперме.

Исходя из проделанной работы, на публичную защиту выносятся следующие положения диссертации :

I. Формирование зерновки кукурузы с плотным стекловидным эн-

9 доспермом определяется количеством и характером упаковки отложенных в клетках крахмалоносной паренхимы эндосперма крахмальных гранул и белковых тел,

Плотность зерна кукурузы является сложным количественным признаком, который лимитируется накоплением крахмала» При этом изменение в крахмале соотношения амилозы и амилолектина не оказывает влияния на плотность ни самих крахмальных гранул ни эндосперма в целом.

Проламины являются единственной белковой фракцией, накопление которой существенно увеличивает плотность эндосперма. Однако, в отдельных случаях ( двойные мутанты опак-2/шугари-2,опак-2/вэкси ) увеличение плотности зерна связано только с усилением ( относительно опак-2 ) накоплением крахмала,

Проламины крахмалоносного эндосперма кукурузы локализованы в белковых телах, которые являются расширениями гранулярной эндо-плазматической сети. Белковые тела окружены одиночной мембраной, с цитоплазматической стороной которой ассоциированны полирибосомы. Белки, извлеченные из белковых тел развивающегося эндосперма, состоят из тех же компонентов, что и проламины зрелой зерновки.

Эндосперм обычной кукурузы состоит из двух типов ткани, различающихся по плотности, содержанию лизина, крахмала, проламинов и изоэлектрическим спектрам последних, активности рибонуклеази. В эндосперме опак-2 кукурузы такая дифференциация тканей отсутствует.

Снижение плотности опак-2 кукурузы происходит в результате торможения накопления крахмала ( крахмальных гранул ) и проламинов ( белковых тел ) в клетках субалейроновой зоны эндосперма. Действие гена опак-2 на клеточную структуру эндосперма выража-

10 ется в : а) увеличении размера клеток и митохондрий; б) торможении образования и развития белковых тел; в) снижении накопления крахмальных гранул в клетках субалейронового слоя, мучнистая консистенция и тусклый эндосперм опак-2 кукурузы являются следствием образования полостей при высыхании белков глютелино-вого матрикса,

Изоэлектрический компонентный состав проламинов опак-2 кукурузы отличается от обычной, однако непосредственно не маркирует высоколизиновые формы с плотным зерном.

Принципиальный путь повышения плотности опак-2 зерна заключается в отборе форм с увеличенным содержанием крахмала на эндосперм (без снижения объема последнего ) при сохранении оптимального уровня белка ( 8.,.10 % ) и лизина в белке ( не менее 4# ).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.I Запасающие образования эндосперма кукурузы и их основные свойства

Плотность зерна - это масса вещества, заключенная в единице его объема. Следовательно, плотность эндосперма определяется, с одной стороны, пространственной упаковкой клеточных структур, с другой - собственной плотностью этих структур. В развивающемся эндосперме кукурузы содержится ряд клеточных органелл и структурных образований, однако к моменту созревания доминирующую по массе и количеству долю составляют лишь некоторые из них. Сюда относятся, в первую очередь, крахмальные гранулы и белковые тела. Масса крахмала, сосредоточенного в крахмальных зернах, составляет до 80 % от массы эндосперма. До половины из 10...12 % протеина локализовано в виде зеина в белковых телах, а основная часть остальных белков - в глютелиновом матриксе в виде белков цитоплазмы, мембран, митохондрий и других клеточных структур. Запасные белки и полисахариды гетерогенны по своему составу и могут состоять из нескольких субфракций или компонентов, содержание которых широко варьирует на фоне различных генотипов. При этом по вопросам влияния накопления отдельных фракций или компонентов запасающих веществ на собственную плотность запасающих образований и эндосперм в целом в литературе имеются лишь отрывочные сведения. Учитывая это, мы попытались обобщить литературные данные о структуре и биохимическом составе запасающих образований в эндосперме культурных злаков (и, особенно, кукурузы опак-2) с точки зрения потенциальной роли этих структур в формировании эндосперма с высокой плотностью.

I.I.I Белковые тела Большинство семян запасают белки в специализированных тка- нях. Клеточные органеллы, содержащие запасные белки, найдены ; как в животном, так и в растительном царствах. Их обычно называют белковыми телами.

Основной запасающей тканью злаков является триплоидный эндосперм, который состоит из клеток алейронового слоя и крахмало-нооной части. Обе эти ткани содержат белковые тела, различающиеся как по строению, так и по функциям. Это связано с тем, что крахмалоносный эндосперм является простым вместилищем запасных веществ, тогда как алейроновый слой играет важную роль в секреции ферментов в период прорастания /14/.

В семенах двудольных специализированные запасающие ткани отсутствуют, и белковые тела локализованы в семядолях, которые являются частью зародыша. У однодольных белковые тела также встречаются в зародыше, однако их число незначительно, поэтому впоследствии речь будет идти только о белковых телах эндосперма. В литературе встречаются различные термины для обозначения белковых тел: алейроновые гранулы, алейроновые вакуоли, белковые гранулы, протеолласты и т.п. По нашему мнению термин "белковое тело" является наиболее удачным, так как обобщает все эти понятия и не указывает на локализацию или специфику образования запасного материала.

I.І.І.I Ультраструктура

Белковые тела - это небольшие, чаще всего сферические по форме органеллы. Их размер варьирует в пределах от 0,1 до 30 мкм, в зависимости от вида растения, ткани и возраста последней. Как правило, белковые тела окружены элементарной мембраной 8 - 10 нм толщиной /47,84,99,132,133/.

Вебер с сотр. /133/ обнаружили, что некоторые полипелтиды окружающих белковые тела мембран, исчезают без нарушения целост- ности последних в перше дни прорастания семян. Однако, в целом, о химическом составе этих мембран известно мало.

Ультраструктура белковых тел двудольных отличается от однодольных. В эндосперме злаковых присутствуют по меньшей мере 2 типа белковых тел. Один характерен для крахмалоносной части, второй - для клеток алейронового слоя /14,49,53/. В алейроновых клетках и семядолях двудольных в белковых телах встречаются включения - глобоид и/или кристаллоид, заключенные в гомогенный или гранулярный матрикс. Глобоид представляет собой отложение фитина, кристаллоид имеет белковую природу. В то время, как кристаллоид не имеет собственной мембраны, вокруг сферического глобоида некоторые авторы обнаружили мембраноподобную структуру /121/. Другие исследователи не обнаружили ни мембраны, ни какой-либо другой ограничивающей глобоид структуры /50/.

Белковые тела крахмалоносного эндосперма в основном представляют собой сферические образования, заполненные гомогенным или гранулярным матриксом. Кэмпбелл с сотр. /53/, изучая развивающийся крахмалоносный эндосперм пшеницы, обнаружили наряду с многочисленными белковыми телами обычного типа, отложения белка вакуолярного происхождения, аналогичные, описанным Крейгом с сотр. /57,58/ для семядолей фасоли. Из эндосперма риса были выделены два типа белковых тел: с ламеллярным и гомогенным белковым матриксом /75,123/. Отмечено, что белковые тела проса имеют темноокрашиваюшуюся центральную часть, а в белковых телах сорго присутствуют концентрические круги электронно-плотного материала /35/. Эти же авторы описали в препаратах белковых тел кукурузы вакуоли с включениями, неизвестной природы. Другие исследователи /47,84,87/ ни в клетках эндосперма, ни в препаратах белковых тел подобных вакуолей не обнаружили. Кроме того, ряд авторов описал темно-окрашивавшиеся гранулы, тесно ассоциированные с белковыми телами пшеницы /49,53,78,99/ и ячменя /35,51,52,76, 99/.

Перноллет /ИЗ/ суммировал литературные данные по ультраструктуре белковых тел со ссылками на авторов в следующей таблице.

Таблица I.I Размер и структура белковых тел эндосперма некоторых культурных злаков (взято из /ИЗ/)

Алейроновые клетки : Крахмалоносный эндосперм _{вид ібейо?; включения \<8SSg.\} ^Вк_{^?^ *}^{стрдада} :го тела,: :го тела,: матрикса : мкм : : мкм :

Ячмень 2...3 Два типа вклю- 2 Включения отсутствуют чений Ламеллярная структура

4...5 Глобоид и I...2 - " -кристаллоид

3...4 I Z 3...5 Глобоид и внутренняя полость

Пшеница 2...3 Два типа вклю- 0,1...8 Включения отсутствуют чений Гранулярная структура

2...4 - " - 2...3 Включения отсутствуют

Гомогенный матрикс I...5 -"-

Рис 1,5...4 Глобоид І...І0 Включения отсутствуют

Электронноплотнне области I...3 - " - 2...5 Включения отсутствуют

Гомогенный матрикс

Кукуруза I...2 Включения отсутствуют

Гомогенный матрикс

Сорго 0,5..3,5 Включения отсутствуют

Концентрическая ла-

Просо I...2

Включения отсутствз Концентрическая ламеллярная структура

Размер белковых тел значительно варьирует в зависимости от генотипа. Особенно заметно резкое уменьшение белковых тел у зе-ин-дефектных мутантов кукурузы /6,31,137,130,131,132,138,139/ и гордеин-дефектных мутантов ячменя /51,73/. Так, Бэнзигер и Гло- вер /40/ обнаружили, что видимые в световой микроскоп белковые тела отсутствовали у мутантов кукурузы с генами о₂ , fi₂ , s^ , sh₁ , sh₂ , btx, , bt₂ , но присутствовали у ae , du , fі_л , h , siu, , wx

Обобщая вышесказанное, можно сделать вывод, что у злаковых существуют два типа явно различающихся белковых тел: в алейроновых клетках, имеющих включения в виде глобоида, и/или кристаллоида, и в крахмалоносном эндосперме. Только белковые тела кукурузы обладают гомогенным матриксом, тогда* как в эндоспермальных белковых телах пшеницы, ячменя, риса, сорго и просо многие авторы обнаружили концентрические структуры или гранулярный матрикс. Различия между алейроновой и крахмалоносной тканью совершенно очевидны, поэтому целесообразно белковые тела алейроновых клеток злаков называть более конкретно: "алейроновыми гранулами" по сравнению с популяцией белковых тел крахмалоносного эндосперма.

