Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Реализация генетической информации у высшик животных 13
1.1. Состав и строение хроматина .14
1.1.1. ДНК-гистоновый комплекс 14
1.1.2. Негистоновые белки 16
1.1.3. Хромосомальная РНК г 17
1.1.4. Ядерная ДНК-зависимая РНК-полимераза 17
1.2. Структурная организация генома эукариот и модели регуляции транскрипций 19
1.2.1. Принципы организации последовательностей ДНК у эукариот 20
1.2.2. Гетерогенная ядерная РНК 24
1.2.3. Информационная РНК 27
1.2.4. Ядерные и цитоплазматические рибонуклеопротеиды, содержащие информационную РНК 35
1.2.5. Модели структурной организации единицы транскрипции и дифференциальной активности генов у эукариот 38
ГЛАВА 2. Реализация генетической информации в регенерирущей печени 45
2.1. Общебиологическая и морфологическая характеристика печени, регенерирующей после частичной гепатэктомии 45
2.I.I. Митохондрий регенерирующей печени 48
2.2. Транскрипция генетической информации в регенерирующей печени 50
2.2.1. Объем транскрибируемой информации 50
2.2.2. Динамика активности ядерной ДНК-зависимой РНК-полимеразы 55
2.2.3. Изменение структуры и некоторых свойств хроматина 57
2.3. Трансляция генетической информации в регенерирующей печени 61
2.3.1. Аминокислоты 61
2.3.2. Полисомальный аппарат 62
2.3.3. Синтез специфических белков 64
2.4. Регенерация печени, вызванная ингибитором трансляции циклогексимидом ("квазирегенерация") по Тодорову 66
ГЛАВА 3. Объект исследования, материалы и методы 71
ГЛАВА 4. Биосинтез ядерной рнк in vivoh in vitro 76
4.1. Биосинтез ядерной РНК in vivo 77
4.1.1. Методы исследования 77
4.1.2. Динамика ранних изменений удельной радиоактивности ядерной РНК после импульсной метки 2- С-оротовой кислотой 79
4.1.3. Влияние ингибитора митохоядриальной трансляции хлор-амфеникола на ранний подъем биосинтеза ядерной РНК 79
4.2. Биосинтез РНК в системе изолированных ядер 85
4.2.1. Методы исследования 86
4.2.2. Динамика эндогенной активности хроматина изолированных ядер 91
4.2.3. Изменение активности РНК-полимеразы I и II в первые часы после частичной гепатэктшии 98
4.2.4. Влияние ингибиторов цитоплазматической и митохондри-альной трансляции на эндогенную активность хроматина изолированных ядер 102
4.2.5. Влияние цитозола на эндогенную активность хроматина изолированных ядер 109
4.2.6. Биосинтез РНК в перекрестных системах, состоящих из ядер и цитозола покоящейся и регенерирующей печени 116
4.2.7. Частичная очистка цитоплазматического фактора из регенерирующей печени крыс 121
4.2.8. Механизм действия цитоплазматического "фактора регенерации" 127
ГЛАВА 5. Транскрипция ядерных рнк, комшшментарных последовательностям днк, с различной частотой повторяемости 131
5.1. Методы исследования 132
5.2. Определение содержания транскридтов с различных по частоте повторяемости последовательностей ДНК . 136
5.3. Изучение сложности ядерной РНК, транскрибируемой с различных последовательностей ДНК 147
ГЛАВА 6. Авторадиографическая и элекгр0нн0 кр0ск0пическая характеристика ранних этапов регенерации . 154
6.1. Методы исследования 155
6.2. Авторадиографическое изучение биосинтеза РНК . 157
6.3. Ультра структурные изменения гепатоцитов 163
6.4. Топографическая характеристика митохондрий . 175
ГЛАВА 7. Цитоплазматические ирнк и ирш 179
7.1. Методы исследования 182
7.2. Выявление в цитоплазме последовательностей РНК, аналогичных таковым в различных фракциях ядерной РНК 185
7.3. Информационные РНК цитоплазмы 188
7.4. Свободные цитоплазматические иРНП регенерирующей печени 196
Заключение 201
Выводы 224
Список литературы 226
- Принципы организации последовательностей ДНК у эукариот
- Изменение структуры и некоторых свойств хроматина
- Влияние ингибитора митохоядриальной трансляции хлор-амфеникола на ранний подъем биосинтеза ядерной РНК
- Изучение сложности ядерной РНК, транскрибируемой с различных последовательностей ДНК
Введение к работе
Организм, орган, ткань, клетка, субклеточные и надмолекулярные структуры, молекулы - уровни организаций живой материи, познание которых является большим достижением биологии последних нескольких десятилетий XX века. Успехи морфологии, физиологии, биохимии, молекулярной биологии и других дисциплин привели к тому, что мы теперь знаем основные принципы хранения и реализации генетической информации, понимаем, что в основе жизнедеятельности организма ведущую роль играют механизмы, осуществляющие и контролирующие экспрессию генома. Эти механизмы всё более усложняются по мере эволюционного роста; сложность их достигает максимума у высших эукариот.