I.I.I.2 Биохимический состав

Белковые тела двудольных содержат в качестве основных запасных веществ глобулины. Деккерт и Деккерт /61,62/ называют их "алеуринами" и разделяют на два класса: вицилины и легумины. Ви-цилины обычно являются гликопротеидами (димерами низкой @ - гели ческой природы), а легумины представлены гексамарными комплексами дисульфидно связанных пар субъединиц. В то время, как матрикс и кристаллоид белковых тел двудольных имеют белковую основу, глобоид состоит в основном из фитина (мионнозитол гексафосфат). В алейроновых гранулах злаков фитин также локализован в глобоиде /77/. В белковых телах эндосперма Gramineae содержатся в основном пролашны. Исключением является рис, Танака с сотр. /123/ обнаружили, что один тип белковых тел риса богат глготели-нами и глобулинами, другой - проламинами. Состав белковых тел эндосперма злаков приведен в таблице 1.2. В белковых телах различных таксонов локализованы лротеазы и фосфатазы, реже - амилазы. Из неорганических элементов - Mg , К, Р, реже - Fe , Na, Mn . Ряд ферментов был обнаружен путем измерения их активности

Таблица 1.2

Состав белковых тел крахмалоносного эндосперма злаков

Культура

Основной запас- і 5«2Ї 2ЇЇ2 І и_л«,_л««» нл« /<оттл» ^{: ВбС}э белко- : Источник ной оелок

Кукуруза Зеин (про лами н)

Пшеница Глиадин (проламин)

Ячмень Гордеин (проламин)

Рис Оризенин (глютелин) Глобулин Проламин в препаратах белковых тел, однако, как отмечает Вебер /133/, это может быть следствием загрязнения препаратов веществом цитоплазмы. С белковыми телами кукурузы ассоциированы небольшие количества РНК /47,48/. І.І.І.З Возникновение и формирование

К концу прошлого столетия некоторые авторы развивали представления о формировании белковых тел или в результате выпадения в осадок белка при высыхании семени, или как результат деятельности определенных пластид. В настояшее время сложились три наиболее устоявшихся представления о путях формирования белковых тел.

Наиболее общим является предположение, согласно которому бе-лок синтезируется на гранулярной эндоплазматической сети, попадает в ее просвет, затем транспортируется в диктиосомы, где упаковывается в везикулы и откладывается в вакуолях, окруженных то-нопластом. Эти представления развивают Деккерт и Деккерт /61,62/, Харрис и Боултер /73/ на основе модели Паладе для образования зимогеновых гранул в клетках поджелудочной железы. Действительно, многие исследователи описали повышенную активность диктиосом в период синтеза и отложения запасного белка /53,61,73,84/, а в случав пшеницы и ячменя обнаружили многочисленные электронно-плотные везикулы, ассоциированные с белковыми телами /49,53,76, 106/. Однако Ньюмен /103/ подверг сомнению участив комплекса Гольджи в синтезе запасных белков. Согласно Кайл и Стайлс /86/, образование белковых тел в крахмалоносном эндосперме и алейроновой зоне идет, двумя различными путями: в первом случав - за счет расширений эндоплазматического ретикулума, а во втором - внутри-вакуолярным отложением белка. В настоящее время нет прямых дока-- зательств участия диктиосом в процессе накопления запасных белков.

Вторая, исторически укоренившаяся гипотеза, предполагает, что белковые тела являются самостоятельными органеллами, способными к синтезу и отложению запасного белка, и, возможно, плас-тидного происхождения. Наиболее ясно сформулировали эту гипотезу Мортон с сотр. /104/, которые обнаружили, что белковые тела пшеницы содержат РНК и рибосомы внутри липопротеиновой мембраны и способны к синтезу белка in. vitro. Недавно было показано, что полисомы и мРНК, изолированные из белковых тел кукурузы, синтезируют полипептиды зеина in vitro /47,48,87,88/.

Тем не менее, на элактронограммах этих авторов рибосомы прикреплены к наружной, но не внутренней поверхности мембран.

Боллини и Крисиилз /45/ также синтезировали 4 полипептида вици-лина с помощью мембраносвязанных полирибосом. Эти факты не подтверждают гипотезу автономного развития белковых тел.

Третья гипотеза была предложена для образования белковых тел кукурузы. Ху и Волф /84/ постулировали, что белковые тела кукурузы развиваются посредством синтеза белка на мембранах гранулярной эндоплазматической сети и отложения продукта синтеза в просвет последней. Эта гипотеза подтверждена рядом работ. Лар-кинс и Гуркман /88/ показали, что популяция мРНК из гранулярного эндоплазматического ретикулума управляет синтезом тех же продуктов (зеияа), что и мРНК из белковых тел. Виотти с сотр. /130/ предположили, что существует целое семейство мРНК, на каждой из которых синтезируется определенный компонент зеина. В последнее время появились работы, в которых связь белковых тел с эндоплазматической сетью подтверждается присутствием в препаратах очищенных белковых тел ферментов-маркеров мембран эндоллазматичес-кого ретикулума, в частности, НАД*Н цитохром с редуктазы /88/. Мифлин с сотр. /99/ изучили распределение в градиенте плотности глютамат - дегидрогеназы, каталазы и триозофосфатизомеразы -ферментов-маркеров для митохондрий, микротелец и пластид соответственно. Никаких доказательств пластидаого происхождения белковых тел ячменя, пшеницы и кукурузы получено не было. Наоборот, в препаратах белковых тел этих злаков наблюдалась повышенная активность НАД'Н цитохром с редуктазы, что говорит о прямой связи белковых тел и гранулярной эндоплазматической сети.

Механизм переноса молекулы запасного белка через мембрану плохо изучен. Возможно, он осуществляется с участием сигнальной полипептидной последовательности локализованной в мембране /44/. І.І.І.4 Плавучая плотность

В последнее время появилось много сообщений об измерении изопикнической плотности белковых тел в градиентах плотности сахарозы или других сред. В таблице 1.3 суммированы литературные данные по плавучей плотности белковых тел.

Таблица 1.3

Плавучая плотность белковых тел эндосперма некоторых культурных злаков

Как видно из таблицы 1.3, белковые тела кукурузы несколько легче белковых тел других культурных злаков.

Таким образом, на основании ряда работ /31,30,40,137,138, 139/ можно сделать вывод, что белковые тела - наиболее представленный количественно класс клеточных структур (после крахмальных гранул) в эндосперме зубовидной кукурузы. Учитывая довольно высокий показатель плавучей плотности и многочисленность белковых тел, можно предположить, что последние играют значительную роль в формировании зерна с высокое удельной массой. Однако некоторые вопросы (например, существенность различий в плотности белковых тел зеин-дефектных мутантов и другие) остаются в настоящий момент спорными или плохо освещенными в литературе и требуют более глубокого изучения.

I.I.2 Крахмальные гранулы

Наиболее количественно представленными запасающими образованиями эндосперма злаков являются крахмальные гранулы. В них депонирован основной запасной полисахарид зерна злаков - крахмал. Его содержание достигает 80 % от веса эндосперма, а высокая удель- ная масса (около 1,5 г/см) заставляет предполагать о важной роли в формировании признака плотнозерности.

I.I.2.I Структура и онтогенез

Накопление крахмала в эндосперме злаков инициируется в ами-лопластах. Это - органеллы диаметром 2...3 мкм, окруженные двойной мембраной. Строма амилопласта содержит большое количество трубочек и тилакоидов, в некоторых случаях образующих концентрические круги /33/. На ранних стадиях развития эндосперма кукурузы большие скопления амилопластов обнаружены в околоядерной области /3/, здесь же появляются первые крахмальные зерна /46/.

Развитие гранул крахмала начинается с того, что в строме амилопласта появляется частица, которая под электронным микроскопом кажется белой. Вновь образующийся крахмал откладывается в строме, окружая со всех сторон исходное крахмальное зерно, и в результате образуется центр крахмалообразования, видимый уже в световой микроскоп и носящий название хилума. Хилум быстро разрастается путем аппозиции и весь амилопласт заполняется крахмалом. При этом мембраны и трубочки стромы оттесняются к периферии пластиды. В результате дальнейшего роста оболочка из двойной мембраны, окружающая крахмальное зерно, растягивается. В отличие от кукурузы (а также пшеницы, ржи и ячменя), у которых крахмальные гранулы развиваются описанным способом, у овса и риса в строма амилопласта инициируется несколько мелких зерен, которые, разрастаясь, приходят в соприкосновение друг с другом и сплющиваются.

Крахмальные гранулы зубовидной кукурузы в процессе развития достигают размеров 15...20 мкм, заполняя большую часть объема клеток крахмалоносного эндосперма /25/. У пшеницы, ячменя и тритикале крахмальные гранулы достигают 20...30 мкм в диаметре, причем в эндосперме имеются 2 популяции последних /9,41,43,63/. Бэруч с сотр. /41/ обнаружили, что популяция крупных гранул пшеницы развивается примерно до месяца, а после 40-го дня развития появляется новое поколение мелких гранул. При этом масса крахмальных гранул увеличивается до 50 дней, а их число - после 30-го дня развития. Популяция крахмальных гранул эндосперма кукурузы более или менее однообразна, хотя между различными гистологическими зонами имеются различия по размеру и конфигурации /25, 46/. В яриалайроновых слоях кластеры амилопластов собраны в околоядерной области /3/. Позже на их месте возникают скопления мелких, округлых крахмальных зерен /46/. В более глубоких слоях эндосперма они укрупняются и заполняют клетку почти полностью, приобретая форму многогранника /116/.