Одним из аспектов сложной и многогранной проблемы регуляций экспрессии генетической информации у высших организмов является вопрос, как осуществляется переход высокодифференцированных клеток из одного функционального состояния в другое. Этот процесс имеет место при действии гормональных факторов на ткань-мишень, при резком изменении гуморальной среды, вызванном, например, изменением пищевого рациона. Большой интерес как с общебиологических, так и с медикобиологических позиций представляют собой системы, обладающие высокой пролиферативной активностью. К их числу относятся, прежде всего, ткани, интенсивно пролиферирующие в течение всей жизни организма (кроветворная система, слизистый эпителий кишечного тракта). Другие органы и ткани (печень, почки), отличающиеся низким митотическим индексом, обладают высокой потенциальной способностью к регенерации после действия различных повреждающих эти органы факторов. Ими могут быть либо паренхиматозные яды, либо экспериментально вызванное резкое снижение функции, обусловленное хирургическим удалением части органа (частичная гепатэктомия или односторон-
няя нефректомия).
В связи с анатомическими особенностями строения печени грызунов регенерация печени, вызванная частичной гепатэктомией, является одной из наиболее удобных экспериментальных моделей для изучения регенераторных процессов. Достоинства этой модели заключаются в следующем:
Высокая степень синхронизации клеточного цикла гепатоци-тов;
Разобщение во времени начала пролиферации гепатоцитов и соединительно-тканных элементов печени;
Простота и доступность модели, короткие сроки эксперимента.
Регенерация печени, вызванная частичной гепатэктомией, широко используется в различных биохимических и морфологических исследованиях, как модель для изучения интенсивно проходящих биосинтетических процессов. Этой стороне регенерации печени посвящено значительное число публикаций, тем более, что строго контролируемый рост клеток печени является идеальным контролем для изучения процессов гепатоканцерогенеза.
Как и для других пролиферирующих тканей, для регенерирующей после частичной гепатэктомии печени можно выделить предмитоти-ческую и пролиферативяые фазы регенерации. Первая, предмитотиче-ская стадия регенерации печени, представляет особый интерес с точки зрения регуляции экспрессии генома, так как именно в этой фазе закладываются основы "перепрограммирования" генетического аппарата клеток печени в ответ на пролиферативный стимул. Термин "перепрограммирование" был впервые предложен Цаневым (Tsa-nev, 1975) и подразумевает временное изменение спектра синтезируемых клеткой белков в ответ на адаптогенный стимул.
В свою очередь, предмитотическую стадию клеточного цикла
(регенерации) можно разделить на раннюю (переход клеток из gq в Gj фазу клеточного цикла) и позднюю, непосредственно связанную с началом репликации ДНК (Gj - s). Применительно к регенерирующей печени ранняя предмитотическая фаза соответствует первым 10 - 12 ч после частичной гепатэктомии, вторая - 12 - 24 ч после операции. Поздняя предмитотическая стадия регенерации печени характеризуется максимальной интенсивностью биосинтетических процессов и наиболее полно охарактеризована в литературе.
Наибольший интерес с точки зрения выяснения механизмов перепрограммирования генома клеток, стимулированных к пролиферации, имеет ранняя предмитотическая фаза. Из общих соображений ясно, что именно в первые часы после действия стимулирующего фактора должны начать проявляться молекулярные механизмы, подготавливающие клетку к делению. Тем не менее, именно этим срокам регенерации в литературе, посвященной регенерирующей печени, не уделялось должного внимания. Следует особо отметить отсутствие данных по динамике процессов реализации генетической информации в первые часы после частичной гепатэктомии.