Ямагучи с сотр. /140/ изучали крахмальные гранулы воско-видной (вэкси) кукурузы с помощью высокоразрешающей электронной микроскопии. После кислой обработки на срезах нативных крахмальных гранул были отчетливо видны кольца роста, состоящие из пачек ламелл около 5 нм толщиной. 70-ти ангстремные промежутки в фрагментах гранул авторы объясняют чередованием кристаллических и аморфных участков. Кристаллические районы (кольца роста) воз- никают в результате ассоциации параллельных групп (кластеров) целей амилопектина и состоят из пачек ламелл. Каждая ламелла вмешает 12...14 глюкозидных остатков цепи амилопектина по толщине и многие сотни в своей плоскости. На основе структурного анализа авторы делают вывод, что молекулы амилопектина растут на поверхности гранулы посредством синхронного удлинения цепей и кристаллизации.

Известны многочисленные случаи аномального развития крахмальных гранул. Так, Бойер с сотр. /46/ описал вытянутые червеобразные гранулы кукурузы с геном ае , а на микрофотографиях эндосперма шугари-2 кукурузы видны деформированные, потерявшие целостность зерна крахмала /40/. Оба мутанта имеют повышенное содержание амилозы. Крахмальные зерна восковидной кукурузы, в которых практически отсутствует амилоза, окрашиваются иодом в красный цвет, но под микроскопом имеют такой же вид, как и крахмал обычной кукурузы, чернеющий от иода /33/. Однако крахмальные гранулы восковидного ячменя сильно искажены и неравномерно окрашиваются красителем /43/.

I.I.2.2 Химический состав и синтез

Основными фракциями полисахаридов из крахмальных зерен являются амилоза и амилопектин. Макромолекулы амилозы имеют преимущественно линейную форму, причем в кислых растворах могут приобретать конфигурацию спирали, каждый виток которой состоит из 6 глюкозних остатков. Строение молекулы амилозы не ограничивается @ - 1,4 глюкозидными связями. Так, @ - амилаза не расщепляет амилозу полностью до мальтозы. Препятствием деградации молекулы амилозы @ - амилазой могут быть @ -1,6 глюкозидные связи или другие неизвестные факторы /17/. В крахмале некоторых мутантов кукурузы содержится до 50 % амилозы. Амилоза таких мутантов имеет меньшую молекулярную массу и длину цепей /36/. Ами- лоза различных культур гетерогенна по составу и может быть разделена на ряд субфракций /17/, другой составной частью крахмальных гранул является амило-пектин, в молекуле которого глюкозные остатки соединены е -1,4, а в точках ветвления - @ - 1,6 глнжозидннми связями. Молекулярная масса амилолектина может достигать нескольких сотен миллионов, В нейтральных растворах молекула амилопектина имеет форму сфероида, а в щелочных - клубка. Крахмал вэкси (восковид-ной) кукурузы состоит практически целиком из амилопектина, который отличается более высокой молекулярной массой и меньшей раз-ветвленностью. Параллельные цепи его молекулы могут образовывать в крахмальной грануле кристаллическую решетку /6,33,140/.

Механизмы синтеза крахмала в настоящее время недостаточно изучены. Считается,что к нему имеют прямое отношение следующие ферменты: УДФГ (АДФГ) - е - 1,4 - глюкан - @ - 4 - глюкозид - трансфераза (Н.Ф.2.4.І.2І) - крахмалсинтетаза я. в -глюканфосфорилаза (Н.Ф.2.4.ІД) - фосфорилаза /27/. Первый из них осуществляет реакцию: УДФГ + ( _@ - 1,4 - глюкозил) — УДФ + ( е - 1,4 - глюкозил). Озбун с сотр. /108/ выделил из эндосперма восковидной кукурузы две разновидности крахмалсинтетазы и показал, что по крайней мере, одна из них синтезирует in vitro (без затравки) продукт, принципиально сходный с амилопектином. Наряду с УДФГ - крахмалсинтетазои в качестве донора глюкозильннх остатков выступает АДФГ - крахмалсинтетаза. Глюкозилтрансфераза локализована в нерастворимом матриксе крахмальных гранул и их оболочек. Наиболее вероятно, что фермент составляет часть структуры крахмальной гранулы и включается в последнюю в процессе роста. При этом предполагается, что рост параллельных цепей амилолектина с участием фермента должен происходить синхронно по всей поверхности гранулы /140/.

Наряду с крахмалсинтвтазой в синтезе крахмала принимает участие другой фермент - АДФГ - лирофосфорилаза. Тсаи и Нельсон /127/ обнаружили в эндосперме кукурузы две фосфорилазы: I и II. Последняя монет синтезировать амилозоподобнни полигликан без затравки, а фосфорилаза I не активна даже с мальтозой в качестве затравки, фосфорилаза, в отличие от крахмалсинтетазы, не включена в крахмальную гранулу, но она может быть адсорбирована на поверхности или находиться в свободном состоянии в строме амило-пласта. В литературе нет единого мнения о решающей роли того или иного фермента в крахмальном синтезе. Возможно, в разные периоды формирования зерна работают различные ферментные системы, а в период интенсивного синтеза крахмала могут быть включены все системы одновременно.

I.1.2.3 Удельная масса

Крахмал является высокомолекулярным полимером с упорядоченной полукристаллической структурой. На основании рентгенострук-турного анализа были получены данные, исходя из которых, оказалось возможным вывести структуру элементарной кристаллической ячейки крахмального зерна орхидеи /33/. Эта ячейка обладает ромбической симметрией, причем а = 9,0, в = 10,6 и с = 1,56 нм. Ромбическая элементарная ячейка содержит три, а соответственно увеличенная гексагональная ячейка - 18 цепей амилозы. Удельная масса крахмальных зерен, вычисленная на основании этих данных, составляет 1,80 г/см , однако фактически она меньше (в воде плотность равна 1,62 г/см³, в ксилоле - 1,43 г/см³). С другой стороны, содержание амилозы в крахмале кукурузы может колебаться от следовых количеств (восковидная кукуруза /33/) до 50 % ( ае , шугари-2 мутанты /17/), однако данных о влиянии таких колебаний на собственную плотность гранул крахмала в литературе не обнару- жено.

Особого внимания изучение крахмальных гранул заслуживает также по той причине, что в селекции высоколизиновой кукурузы для модификации опак-2 эндосперма используются мутанты, изменяющие соотношение в крахмале амилозы и амилопектина /15,124/. Большинство этих мутантов снижают общее количество крахмала. Тем не менее, плотность зерна двойного рецессивного мутанта c^/si^, например, значительно возрастает. Происходит ли это в результате увеличения плотности самих крахмальных гранул, изменения их упаковки или по другим причинам, до настоящего времени не известно и требует объяснения.

1.2 Изменение физических, структурных и биохимических свойств эндосперма кукурузы под действием гена опак-2

Со времени, когда Мерц с сотр. /98/ обнаружили, что опак-2 мутация вызывает резкое увеличение содержания лизина и трапто-фана в зерне кукурузы, в литературе накопилось много информации об изменении свойств белково-углеводного комплекса мутантного эндосперма. Действие гена опак-2 ллейотропное и затрагивает такие признаки, как масса, плотность и структура зерна, баланс белковых фракций, активность отдельных ферментов, накопление углеводов и т.д. В итоге изменяется структура эндосперма, снижается плотность и механическая прочность, падает урожайность. В настоящем разделе сделана попытка на основе литературных данных охарактеризовать изменения в мутантном эндосперме, которые, по нашему мнению, имеют непосредственное отношение к проблеме плотности опак-2 зерна.

1.2,1 Физико-механические свойства "Opaque" в переводе означает "тусклый, матовый". Именно оп- тические свойства эндосперма позволили выделить зерно опак-2 мутанта фенотипически. Стекловидный твердый эндосперм нормальной кукурузы у высоколизияовой заменен мягким, рыхлым (" soft"). Отсутствие стекловидности Робутти с сотр. /116/ объясняют наличием в мутантном эндосперме воздушных пространств. Наиболее отрицательными с практической точки зрения изменениями физических свойств высоколизиновой кукурузы являются уменьшение массы 1000 зерен /5,25,38,115/, снижение удельной плотности и механической прочности /13,26,38,89/. Арнольд с сотр. /38/ установили, что к 56-му дню развития масса 1000 зерен, объем и плотность зерновок опак-2 были на 17,7 и 10 % соответственно ниже, чем у нормального аналога. Плотность зерна опак-2 была значительно меньше на всех стадиях развития. Науменко и Кирпа /13/ обнаружили снижение плотности зерна высоколизиновых гибридов на 10...12 %, массы 1000 зерен на 8...17 %. Разрушающее усилие снижалось до 30 %, причем преобладал пластический вид деформации опак-2 зерновки, тогда как нормальные зерна разрушались полностью. Высоколизиновая кукуруза превышала по пористости нормальную в 2...2,5 раза, что свидетельствует о большом количестве полостей в ткани ее эндосперма. Авторы обнаружили обратную зависимость между степенью пористости и плотностью. По данным Томова /29/, снижение урожая зерна в результате интродукции гена опак-2 по 300 гибридам составляет в среднем 8,2 %, а в числе наиболее тесно связанных с урожаем зерна показателей находятся удельная масса (плотность) и масса 1000 зерен.

Обзор литературных источников также выявил, что в селекционной практике наиболее распространен способ оценивания плотности зерновок визуально, то есть по соотношению мучнистых и роговидных частей в эндосперме (зерна разделяют на матовом стекле с подсветкой снизу). Однако, указанный способ субъективен, недоста- точно точен и не дает количественных значений плотности каждого зерна. Иначе говоря, необходимо разработать быстрый метод количественной позерновой оценки плотности для селекционного материала.

1.2.2 Структура и ультраструктура

Эндосперм нормальной и опак-2 кукурузы был исследован с помощью световой /40,54,55,138,139/, электронной просвечивающей /3,84,139/ и растровой /67,116,132/ микроскопии.