В соответствии с представлениями, существующими в настоящее время, регуляция экспрессии генетическом информации у высших эукариот может осуществляться на следующих уровнях:
I) транскрипция; 2) процессинг (сплайсинг); 3) транспорт информации из ядра в цитоплазму; 4) трансляция.
Задачей введения не является детальный анализ всех этих возможностей применительно к регенерирующей печени, однако, необходимо определить основные направления настоящей работы, вытекающие из обозначенных выше этапов экспрессии генетической информации. Эти направления включают в себя решение следующих основных задач:
I. Изучение роли ядерной ДНК-зависимой РНК-полимеразы в ран-
нем ответе клеток на пролиферативный стимул;
Выяснение значения цитоплазматических, в том числе мито-хондриальных факторов, в перепрограммировании гепатоцитов, стимулированных к делению;
Изучение транскрибируемости последовательностей ДЕК, различающихся по частоте повторяемости;
Выявление особенностей транспорта ядерной РІЖ в цитоплазму и её характеристика в составе цитоплазматических ЕНП.
Обоснование постановки этих задач вытекает из следующих предпосылок .
I. Ядерная ДНК-зависимая РНК-полимераза является ключевым ферментом транскрипции. Она отличается сложным субъединичным строением, которое, как считается, связано с процессами регуляции транскрипции. У эукариот описано три формы ядерной РЖ-по-лимеразы, различающиеся по синтезируемому ими продукту (РНК-по-лимераза I, синтезирующая 18 и 28S рибосомальные РЖ; РЖ-поли-мераза П, ответственная за синтез гетерогенной ядерной РНК и РЖ-полимераза Ш, катализирующая синтез низкомолекулярных рибо-сомальных и транспортных РЖ).
Известно также, что при изменении функционального состояния клетки меняется активность отдельных форм фермента. В случае регенерирующей печени описано существенное возрастание активности РЖ-полимеразы I через 10 - 12 ч после частичной гепатэкто-мии. Однако динамика изменения активности различных форм РНК-полимера зы в первые часы после операции плохо изучена, тогда как выяснение этого вопроса представляется весьма актуальной задачей.
В настоящей работе представлены как результаты изучения РЖ-синтезирующей способности изолированных ядер, так и активности отдельных форм частично очищенной РЖ-полимеразы в динамике
предмитотической фазы регенерации печени.
2. Роль цитоплазмы в регуляции активности ядерного генома общеизвестна. Немаловажное значение во взаимосвязи цитоплазмы и ядра имеет тот факт, что все без исключения компоненты аппарата транскрипции синтезируются на цитоплазматических рибосомах, что и обусловливает роль аппарата трансляции в транскрипции ядерного генома. В литературе описаны различные цитоплазма-тические факторы, активирующие или ингибирующие биосинтез ядерной РНК, однако, механизм действия этих факторов на процесс транскрипции ядерного генома остаётся не ясным. Имеются единичные публикаций, посвященные роли цитоплазмы в биосинтезе ядерной РБК и её транспорте из ядра, относящиеся к поздней предмитотической фазе регенерации печени. Что касается ранней предмитотической стадии регенераций печени, то сведения о взаимосвязи цитоплазмы и ядра отсутствуют. В связи с этим представляло несомненный интерес выяснение роли цитоплазмы в активности ядерной РНК-синтезирущей системы в первые часы после частичной гепатэктомии.
В эукариотических клетках наряду с информацией, закодированной в ядерном геноме, имеет место генотип, обусловленный наличием ДНК в субклеточных структурах. Применительно к животным клеткам, последний связан с наличием в них митохондрий, содержащих митохондриальную ДНК. Информационная ёмкость митохондри-альяого генома невелика и не может обеспечить кодирования всех компонентов митохондриального матрекса; многие митохондриальные белки кодируются ядерным геномом, транслируются на рибосоглах цитоплазмы и затем включаются в состав митохондрий. Несмотря на значительную зависимость от ядерного генома, должна иметь место и обратная взаимосвязь митохондриального генотипа с ядром. Что касается низших эукариот (нейроспоры), то на этом объекте убе-
дйтельными экспериментами показана роль трансляции митохондри-альных рибосом в активности ядерных генов, ответственных за синтез митохондриальнои РНК-полимеразы (Barath, Kuntzei, 1972).
Предварительные электронно-микроскопические исследования ранних этапов регенерации печени в первый час после частичной гепатэктомии, в условиях блокирования митохондриальнои трансшя-ции, стимулировали предположение, что в раннем пролиферативном ответе генома ядра гепатоцитов немаловажную роль имеет трансляция рибосом митохондрий. Выяснению этой возможности, имеющей очень важное общебиологическое значение, посвящен один из разделов работы.
3. Вопрос о том, сопровождается ли пролиферативный ответ клеток изменением объёма транскрибируемой информации, до настоящего времени остаётся открытым. Не известно,также, меняет-ли при этом спектр транскрибируемых последовательностей ДНК, различающихся по частоте повторяемости. Последний вопрос имеет немаловажное значение для выяснения роли различных последовательностей ДНК в регуляции экспрессии генома вообще и в перепрограммировании генома клеток, стимулированных к пролиферации, в частности.
Сведения об объёме реализуемой в процессе регенерации печени генетической информации крайне противоречивы. Наряду с данными об увеличении транскрибируемой информации, имеются также литературные сведения о значительном её сужении в регенерирующей печени. Однако эти сведения носят хаотический характер в смысле их отношения к определённым фазам регенерации (клеточного цикла) и с трудом поддаются систематизации.
Одной из задач работы было выяснение возможности изменения транскрибируемости различных последовательностей генома регенерирующей печени и их представительства в составе различных
фракций гетерогенной ядерной НЖ, а также изучение возможного изменения объёма транскрибируемой информации в первые часы после стимулирования гепатоцитов к пролиферации.
4. В современных представлениях о регуляции экспрессии генома у эукариот важная роль отводится посттранскрипционному контролю потока генетической информации. Считается, что важную регуляторную роль в процессах регуляции биосинтеза белка имеют этапы транспорта ядерной РНК в цитоплазму и её накопление в составе щітоплазматических рибонуклеопротеидов. Последнее связано с обнаружением специфических РШ-частиц, названных информосома-ми, которые могут депонировать информациоішую РНК с последующим её освобождением для трансляции под действием соответствующего регуляторного сигнала. Запасание в цитоплазме информационной РНК с последующей её реализацией описано в раннем эмбриогенезе амфибий и рыб.
Для регенерирующей печени нет данных о возможной регуляции потока генетической информации, связанной с цитоплазматически-ми рибонуклеопротеидамй, как нет данных и о наличрш информосом в регенерирующей печени. Одной из задач работы было выяснение возможности накопления в регенерирующей печени цитоплазматиче-ских РШ, содержащих определённые классы информационных РЖ (иРНК для рибосомальных белков и гистонов).
Итак, на основании изложенных выше основных задач диссертационной работы можно сформулировать её основную цель - выяснение последовательности биохимических и молекулярных механизмов, сопровождающих процесс перепрограммирования генома клеток, стимулированных к пролиферации.
По материалам исследований опубликовано 38 научных работ, основные положения диссертации обсуггсдены на республиканских и всесоюзных конференциях и съездах, а также на международных
симпозиумах, посвященных структуре и функциям генома.
В выполнении настоящей работы на разных её этапах принимали участие сотрудники отдела молекулярных механизмов биосинтеза белка и лаборатории инструментальных методов исследования Института молекулярной биологии и генетики АН УССР, а также сотрудники Института проблем онкологии АН УССР и Института биохимии им. А.В. Палладина АН УССР.
От Института молекулярной биологии и генетики АН УССР - ст. н. сотр., к.б.н. СМ. Желябовская, мл. научн. сотр., к.б.н. П.Я. Сшлько, Т.В. Корнюшина, М.Ю. Оболенская, Т.Е. Герастлова, ст. инженеры В.И. Прима, Л.М. Лебедева, Э.Г. Лисица, К.М. Билич.
От Института проблем онкологии АН УССР - ст.н.с, к.б.н. В.М. Андрианов.
От Института биохимии игл. А.В. Палладина АН УССР - ст.н.с, к.б.н. А.С. Полищук, д.б.н. В.П. Короткоручко.