Изменения в субклеточной структуре опак-2 эндосперма впервые описали Вольф с сотр. /138,139/. После удаления крахмальных гранул амилазой, в эндоспермальных клетках оставались тяжи протеинового матрикса с погруженными в него белковыми телами, описанными Дувиком /64/. Обработка 80 % этанолом растворяла белковые гранулы и оставляла интактным матрикс. Белковые тела 1,4..:. 1,8 мкм в диаметре хорошо различимые у нормальной кукурузы, не были видны в световой микроокоп в опак-2 эндосперме и разрешались только электронной оптикой (0,1 мкм). На последующих этапах цитоморфологического исследования эндосперма кукурузы основное внимание исследователей сконцентрировалось на белковых телах. В ряде работ признак отсутствия этих структурных образований выдвигался в качестве маркера высоколизиновых зеин-дефектных генотипов /40,116,132/. Вассом и Хосени /132/, например, предложили селекцию по этому признаку высоколизиновой кукурузы с модифицированным эндоспермом с помощью сканирующего микроскопа.

По своему составу популяция клеток эндосперма кукурузы неоднородна. Перифирический монослой алейроновых клеток резко отличается от внутренней (крахмалоносной) части. Толстостенные алейроновые клетки не содержат крахмальных гранул и характерных для внутренней части белковых тел. В их цитоплазме много липид-ных капель и вакуолей. Следующие несколько слоев мелких клеток заполнены преимущественно зеиновыми телами /139/ и содержат до 12 % от суммарного белка зерновки /74/.

Клетки крахмалоносной роговидной части нормального эндосперма компактно упакованы полигональными крахмальными гранулами и белковыми телами /6,30,31,116,132/, погруженными в пленки глюте-линового матрикса /54,55,56,116,132/.

Бензигер и Гловер /40/ пришли к выводу, что в эндосперме большинства высоколизиновых мутантов, в том числе и опак-2, исчезают белковые тела и уменьшается количество внутриклеточных оболочек глютелинового матрикса. Так, стекловидность и высокую плотность зерна комбинации o₂/su₂ авторы объясняют интенсивным глю-телиновым матриксом со множеством внутриклеточных оболочек. Ро-бутти с сотр. /116/, развивая представления Дувика /64/, объясняют непрозрачный (тусклый) характер опак-2 зерна следствием преломления света имеющимися в нем воздушными полостями, однако механизм образования этих полостей остается неисследованным.

Таким образом, зрелый опак-2 эндосперм состоят преимущественно из ткани с мучнистой текстурой в противоположность стекловидной нормального аналога. Рыхлый, с низкой плотностью эндосперм является одним из основных отрицательных свойств высоколизиновой кукурузы, что вызывает повышенный интерес многих исследователей к изучению клеточной и субклеточной организации олак-2 эндосперма. Однако, большее внимание до настоящего времени уделялось структурным аспектам накопления белка, то есть образованию и онтогенезу белковых тел, чем объяснению причин развития мучнистой ткани вместо стекловидной. Тем не менее, до настоящего времени не удалось выявить различия в тонкой структуре белковых тел из крахмалоносной части эндосперма нормальной и опак-2 кукурузы, хотя у высоколизинового мутанта ячменя Ризо 1508 и его нормального аналога такие различия были обнаружены /51,52,76/.

С другой стороны, среди изученных литературных источников отсутствуют специальные работы, посвященные исследованию зависимости плотности эндосперма и его гистологических частей от раз-мэра клеток, характера их заполнения крахмальными гранулами и белковыми телами, глютелиновым матриксом или другими структурными образованиями. Проведение такого исследования позволило бы связать разрозненные сведения о структурных основах признака плотности зерна.

1.2.3 Белки и свободные аминокислоты

Высокое содержание лизина и триптофана в опак-2 зерне сопряжено с повышенной концентрацией свободных аминокислот на всех стадиях развития и в зрелом эндосперме /26,91,98,100,101,102/. По данным Гупты с сотр. /68,70/ и Содека /118/ радиоактивная мет-ка ^х С более интенсивно включалась в пул свободных аминокислот в опак-2 эндосперме, чем в нормальном. Высокое содержание свободных аминокислот большинство исследователей связывает с депрессией синтеза слирторастворимых белков опак-2 мутанта. Гупта с сотр. /68,70/ показали, что радиоактивная метка интенсивнее включалась в белковые аминокислоты нормальной кукурузы, и в свободные - опак-2. Содек и Вильсон /118/ после введения С лизина обнаружили, что в опак-2 эндосперме практически вся метка присутствовала в экстрактивном азоте и солерастворимых белках, тогда как в нормальном аналоге до 30 % меченого лизина превращалось в глютаминовуго кислоту и пролин зеиновой фракции.

Перераспределение фракций белков в опак-2 эндосперме связано, в первую очередь, с резким снижением синтеза проламинов. Относительное содержание спирторастворимой фракции в белке мутант-яой кукурузы может быть понижено ло сравнению с обычной в 2...3 раза /25,26,54,101,102,131/. Тсаи /125/ и Диркс-Вентлинг /87/ по- казали, что накопление зеина в опак-2 эндосперме заканчивается раньше, чем в нормальном аналоге. К такому же выводу пришли Виот-ти с сотр. /129/, обнаружив, что синтез зеина и глютелина - I идет сходно и в мутанте и в нормальном аналоге до 21 дня развития, однако на более поздних стадиях практически останавливается в опак-2, в то время как в нормальном эндосперме продолжается до 48 дня. В этот период в опак-2 эндосперме снижается количество связанных с белковыми телами полирибосом и наблюдается частичное исчезновение некоторых их классов.

В опак-2 зерне происходит не только количественное уменьшение лроламинов, но и их качественное изменение. Большинство авторов обнаружили отличив спектров зеина высоколизиновой кукурузы, полученных электрофорезом /22,25,72,89,110,111,131/ и изоэлектро-фокусированием в градиенте рН /26,67,72/. Ли с сотр. /89/ нашли, что опак-2 зеин имеет меньше компонентов с высоким молекулярным весом, разделимых электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия, хотя Паулис с сотр. /110,111/ выявили только количественную разницу- содержания белка в полосах электро-фореграмм. Фонзо с сотр. /65/ не обнаружили в опак-2 зеине компонента с молекулярным весом 32 килодальтона. Рядчиков с сотр. /26/ с помощью электрофореза в ПААГ выделили 5 компонентов опак-2 зеина против 8 нормального. Более высокоразрешаюпшй метод изо-электрофокусирования (ИЭФ) позволил разделить зеин на большее число компонентов. Соав с сотр. /119/, разделив фокусированием зеин линии W64-A на 15 полос, не нашли существенных различий между спектрами мутанта опак-2 и нормального генотипа. Однако Рядчиков с сотр. /26/ выделил в зеине той же линии 46 компонентов, причем 17 из них отсутствовали у олак-2. Данные других авторов /67,72/ также свидетельствуют об обеднении ИЭФ - спектра опак-2 зеина, хотя в случае отдельных генотипов могут проявлять- ся новые компоненти /25,67/. По Конареву /7/ редуцированный электрофоретический спектр проламинов высоколизиновой кукурузы прямо маркирует опак-2 мутацию и отражает степень насыщения генотипа геном о₂. Разнокачественность зерен по спектру звина выявлялась даже в пределах початка образца Og Synth А. При этом полный спектр зеина, как правило, давали зерна с кремнистым эндоспермом.

Джонс с сотр. /80,81/ обнаружили, что мембраносвязанные полирибосомы эндосперма нормальной кукурузы и опак-2 мутанта синтезировали in vitro белки, сходные с зеином. Электрофорез * С - лейцин меченных белков выявил, что опак-2 мутант пропорционально уменьшал компоненты зеина или тормозил синтез одного из них. Исчезновение одного из полипептидов зеина in vitro соответствовало репрессии его синтеза in vivo и связывается с отсутствием в опак-2 эндосперме крупного класса мембраносвязанных полирибосом. Виотти с сотр. /129/ пришли к аналогичному выводу, обнаружив, что после 20-го дня развития в полисомной популяции опак-2 эндосперма исчезают некоторые группы полирибосом. Во времени это явление совпадало с замедлением синтеза зеина в опак-2 зерновке.

Берр с сотр. /47,48/ и Ларкинс и Гуркман /88/ показали, что продукты трансляции мРНК in vitroбыли примерно на 2000 дальтон тяжелее нативного зеина. Этот факт был объяснен тем, что полипептиды зеина синтезируются вначале в виде предшественников с добавочной аминокислотной последовательностью. При добавлении в систему in vitro эндоплазматического ретикулума, транслировались продукты, сходные с нативным зеином /88/ (этот факт подтверждает гипотезу Блобеля и Добберштейна /44/ об участии сигнальной полипептидной последовательности при переносе белка через мумбрану).

Редукция синтеза проламинов в зерне опак-2 кукурузы вызывает изменение как относительного, так и абсолютного содержания других белковых фракций, в первую очередь - сола-и шелочераство-римых. Большинство авторов указывает на высокую концентрацию в опак-2 зерне альбуминов и глобулинов /25,62,67,70,131/. Электрофоре тиче ские спектры фракции альбумины + легкорастворимые глобулины зрелого опак-2 эндосперма насчитывают больше компонентов, чем нормального, хотя в глобулинах таких различий не обнаружено /25/. Рядчиков с сотр. /25/ объясняют этот результат не появлением новых белков в высоколизиновой кукурузе, а сохранением белковой картины ранних стадий развития. Соав с сотр. /120/ показали с помощью иммуноэлектрофоретических методов, что в спектре глобулинов опак-2 эндосперма отсутствует компонент с молекулярным весом 32 килодальтона. Причем, его количество в эндосперме положительно коррелирует с содержанием зеина на фоне различных генотипов и источников гена 02» На основании этого было предложено, что глобулин ъ - 32 тесно ассоциирован с изменениями в синтезе зеина, хотя субклеточная локализация этого белка не связана ни с полирибосомами, ни с мембранами эндоплазматической сети и белковых тел. Диркс-Вентлинг /62/, наоборот, не обнаружила качественных различий ни в спектрах альбуминов, но глобулинов, за исключением усиления опак-2 аналогом нескольких высокомолекулярных компонентов. Тем не менее, автор указывает на возможную связь повышенной аккумуляции глобулинов и редукций синтеза зеина в опак-2 зерне.