Автор выражает искреннюю признательность член-корр. АН СССР Г.П. Георгиеву за научную и методическую помощь в выполнении некоторых разделов настоящей работы.
Принципы организации последовательностей ДНК у эукариот
Как уже отмечалось ранее, РНК-полимераза функционирует в составе сложного комплекса, состоящего из ДНК, гистоновых и неги-стоновых белков, и РНК. Изменение структуры и свойств каждого из этих компонентов хроматина может сказываться на активности и каталитических свойствах РНК-полимеразы. В настоящее время мы не знаем, как осуществляется тонкая регуляция активности отдельных генов и генома в целом, и в настоящем обзоре не будем рассматривать многочисленные схемы структурной организации хроматина, так как это вряд ли приблизит нас к пониманию процессов активации генома в регенерирующей печени. В интересующем нас плане имеющиеся в литературе сведения можно сгруппировать следующим образом: а) данные, полученные in situ с применением цитохимических и электронно-микроскопических методов и б) результаты, полученные после фракционирования хроматина и изучения отдельных его компонентов.
При изучении связывания интеркалирующего красителя акридинового оранжевого со срезами печени с последующей цитофотометрией или цитофлюорометрией обнаружено существенное возрастание связывания красителя в первые 3 ч после частичной гепатэктомии и
ПОСЛеДуЮЩИМ СНИЖеНИеМ ЭТОЙ СПОСОбНОСТИ (Kushch et al., 1974, 1978; Alvarez, 1974; Кущ и др., 1975, 1976). Время максимального связывания с красителем варьировало в различных экспериментах в связи с использованием разных видов животных (у морских свинок оно составляло 2,5 ч, у мышей - 1,5 ч и у крыс с 30 % гепатэктомией - 3 ч). Для крыс, у которых удалено 68 % ткани печени, максимальное связывание акридинового оранжевого должно составлять I - 1,5 ч после операции. Увеличение связывания акридинового оранжевого вообще характерно для активированных К Пролиферации КЛеТОК (Darziekevish et al., 1969) И отражает число фосфатных групп ДНК, доступных для реакции с лигандом (Rigier, 1966). Таким образом, увеличение связывания акридинового оранжевого с ядрами печени в первые часы после частичной гепатэктомии отражает процесс декондеясации хроматина, предшествующий началу синтеза РНК. Параллельно с увеличением связывания акридинового оранжевого возрастает и связывание актиномици-на Д, что также обусловлено повышением доступности ДНК (Кущ и др., 1976). Работами перечисленных выше авторов (в основном группы А.В. Зеленина) установлены и другие ранние изменения свойств хроматина, свидетельствугощие о его декондеясации в первые часы после частичной гепатэктомии: возрастание доступности ДНК к нуклеазам и РНК-полимеразе, снижение устойчивости к действию температурной и кислотной денатурации и другие. Важно ещё раз подчеркнуть, что эти изменения не совпадают с периодом максимальной активноститРНК-полимеразы и биосинтеза РНК, а предшествуют им.
Эта же группа провела электронно-микроскопический анализ хроматина ядер морских свинок в первые часы после частичной гепатэктомии (Мантейфель и др., 1977; Ершов и др., 1979). Оценивая площадь, занимаемую конденсированным хроматином и количество перихроматиновых РШ-фибрилл, авторы установили, что через 2,5 ч после операции площадь конденсированного хроматина снижается, а количество РШ-фибрилл увеличивается. Эти показатели приходят к контрольному уровню через 5 ч после операции. Через 9 ч после частичной гепатэктомии хроматин снова деконденсируется, а количество перихроматиновых РШ-фибрилл вновь увеличивается. Параллельно с увеличением РШ-фибрилл меняется связывание другого интеркалирующего красителя - бромистого этидия. Ещё раз необходимо отметить, что скорость регенераторного процесса у морской свинки замедлена по сравнению с крысой, и 2,5 ч после частичной гепатэктомии у этого вида животных соотвутствуют I - 1,5 ч у крысы,
НеСКОЛЬКО ИНОЙ ПОДХОД бЫЛ ИСПОЛЬЗОВаН В работе (Briane et ai., 1978). Хроматин фракционировали на так называемый "гете-рохроматин", что соответствует понятию конденсированного хроматина, и "эухроматин" - аналог деконденсированного хроматина. На регенерирующей печени крыс авторы обнаружили два максимума "эухроматинизации" через 6 и 16 - 20 ч после операции.