Наиболее представленной после зеина фракцией белка являются глютелины. По Вильсону /35/ глютелины состоят из сзщмы белков, входящих в мембраны, микротельца, митохондрии, цитоплазму и т.д. Эти белки плохо растворимы в силу большого количества поперечных (например, дисульфидных) связей, возникающих на последних стади- ях созревания или в процессе экстрагирования /35/. Глютелины имеют специфический электрофоретический спектр, отличающийся от спектра солерастворимых белков /35/. В клетках зрелого эндосперма глютелины образуют белковый матрикс, обволакивающий белковые тела и крахмальные гранулы, и, вероятно, могут вносить существенный вклад в плотнозерность, прочность и стекловидность эндосперма /116/. Аминокислотный состав глютелинов хорошо сбалансирован по лизину и триптофану /24,67/. Рядчиков с сотр. /26/ обнаружили некоторые различия в аминокислотном составе ряда подфракций глютелинов, полученных модифицированным методом Ландри и Муро /24/ из мутантного и нормального зерна. В результате снижения биосинтеза зеина в опак-2 эндосперме, приводящего к изменению баланса белковых фракций, относительное содержание глютелинов увеличивается /24,26,69,79,97,105,118/, хотя абсолютное их количество (в пересчете на эндосперм) достоверно не отличается от нормы /69,79,97/.

Обобщая, можно сделать вывод, что ген опак-2 изменяет баланс белков эндосперма в сторону обеднения их проламинами и увеличения содержания альбуминов, глобулинов и свободных аминокислот. Аналогичное перераспределение наблюдается у некоторых других высоколизиновых мутантов кукурузы (флаури-2, опак-7, шугари-I, шранкен-1, бриттл-1 и 2), ячменя ( Хайлроли, Ризо 1508) и сорго (ЙС ІІ758). Поэтому Мерц охарактеризовал подобную ситуацию как "высоколизиновый синдром", а его симптомами определил "острый дефицит проламинов" и "хроническую гипераминокислотность" /97/.

1.2.4 Крахмал и крахмальные гранулы

Несмотря на интенсивное изучение биохимии высоколизиновых мутантов, вопрос об изменениях крахмалсинтезируюших систем опак-2 кукурузы почти не затрагивался, хотя некоторые исследова- тали связывают содержание крахмала с массой зерна и урожайностью /85,107/, Большинство крахмал-модифицируюпшх мутаций кукурузы в той или иной степени изменяют баланс аминокислот и белков и под-нимают содержание лизина в эндосперме.

В клетках высоколизиновых мутантов ячменя (Хайпроли, Ризо 1508, Мутант 56) угнетен синтез крупных крахмальных гранул и практически отсутствует популяция мелких /107/. В результате в эндосперме Ризо" 1508 синтезируется на 20 % меньше крахмала и вдвое увеличивается содержание свободных Сахаров /85/. Батра с сотр. /42/ предположили, что снижение синтеза крахмала в высоко-лизиновом мутанте ячменя Notch - 2 вызвано изменениями в крах-малсинтезирующей ферментной системе, в частности, уменьшением активности фосфоглюкоязомеразы. При этом неутилизированные саха-ра-лредшественники накапливаются в листьях /117/.

Учитывая широкое плейотропное действие гена опак-2, можно предположить, что с его введением в нормальный генотип, изменяется пути накопления не только белков, но и углеводов, как это происходит у большинства известных высоколизиновых мутантов ячменя /122/. По данным Тымчука /29/ относительное содержание крахмала в высоколизиновых линиях и гибридах в среднем снижалось на 2...3.%, а соотношение амилоза : амилопектин и концентрация водорастворимых полисахаридов, моно- и дисахаридов не изменялось. Джоши с сотр. /82/ обнаружили, что активность глюкозо-6-фосфат-кетоизомеразы и АДФГ - крахмал-глюкозилтрансферазы (синтетазы крахмала) после 30-го дня развития в опак-2 эндосперме резко падала. В результате накопление крахмала.мутантом на поздних стадиях развития снижалось. Фонзо с сотр. /66/ также указывает на угнетение синтеза крахмала высоколизиновыми мутантами опак-2 и флауря-2.

I.3 Улучшение структуры и физических свойств опак-2 эндосперма

В последнее время в литературе появилось много сообщений об улучшении текстуры опак-2 эндосперма /11,37,67,69,70,71,90, 96,109/. Способы, которыми достигается модификация, различны (химический мутагенез /11,96/, отбор мозаичных форм /67,94/ и т.д.), однако результат однозначен: в мягком опак-2 эндосперме появляются роговидные (полупрозрачные) участки с высокой удельной плотностью. Эти участки могут окружать рыхлую опак-2 ткань сплошным слоем /II/ или чередоваться с мучнистыми секторами /94/, вызывая мозаичность эндосперма, В большинстве случаев появление модифицированной ткани влечет за собой улучшение таких характеристик, как масса 1000 зерен, плотность, прочность и, в конечном итоге, урожайность /II,115/. Однако по содержанию лизина, зеина и других белковых фракций /67,90,96,115/ модифицированный эндосперм, как правило, занимает промежуточное положение между нормальным и опак-2. Гупта с сотр. /69,70/ показали, что белок-син-тезируюшая активность в модифицированном и нормальном эндоспермах выше, чем в опак-2. С возрастанием степени стекловидности в опак-2 эндосперме, как правило, уменьшается относительное содержание лизина /11,67,90/ и триптофана /90/, альбуминов, глобулинов и глютелинов /69/, и возрастает количество зеина /67,90,96/ и суммарного белка /37,90/. Гентинетта с сотр. /67/, анализируя 46 опак-2 линий с модифицированной текстурой эндосперма, обнаружили, что гены-модификаторы специфически изменяют спектр прола-минов при изоэлектрофокусировании, обогащая его новыми компонентами. С другой стороны, известны сообщения, что гены-модификаторы могут приближать электрофоретический спектр альбуминов к нормальному /37/. С увеличением содержания зеина в модифицированных эндоспермах увеличивались размеры и количество белковых тел, а глютелины занимали промежуточное положение между нормальной и опак-2 кукурузой /67/. На основании своих исследований, Гентинет-та с сотр. делают вывод, что необходимая степень плотности опак-2 эндосперма может быть достигнута повышением доли проламинов в белке до 30...35 %, в то время как высокое количество белка - за счет увеличения содержания полноценных глютелинов.

В последнее время для модификации мягкого опак-2 эндосперма широко используются гены su₂ , wx , ае , изменяющие содержание в крахмале амилозы и амилопектина /15,101/. Несмотря на это, накопление запасных полисахаридов, интенсивность работы ферментов крахмалоин тезирующей системы у двойных мутантов o₂/su2, o₂/wx и других практически не изучено.

1.4 Заключение по аналитическому обзору

Анализ литературных источников позволил сделать следующие выводы.

Плотность эндосперма кукурузы положительно связана с массой 1000 зерен, механическими свойствами зерновки и, в конечном итоге, - с урожайностью.

Потенциально значимый вклад в формирование эндосперма кукурузы с высокой удельной массой могут вносить такие запасающие образования, как крахмальные гранулы и белковые тела. При этом, вопросы влияния на плотность соотношения амилозы и амилопектина в зернах крахмала, размеров и компонентного состава проламинов протеиновых тел, количества глютелиновых белков, и некоторые другие недостаточно освещены в литературе и нуждаются в специальном изучении.

Регуляторний ген опак-2 имеет широкое плейотропное действие; в результате которого снижается плотность и прочность эн- досперма, изменяется фракционный и компонентный состав белков, > снижается эффективность зеин- и крахмалсингезирующей систем.

Несмотря на то, что в селекции высоколизиновой кукурузы получен ряд линий с частично роговидным или мозаичным типом эндосперма, структурные и биохимические механизмы действия большинства генов-модификаторов до настоящего времени не изучены,

Компонентный состав зеиновых белков эндосперма маркирует ген о₂ и теоретически может быть связан с признаком плотнозерно-сти. Это предположение вытекает из двух предпосылок: а) пролами-ны кукурузы являются множественными полиморфными белками, удовлетворяющими требованиям, предъявляемым к белкам-маркерам, и б) зеин непосредственно влияет на формирование плотного эндосперма, являясь основным содержимым белковых тел.

Вопросы влияния биохимического состава эндосперма на его плотность (например, отдельных фракций белка или полисахаридов) изучены недостаточно и не дают рекомендаций, по какому из признаков конкретно необходимо вести селекционный отбор на повышение удельной массы олак-2 зерна.

Использующийся в настоящее время в селекции способ отбора зерновок высоколизиновой кукурузы с повышенной плотностью (визуально, по соотношению роговидных и мучнистых частей) не позволяет производить быструю и точную оценку по признаку плотно-зерности.

2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 Растительный материал

В качестве исходного растительного материала были отобраны линии зубовидной кукурузы (Zea mays ь.) и их высоколизиновые опак-2 аналоги, различающиеся по признаку плотности зерна урожаев 1980 .1982 гг. Четыре опак-2 линии с относительно высокой ("7аЗ?и Гб 817 ) и низкой (W70 и W155 ) плотностью зерна ( численные значения плотности и характеристику эндосперма см. в табл. 2.4.) были скрещены в 12 возможных комбинациях. Полученное зерно высевали в следующем году и гибридные растения 1-го поколения самоопыляли. Гибридное зерно 2-го поколения ( с растений "В^ ) дополнительно разделяли по признаку плотности на 6...8 градаций ( Приложение I ). Для анализов использовали зерна с крайними и средними значениями плотности.

Изменение структуры и ультраструктуры эндосперма под действием гена опак-2 было изучено в динамике развития зерновки ( 11-й, 22-й и 29^-й для световой и П-й, 12-й, 14-й, 16-й, 19-й и 20-й дни после опыления для электронной микроскопии ) на инбредной ЛИНИИТС64А ,

Для выяснения механизмов повышения плотности и улучшения структуры опак-2 эндосперма путем введения некоторых крахмал- и белок-модифипирующих генов, были использованы близкие к изогенным ( не менее 6 беккроссов ) мутанты на линищб4А : опак-2, флаури-2, вэкси, шугари-2 и их двойные комбинации: опак-2/флаури-2,опак-2/ вэкси, опак-2/шугари-2. Модифицированный опак-2 эндосперм был изучен на линиях W70 (W70 о₂/о₂ SupVSupl - см./П/ и Сг-2 (СГ -2 о₂/о₂ мод. ) селекции КНИИСХ. Всего для исследования было отобрано 45 линий, гибридов, мутантов, контрастно различающихся по признаку плотности зерна. Семенной материал был предо - ставлен отделом селекции кукурузы КНИИСХ. '

2.2 Подготовка препаратов для световой и электронной микроскопии

Методика приготовления препаратов для световой микроскопии, измерения плошади клеток, содержания крахмальных гранул и условия микрофотосъемки описаны ранее /30/.

Для электронной микроскопии кусочки ткани П-,12-,14-,16, 17- и 19-ти дневного эндосперма (I мм³ или менее) фиксировали в 2,5 % глютаровом альдегиде (на фосфатном буфере, рН = 7,3) в течение 3-х часов при,температуре +4 С. После 2-х кратной промыв' ки.тем же буфером (20...30 мин.) на холоду, ткань переносили на 1...1,5 часа в тетраокись осмия (в темноте, при +4 С), затем промывали буфером, дистиллированной.водой и лереносили в 0,5 % водный раствор уранилацетата на 10...12 часов. Обезвоживали в . 20,30,50,70,90 и 100 % ацетоне (в последнем 60 мин. х 3) и пропитывали смесью ацетон/эпоксидная смола (1:3, 1:1, 3:1) по I...2 час, после чего погружали на 24...48 час. в чистую эпоксидную смолу. Полимеризовали в полиэтиленовых капсулах при температуре 60 С в течение 24 час. В качестве заливочной среды использовали Аралдит, Эпон 812 или их смесь. Ультратонкие срезы 500...600 А⁰ толщиной, помещенные на сетках, контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу /114/ и просматривали на электронном микроскопе УЭМВ-Ю0 К при ускоряющих напряжениях 50/¹ К⁷ . Осадки белковых тел и микросом обрабатывали аналогично.

2.3 Определение плотности запасающих клеточных образований

Зерно с початков на 30-й день после опыления замораживали в поле жидким азотом и хранили при -20 С. Непосредственно перед опытом зародыш и перикарп удаляли вручную, эндоспермы из- мельчали в фарфоровой ступке, добавляя жидкий азот. К растертой массе доливали (в соотношении 1:1) трис-буфер (0,2 М трис-нсі , 60 мМ kdi » 50 мМ MgCi₂). В случае выделения белковых тел буфер готовился на 15 % растворе сахарозы. Для приготовления непрерывных градиентов плотности сахарозы (16,,.80 %) и хлористого цезия (50...65,1 %) использовали градиентный смеситель фирмы ЖБ. Смесь растертых эндоспермов в буфере продавливали через 4 слоя марли и 4.,.5 мл полученной суспензии наслаивали на 53...54 мл градиента,в центрифужной пробирке. Центрифугировали 30 мин. при 15 тыс,об, для определения плавучей плотности крахмальных гранул, (в градиенте хлористого цезия) и 2,5 часа при 24 тыс,об. для определения плавучей плотности белковых тел (в градиенте сахарозы) в ультрацентрифуге "Хитачи 65 Р" (бакет - ротор). Градиент раскапывали с помощью коллектора фракций и спектрофотометра "Увикорд" (280 нм) фирмы "ЖБ". Плотность раствора каждой фракции (в среднем 1,6 мл) определяли рефрактометрически. Визуальный контроль содержимого пробирок коллектора осуществляли с помощью фазово-контрастного микроскопа. Крахмальные гранулы идентифицировали по двойному лучепреломлению в поляризованном свете.

Для разделения белковых тел и микросом методом дифференциального центрифугирования замороженный эндосперм разрушали в мельнице и добавляли буфер (0,2 М трис- Ш1 , рН 8,5; 0,25 М сахароза; 0,05 MMgCi₂, 0,06 М всі , 0,005 М дитиотреитол). Гомогенат фильтровали и центрифугировали при 500 g 5 мин. Надоса-дочнуго жидкость центрифугировали при 37000 g 10 мин. для осаждения белковых тел, а затем при 80000 g 40 мин. для отделения микросом.

2.4 Выделение фракций белков

Выделение и количественное определение белковых фракций 0с- борна проводили по методике, принятой в нашей лаборатории /25/. Более полное фракционирование осуществляли методом Ландри и Муро с незначительными изменениями /24/.

2.5 Изоэлектрофокусирование зеина

Зеин выделяли по методике, разработанной в ВИР /4/. Дважды переосажденный раствором хлористого натрия, зеин промывали дистиллированной водой и высушивали под вакуумом над сухой щелочью. Навеску, содержащую 10 мг белка, растворяли в I мл 8 М мочевины и добавляли I % 2-меркаптоэтанола. Полученный раствор наносили на гель с помощью кусочков фильтровальной бумаги (старт у катода). Гель готовили из следующих компонентов: мочевина - 21,6 г, акриламид - 1,8 г, бисакриламид - 90 мг, вода - до 56 мл, амфо-лины (рН - 6...9) - 1,5 мл, рибофлавин - 0,4 мл (I мг растворить в 25 мл воды), персульфат аммония - 0,6 мл (12 мг растворить в 60 мл воды). Фокусирование велось на приборе "Мультифор" фирмы ^МЖБ" в течение II часов. После процедуры гели обрабатывали 12-14 часов в 10 % ТХУ и денситометрировали на денситометре "ДМ7-330" фирмы "Тойо". Площади ликов лодсчитывались автоматически. Для определения степени сходства спектров, величины площадей пиков сравнивали попарно и рассчитывали коэффициент корреляции.

2.6 Определение крахмала и амилозы . Определение содержания крахмала проводили поляриметрическим методом /12/, амилозы - спектрофотометрически, по методике, предложенной Джулиано /83/.

2.7 Аминокислотный состав

Аминокислотный состав муки определяли после кислотного гидролиза методом ионообменной хроматографии на аминокислотном ана- -:-.-.,-:^1 лизаторе фирмы "Хитачи". Условия гидролиза: 22 часа с 6 Н соля- ^ ной кислотой в закупоренных пузырьках при 110 С. Определение цистина и метионина проводили отдельно, как описано в /24/.

2.8 Измерение удельной массы зерна и эндосперма

Плотность зерна определяли способом флотации в растворах сахарозы. В дистиллированной воде растворяли при нагревании сахарозу в концентрациях 10,20,30,40,50,60,70 и 80 массовых %. Смесь зерен помешали в дистиллированную воду, всплывшие зерна отделяли, а остальные переносили в сосуд с 10 $ раствором сахарозы, затем операцию повторяли, каждый раз перенося утонувшие зерна в сосуд с более высокой концентрацией. Разделенные зерна промывали водопроводной водой и высушивали на фильтровальной бумаге. Плотность раствора сахарозы определяли рефрактометрически по формуле: п - 5,958 —₈₅ где р - удельная плотность раствора (г/см) при 25 С; п - коэффициент преломления.

Если плотность зерна была выше плотности имеющихся растворов, то к 80 % сахарозе добавляли рассчитанные объемы 50 % хлористого цезия.

Удаление зародыша, щитка и разделение эндосперма на мучнистую и роговидную части осуществляли вручную.. Зерно 45-дневных початков линии w64 А замораживали в жидком азоте в поле и после разделения на части лиофильно высушивали. Активность рибонуклеази в разделенных частях определяли по Чепинога / 24 /.

2.9 Статистическая обработка результатов

Достоверность различий определяли, исходя из табличных значений критерия Стьюдента. Величина выборки для измерения белковых тел, крахмальных гранул, площади клетки и т.д. составляла от ЗО до 100. Для световой и электронной микросколии использовали материал 4-х генераций. Балок, лизин, крахмал, амилозу, фрак-ции белков определяли в 3 повторностях. Усредненные за 2 года результаты анализов эндосперма линий, гибридов и мутантов обработаны методом коэффициентов путей Райта /23/ на ЭВМ "Мир-1".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОШШЙ

В соответствии с поставленными целями и задачами исследования работа была проведена по нескольким взаимосвязанным направлениям : изучен компонентный состав проламинов и исследована возможность выделения высоколизиновых форм кукурузы с плотным эндоспермом с помощью белковых компонентов - маркеров; исследованы специфические отклонения в клеточной и субклеточной организации эндосперма опак-2 кукурузы, следствием которых является снижение плотности зерна и развитие мучнистого эндосперма; определен вклад основных запасающих образований ( крахмальных гранул и белковых тел ) в формирование плотного эндосперма; исследовано влияние компонентного состава проламинов и фракционного состава крахмала на плотность белковых тел и крахмальных гранул соответственно; изучены корреляционные зависимости между содержанием лизина, фракщй белков по Осборну, крахмала ( в том числе амилозы и амилолектина ) и плотностью зерна кукурузы; эндосперм обычной кукурузы разделен на роговидную и мучнистую части и изучены биохимические и структурные особенности этих двух типов ткани.

3.1 Изменение клеточной структуры и ультраструктури эндосперма под действием гена опак-2 3.1.I Морфология клеток в различных гистологических слоях эндосперма нормальной и опак-2 кукурузы

Для изучения влияния гена опак-2 на клеточную организацию эндосперма кукурузы линии w 64 А было проведено его морфомет-рическое исследование по таким параметрам, как размер клеток, белковых тел, крахмальных гранул и процентное содержание последних в клетке для трех зон эндосперма: алейронового, субалейронового слоев и центральной части (рис. I, Приложение 4). > Л { > Г <

Рис. I Схематическое изображение зон обычной (слева) и опак-2 (справа) кукурузы в районе вершины зародыша (29-й день развития). А - перикарп (200 - 300 мкм); Б - монослой алейроновых клеток (40 - 60 мкм); В - переходные клетки субалейронового слоя (80 - 100 мкм); Г - субалейроновый слой (2 Ю³ - З Ю³ мкм); Д - центральная часть (1,5 Ю³ - 2,5 I0³ мкм).