Один из возможных молекулярных механизмов, определяющих степень конденсации хроматина и его декодценсацию, может быть связан с изменением сродства ДНК и гистонов в результате химической модификации последних. Гистоны могут подвергаться ацети-лированию, метилированию, фосфорилированию и тиолированию по различным аминокислотным остаткам» На различных биологических системах показано, что в отсутствии активной модификации гистонов активность транскрипционных процессов в клетках находится на низком уровне Uiifrey, 1969).
Важную роль в процессах конденсации и деконденсации хроматина и соответственно в регуляции транскрипции ДНК может играть процесс метилирования последней (Ванюшин, 1968, 1974).
В первый час после частичной гепатэктомии у крыс ацетилиро-вание аргинин-богатой фракции ядерных гистонов почти удваивается, а скорость деацилйрования существенно снижается. Ско-рость снижения содержания предварительно введенного иН-ацетата варьирует на раЗНЫХ СТаДИЯХ регенерации (Allfrey,I969, 1969а, 1970).
Необходимо отметить, что количество гистонов в ядре на ранней стадии регенерации не меняется, так как их биосинтез координирован С началом реПЛИКацИИ ДНК (НпШса, 1967; Takai et ai., 1968; Tidweii et ai., 1968). Ацетилирование богатых аргинином гистонов достигает максимума через 3 - 4 ч после операции, затем резко снижается, что связано, вероятно, с вовлечением в реакцию Э-амино групп лизиновых остатков гистонов Н2а и НЗ. Таким образом, ацетилирование богатых лизином гистонов совпадает по времени с деконденсацией хроматина и предшествует началу биосинтеза РНК,
Ацетилирование богатых лизином гистонов мало меняется в первые 16 Ч регенерации (Allfrey, 1969а, 1970). фосфорИЛИрОВаНИе
гистона HI увеличивается, начиная с 16 ч после операции,с максимумом через 22 Ч (Hnilica, 1967; Ord, Stocken, 1968; Pawsє et ai., 1969). Метилирование гистонов в основном за счёт Э-амино групп остатков лизина в богатых аргинином гистонах начинается после окончания G2 азы первого клеточного цикла и связано, вероятно, с конденсацией хроматина и снижением биосинтеза нуклеиновых КИСЛОТ (Tidwell et al., 1968).
Хроматин содержит также негистояовые (кислые) белки, которые также фосфорилируются и часто комплексируются с РНК. Их образование многократно увеличивается на ранних стадиях регенерации, достигая максимума через 3 - 5 ч, с последующим постепенным Снижением UAllfrey, 1969а; Pogo et al., 1968). ОДНЭКО описан белок негистоновой природа, характерный для покоящейся печени, содержание которого в регенерирующей печени резко снижено (Catino et al., 1978).
Изменение структуры и некоторых свойств хроматина
Как уже отмечалось ранее, РНК-полимераза функционирует в составе сложного комплекса, состоящего из ДНК, гистоновых и неги-стоновых белков, и РНК. Изменение структуры и свойств каждого из этих компонентов хроматина может сказываться на активности и каталитических свойствах РНК-полимеразы. В настоящее время мы не знаем, как осуществляется тонкая регуляция активности отдельных генов и генома в целом, и в настоящем обзоре не будем рассматривать многочисленные схемы структурной организации хроматина, так как это вряд ли приблизит нас к пониманию процессов активации генома в регенерирующей печени. В интересующем нас плане имеющиеся в литературе сведения можно сгруппировать следующим образом: а) данные, полученные in situ с применением цитохимических и электронно-микроскопических методов и б) результаты, полученные после фракционирования хроматина и изучения отдельных его компонентов.