2 QOi

о 0,0. Y Д S

4>Y_Q0<7₀C ³поГгГС

О о ^(Г/л о С о^в_л\7ооро So

Целью проведенной работы было обнаружить изменения в клеточной структуре, приводящие к исчезновению в опак-2 эндосперме плотных стекловидных участков и замене их рыхлыми, "мучнистыми. Наибольший интерес с этой точки зрения представляет субалейроновый слой, в клетках которого содершітся основной запас белка и крахмала (рис. I Г).

На всех выбранных этапах развития клетки субалейроновой зоны, в опак-2 эндосперме были в 1,5... 2 раза крупнев обычных (табл. 2.1, рис. 2).

В отношении других зон укрупнение клеток наблюдали в алейроновом слое и центральной части (табл. 2.1); исключение состав-. лял 22-й день развития, где достоверность различия ниже принятых для биологических объектов границ.

Таблица 2.1

Размер клеток различных зон эндосперма обычной и мутантной опак-2 кукурузы, мкм²

ГоплФйп ^: Алейроно- : Переходный :Субалейро- :Центральная хвжиші . _{вый слой} . _слой :новый слой : часть

11-й день после опыления Нормальный 151,32^х 239,43" 1212,52^х 3935,05³³¹

Опак-2 271,84 255,11 3256,75 10059,87

22-й день после опыления

Нормальный 465,44²³³¹ 501,01"* 6480,12²³¹ 14683,27^ох

Опак-2 495,35 400,13 9611,07 17132,16

29-й день после опыления

Нормальный 482,58^х 424,78" 6098,88^х 11738,21³³¹

0пак-2 1029,57 508,68 10427,65 15424,33 ^х Р = 0,0001; ** Р _s 0,001; ^³³¹ Р = 0,1; ~ Не достоверно.

Причины укрупнения клеток в опак-2 эндосперме не совсем яс-

Рис. 2 Клетки субалайронового слоя эндосперма на 29-й день развития. Вверху - нормальный эндосперм; видны плотно упакованные полигональные гранулы крахмала (кг) и крупные белковые тела (БТ), заполняющие пространства между ними. Внизу - опак-2 эндосперм; крахмальные гранулы и белковые тела рассеяны в цитоплазме; клетка крупнее обычной. КС - клеточная стенка. Масштаб : 50 мкм ны. Из литературы известно /25,26/, что в мутантном эндосперме содержится в несколько раз больше свободных аминокислот, в том числе и полярных, которые обладают способностью связывать воду, С другой стороны, содержание сухого вещества в эндосперме опак-2 кукурузы понижено, а воды повышено. Поэтому ранее нами было предположено, что укрупнение клеток в эндосперме мутанта связано с осмотическим обводнением цитоплазмы /30/. Однако более вероятно, что увеличение объема клеток является результатом снижения интенсивности их деления, как это было обнаружено в случае некоторых высоколизиновых мутантов ячменя /107/.

В алейроновом слое (при выбранных условиях фиксации и окраски) белковых тел аналогичных обнаруженным в крахмалоносной паренхиме не наблюдали. Крахмальные гранулы в алейроновом слое и переходных клетках субалейронового слоя встречались очень редко, поэтому в таблице 2.3 эти зоны эндосперма не приведены.

Полученные данные по размерам белковых тел нормальной кукурузы в целом согласуются с литературными /40,54,64,138,139/, однако обнаружено, что белковые тела олак-2 эндосперма разрешаются световой оптикой, в отличие от данных Вольфа с сотр. /138/, и составляют в среднем 0,7...0,8 мкм в диаметре (табл. 2.2). На всех изученных этапах развития белковые тела субалейроновой зоны опак-2 эндосперма были в 1,5...2 раза мельче нормальных (табл. 2.2).

Резкое уменьшение в мутантном эндосперме размера белковых тел, в которых, как доказано в ряде работ /47,88,99/, происходит накопление основного запасного белка кукурузы - зеина, хорошо согласуется с фактом редукции синтеза зеина в опак-2 кукурузе. Характерно, что к 29 дню развития зерновки белковые тела субалейроновой зоны обычного эндосперма быстро укрупняются, в то время как в опак-2 эндосперме их развитие резко отстает и они не пре- вышают по размерам белковые тела центральной части (табл. 2,2, рис. 3).

Таблица 2.2

Размер белковых тел (в мкм) разных слоев эндосперма нормальной и опак-2 кукурузы ^х Р = 0,0001; ** Не достоверно.

Процент крахмальных гранул в клетках субалейронового слоя опак-2 эндосперма был значительно ниже, чем у нормального аналога (табл. 2.3).

В результате неплотного заполнения клетки крахмальные гранулы мутанта оказываются свободно взвешенными в цитоплазме и приобретают овально-округлую форму вместо полигональной (рис. 2, 3, Приложение 5).

Резкий скачок в количестве крахмальных гранул на единицу площади отмечен в нормальном эндосперме с 22 по 29 день развития (табл. 2.3). В этот же период накопление крахмальных зерен в опак-2 клетках практически останавливалось (табл. 2.3). Если по размерам белковых тел между нормальной и высок олизиновой кукурузой были обнаружены резкие различия, то в отношении диаметра крахмальных гранул таких различий не наблюдалось (табл. 2.3).

Рис. 3 Клетки субалейроновой зоны эндосперма нормальной (вверзсу) и ояак-2 (внизу) кукурузы. КГ - крахмальные гранулы, БТ - белковые тела, КС - клеточная стенка. Масштаб : 20 мкм

Таблица 2.3 Содержание крахмальных гранул в клетке и их размер ^х Р = 0,01; ** Р = 0,0001; ^7ZX Не достоверно.

Упаковка клеток запасающими образованиями была также изучена для других генотипов, различающихся по плотности зерна. Так, например, в клетках самой плотнозерной (1,5...1,6 г/см³) из изученных линий Va35, цитоплазма тиче ский матрикс не просматривался совсем из-за сдавленных полигональных зерен крахмала и заполняющих остающееся пространство крупных белковых тел (Приложение 6). В опак-2 аналоге описанная компактная упаковка клеток изменялась: между крахмальными гранулами появлялись обширные участки цитоплазмы с погруженными в нее мелкими белковыми тела- ми (Приложение 6).

В результате модификации опак-2 эндосперма (линия w 64 A) введением генов su₂ и wx , изменяющих соотношение амилозы и амилопектина в крахмале, наблюдали частичное восстановление компактной упаковки клеток, в основном, за счет количества крахмальных гранул (Приложение 7). Белковые тела двойных рецессивов (опак 2/шугари-2 и опак-2/вэкси) под световым микроскопом не были обнаружены (Приложение 7). При введении гена шугари-2, повышающего содержание амилозы до 30 %, крахмальные гранулы теряли целостность оболочки и выглядели частично разрушенными (Приложение 7). Однако заполнение ими клеток было более полным и компактным по сравнению с опак-2.

В эндосперме двух пар контрастных по плотности опак-2 линий и гибридах 1-го поколения между ними были измерены диаметры белковых тел, крахмальных гранул и площадь клеток (табл. 2.4; Приложение 3). Размер белковых тел положительно коррелировал с удельной плотностью (г = 0,60, Р = 0,02) и содержанием пролами-нов (г _s 0,71, Р = 0,01). Связи плотности с диаметром крахмальных гранул и площадью клетки (данные не приведены) среди высоко-лизиновых линий не было обнаружено.

Размер клеток эндосперма широко варьировал у различных опак-2 линий независимо от колебаний плотности зерна и по-видимому являлся специфическим признаком конкретного генотипа.

Таким образом, наиболее явными изменениями структуры под действием гена опак-2 на уровне световой микроскопии были укрупнение клеток (в сравнении с нормальным аналогом), угнетение развития белковых тел и накопление крахмальных гранул в клетках субалейроновой зоны эндосперма. С другой стороны, с увеличением удельной массы зерна высоколизиновой кукурузы, укрупнялись белковые тела и возрастало количество проламинов.

Таблица 2,4

Размер и количество белковых тел в эндосперме некоторых опак-2 линий и гибридов : Гибридное ; : зернв 1-го : поколения :

3.1.2 Ультраструктура клеток нормальной и мутантной кукурузы

Ультраструктура клеток эндосперма нормальной и опак-2 кукурузы была изучена на ранних стадиях развития (на 11,12,14,16, 17 и 19 сутки после опыления). Клетки субалейроновой (крахмало-носной) зоны эндосперма резко отличались по размерам и ультраструктуре от клеток алейронового монослоя. Последние имели небольшие размеры (табл. 2.1), толстые клеточные стенки, содержали крупное ядро с одним или несколькими ядрышками, вакуоли, мем- ораны эндоплазматической сети (Приложение 8). В цитоплазме алейроновых клеток находилось большое количество митохондрий, рибосом и липидных капель, иногда встречались лейкопласты (Приложение 8), однако развивающихся крахмальных гранул и белковых тел не было обнаружено. Своеобразие ультраструктурной организации алейроновых клеток отражает специфику их физиологических функций в эндосперме, связанных с секреторной деятельностью в период прорастания /13,107/.

Характерной особенностью клеток крахмалоносного эндосперма обоих генотипов была развитая гранулярная эндоплазматическая сеть, большое количество свободных и мембраносвязанных полирибосом, двойные мембраны эндоплазматического ретикулума часто проникали в соседние клетки через перфорирующие клеточные стенки множественные плазмодесмы (рис.5). На самых ранних из изученных стадий развития (11-й, 12-й и 14-й дни после опыления) в цитоплазме встречалось много липидных капель диаметром 0,5...1,5 мкм (рис. 4). в этот же период в строме амилопластов (Приложение 9) появлялись мелкие одиночные зерна крахмала, а в цитоплазме -сферические пузырьки, окруженные одинарной мембраной, которые были идентифицированы как белковые тела (рис. 4). В опак-2 эндосперме аналогичные образования появлялись позже - к 16-му дню развития. В клетках нормального эндосперма к этому сроку многочисленные белковые тела укрупнялись до 0,1...0,3 мкм (рис. 5). 19-дневный эндосперм и обычной (рис. 5) и мутантной (Приложение 10) кукурузы содержал белковые гранулы и разветвленную эндоплазма тическую сеть. Белковые тела представляли собой расширения гранулярного эндоплазматического ретикулума, заполненные электронно-плотным содержимым (рис. 6).

Мембраны эндоплазматической сети и белковых тел были покрыты лолисомами, состоящими из 6...8 рибосом (рис, 7). В процессе

Q.5HKM.

_{ьл& зт}

ОДІ "?

Рис 4 Часть МММ субалейронового слоя 11-ти (ввар**) и 12-ти дневного эндосперма нормальной кукурузы (внизу) БІ - силковое тало; гар - гранулярный эндоплазматический ретикулум; Д - диктиосома. КСГГлаточная станка. КГ - Ц««» *»«»« Ж - липидаые капли. М - митохондрии.

Рис. 5 Клетка эндосперма обычной кукурузы на 16-й (вверху) и 19-й дни после опыления. Характерной особенностью является развитая гранулярная эндоплазматическая сеть и большое количество свободных и мембранесвязанных рибосом. БТ - белковые тела; гэр - гранулярный эндоплазматический ретикулум; Д -диктиосомы; КГ - крахмальная гранула; КС - клеточная стенка; Ж - липидная капля; 1 - митохондрии; ПМС - плазмодесми

Рис, 6 Ультраструктура белковых тел 19-дневного эндосперма. Содержимое белкового тела отграничено от содержимого просвета эндоплазма тиче ской сети. М : 0,3 мкм развития накопленный в просвете белок отшнуровывался от эндо-ллазматической сети, однако лолисомы оставались связанными с внешней поверхностью окружающей его мембраны (рис. 7). Белковые тела и нормальной и опак-2 кукурузы содержали гомогенный мат-рикс, однако у мутанта были в 1,5...2 раза меньше в диаметре (табл. 2.5). в.ружн<

Рис. 7 Полирибосомы, при-к наружной

мембране белкового тела и эндоплазматячбской сети. Масштаб : 0,3 мкм

Кроме того, было обнаружено, что популяция митохондрий клеток опак-2 эндосперма содержала более крупные органеллы (табл. 2.6). Возможно, увеличение объема митохондрий мутанта связано с повышенным содержанием воды в клетках опак-2 эндосперма: как известно, митохондрии обладают осмотической активностью и способны набухать и многократно увеличиваться в гипо-

Таблица 2.5

Размеры белковых тел нормальной и опак-2 кукурузы линии W64 А

Источник белковых тел

Диаметр белко- :Коэффици-вых тел (мкм) :ент вариации (%)

Субалейроновый слой эндосперма (19-й день развития)

Белковые тела гомоге-ната 19-дневного эндосперма, выделенные из непрерывного градиента плотности сахарозы нормальный опак-2 нормальный опак-2

0,45^х і 0,03 59,0

0,34 ± 0,04 87,8

0,63³^ І 5'КГ⁴ 33,4

0,32 ± 5'Ю"⁴ 33,7

Р = 0,05;

Р = 0,01.

Таблица 2.6

Размер митохондрий в клетках опак-2 и обычного эндосперма (линия ^w64 А, 19-й день развития)

Генотип

Средняя площадь, занимаемая митохондрией в плоскости ^с*>^вза (мкм²)

Коэффициент вариации

Нормальный 0пак-2

0,34^х ± 0,03 0,86 ± 0,02

42,6 52,6 ^х Р = 0,01. тонических растворах. С другой стороны, в эндосперме высоколизи-новой кукурузы увеличено содержание ионов К⁺ /38/, накопдение или выброс которых митохондриями сопровождается изменением объема их матрикса.

Таким образом, изучение кремнистого (нормального) и рыхлого (опак-2) эндосперма с помощью просвечивающей электронной микроскопии на ранних стадиях развития выявило некоторые отклонения в ультраструктуре клеток мутанта. В первую очередь - это угнетение развития белковых тел, в которых депонируется основной запасной белок кукурузы - зеин. При этом тонкая структура и механизм образования белковых тел были сходны у обоих генотипов, а изменялись только количество и размер образований. Однако, в литературе имеются сообщения, что белковые тела зрелого эндосперма и обычной и опак-2 кукурузы гетерогенны и различаются по плавучей плотности /16/. Причем, в эндосперме нормальной содержится 2 типа, а высоколизиновой - 3 типа белковых тел с различной плотностью /17/. С другой стороны, белковые компоненты зеина (локализованного в белковых телах) опак-2 кукурузы отличаются от обычной. Поэтому на следующих этапах исследования представляло интерес выяснить влияние компонентного состава белковых тел на их удельную плотность и плотность эндосперма в целом.

3.2 Определение компонентного состава проламинов кукурузы с различной плотностью зерна

В последнее время в селекции растений появился подход, использующий полиморфизм запасных белков злаков для маркирования отдельных селекционноценных признаков /28/. Помимо того, что проламины кукурузы вносят непосредственный вклад в плотность эндосперма, аккумулируясь в многочисленных и плотных белковых телах, их полипептидный состав теоретически может быть связан с признаком плотнозерности по следующим причинам. Во-первых, зеин является полиморфным запасным белком с хорошо выраженной гено-типической специфичностью. Во-вторых, компонентный состав зеина не зависит от места и условий выращивания растения, являясь маркером конкретного генотипа (линия, гибрид, сорт и т.д.). В-третьих, электрофоретический спектр нативного зеина служит тестом на ген о₂ и может быть использован в анализе гибридных популяций, полученных с участием мутанта опак-2 /7/. По данным Конарева /7/, электрофоретический спектр даже в пределах одного початка зависит от дозы гена 02 и степени кремнистости эндосперма. Исходя из этого, мы попытались идентифицировать в спектре зеина компонент-маркер плотности, для чего было проведено изоэлектрофокуси-рование (ИЭФ) проламинов различных генотипов. Первоначально для этой цели выбрали 2 пары опак-2 линий с контрастными значениями удельной плотности зерна и различающихся по спектрам спиртораст-воримых белков. Между плотнозерными и рыхлозерными линиями провели прямые и реципрокные скрещивания во всех возможных комбинациях. ИЭФ спектры зеина родителей и потомства первого поколения анализировали в поисках компонентов, маркирующих высокую плотность зерна. Суммарный спектр всех изученных генотипов состоял из 32 компонентов (Приложение II), из которых около 15 классифицировали как основные, остальные относили к минорным. В спектрах исходных линий маркерного компонента, характерного только для плотнозерного генотипа, обнаружено не было. Например, хорошо представленный в спектре плотной Гб 817 Og/og компонент 27 (Приложение 12) был слабо выражен в рыхлозерных w 70 Og/og и w 155 o^/og (Приложение 13,15). Однако в спектре наиболее плотвой Va35 Og/og компонент 27 также присутствует в малых количествах. Противоположная картина наблюдается для компонента 3 (Приложения 12,13,15). Соотношение ликов 12 и 13 (базовые компоненты) также невозможно связать для данных линий с признаком ллотнозер-ности. В этой серии опытов было, однако, отмечено, что спектр зеина, как и плотность зерна гибридов 1-го поколения имели промежуточный характер. При этом они были наиболее близки к материнской линии. Например, при скрещивании плотной Гб 817 03/03 и рыхлой w 70 о₂/о2 (Приложение 12) наименьшая корреляция (0,95^х) наблюдалась между спектрами исходных линий, а наибольшая - между исходной линией и гивридом, в котором она взята в качестве ^х - Р=0,01 матери (0,96 ). Это объясняется тем, что в триллоидном эндосперме гибридного зерна 1-го поколения содержится два набора хромосом материнской линии и один - отцовской.

В другом опыте фокусировали зеин, полученный из зерна одного и того же гибрида ( w 70 OgA^ х Гб 817 02/), разделенного на 6 груші по признаку плотности (Приложение I). С увеличением плотности зерна спектр не претерпевал существенных изменений и в нем не появлялись новые компоненты (рис. 8, Приложение 14).

Плотность зерна . о (г/см³) w 70 о₂/о2 1,069

1,035

1,097

1,139

1,181

1,223

1,265

1,276 Va35 03/02

Рис, 8 Денситограммы спектров зеина, выделенного из зерна гибрида 1-го поколения w 70 03/02 х va 35 02/ t

Похожие диссертации на Клеточная структура и характер накопления запасных белков и углеводов в эндосперме кукурузы с различной плотностью зерна

Биомасса гриба Aspergillus oryzne 3-9-15 - источник белков, аминокислот, липидов и углеводовТкешелашвили, Майя Яшовна

Особенности нуклеиново-белкового обмена созревающего эндосперма кукурузы ОПАК-2 Плотников Владимир Константинович

Физиолого-биохимические особенности накопления углеводов и белков в семенах высокоамилозных сортов и линий гороха : Pisum sativum L.Сучкова Татьяна Николаевна

ДЕЙСТВИЕ ФИТОГОРМОНОВ НА РАСПАД АЛЕЙРОНОВЫХ ЗЕРЕН И ЖИРОВЫХ ТЕЛ И НА ФОРМИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР В СЕМЯДОЛЯХ ТЫКВЫХохлова, Валентина Александровна

Характер сопряжения накоплений цинка и кадмия растениями в условиях фитоценоза и агрокультурыПлеханова Вера Александровна

Характер сопряжения накоплений цинка и кадмия растениями в условиях фитоценоза и агрокультурыПлеханова Вера Александровна

Механизм накопления белков в ядрышкеМусинова, Яна Рафаеловна

Модельные системы для изучения температурной и гормональной регуляции накопления м РНК хлоропластных белковМостафа Ибрагим Сарват Ахмед

Всасывание продуктов гидролиза белков и углеводов : механизмы и регуляцияГромова Людмила Викторовна

Исследование влияния размера зерен и структуры границ зерен на механическое поведение интерметаллида TiAlИмаев, Валерий Мазитович