При изучении связывания интеркалирующего красителя акридинового оранжевого со срезами печени с последующей цитофотометрией или цитофлюорометрией обнаружено существенное возрастание связывания красителя в первые 3 ч после частичной гепатэктомии и
ПОСЛеДуЮЩИМ СНИЖеНИеМ ЭТОЙ СПОСОбНОСТИ (Kushch et al., 1974, 1978; Alvarez, 1974; Кущ и др., 1975, 1976). Время максимального связывания с красителем варьировало в различных экспериментах в связи с использованием разных видов животных (у морских свинок оно составляло 2,5 ч, у мышей - 1,5 ч и у крыс с 30 % гепатэктомией - 3 ч). Для крыс, у которых удалено 68 % ткани печени, максимальное связывание акридинового оранжевого должно составлять I - 1,5 ч после операции. Увеличение связывания акридинового оранжевого вообще характерно для активированных К Пролиферации КЛеТОК (Darziekevish et al., 1969) И отражает число фосфатных групп ДНК, доступных для реакции с лигандом (Rigier, 1966). Таким образом, увеличение связывания акридинового оранжевого с ядрами печени в первые часы после частичной гепатэктомии отражает процесс декондеясации хроматина, предшествующий началу синтеза РНК. Параллельно с увеличением связывания акридинового оранжевого возрастает и связывание актиномици-на Д, что также обусловлено повышением доступности ДНК (Кущ и др., 1976). Работами перечисленных выше авторов (в основном группы А.В. Зеленина) установлены и другие ранние изменения свойств хроматина, свидетельствугощие о его декондеясации в первые часы после частичной гепатэктомии: возрастание доступности ДНК к нуклеазам и РНК-полимеразе, снижение устойчивости к действию температурной и кислотной денатурации и другие. Важно ещё раз подчеркнуть, что эти изменения не совпадают с периодом максимальной активноститРНК-полимеразы и биосинтеза РНК, а предшествуют им.
Эта же группа провела электронно-микроскопический анализ хроматина ядер морских свинок в первые часы после частичной гепатэктомии (Мантейфель и др., 1977; Ершов и др., 1979). Оценивая площадь, занимаемую конденсированным хроматином и количество перихроматиновых РШ-фибрилл, авторы установили, что через 2,5 ч после операции площадь конденсированного хроматина снижается, а количество РШ-фибрилл увеличивается. Эти показатели приходят к контрольному уровню через 5 ч после операции. Через 9 ч после частичной гепатэктомии хроматин снова деконденсируется, а количество перихроматиновых РШ-фибрилл вновь увеличивается. Параллельно с увеличением РШ-фибрилл меняется связывание другого интеркалирующего красителя - бромистого этидия. Ещё раз необходимо отметить, что скорость регенераторного процесса у морской свинки замедлена по сравнению с крысой, и 2,5 ч после частичной гепатэктомии у этого вида животных соотвутствуют I - 1,5 ч у крысы,
НеСКОЛЬКО ИНОЙ ПОДХОД бЫЛ ИСПОЛЬЗОВаН В работе (Briane et ai., 1978). Хроматин фракционировали на так называемый "гете-рохроматин", что соответствует понятию конденсированного хроматина, и "эухроматин" - аналог деконденсированного хроматина. На регенерирующей печени крыс авторы обнаружили два максимума "эухроматинизации" через 6 и 16 - 20 ч после операции.
Один из возможных молекулярных механизмов, определяющих степень конденсации хроматина и его декодценсацию, может быть связан с изменением сродства ДНК и гистонов в результате химической модификации последних. Гистоны могут подвергаться ацети-лированию, метилированию, фосфорилированию и тиолированию по различным аминокислотным остаткам» На различных биологических системах показано, что в отсутствии активной модификации гистонов активность транскрипционных процессов в клетках находится на низком уровне Uiifrey, 1969).
Важную роль в процессах конденсации и деконденсации хроматина и соответственно в регуляции транскрипции ДНК может играть процесс метилирования последней (Ванюшин, 1968, 1974).
В первый час после частичной гепатэктомии у крыс ацетилиро-вание аргинин-богатой фракции ядерных гистонов почти удваивается, а скорость деацилйрования существенно снижается. Ско-рость снижения содержания предварительно введенного иН-ацетата варьирует на раЗНЫХ СТаДИЯХ регенерации (Allfrey,I969, 1969а, 1970).
Необходимо отметить, что количество гистонов в ядре на ранней стадии регенерации не меняется, так как их биосинтез координирован С началом реПЛИКацИИ ДНК (НпШса, 1967; Takai et ai., 1968; Tidweii et ai., 1968). Ацетилирование богатых аргинином гистонов достигает максимума через 3 - 4 ч после операции, затем резко снижается, что связано, вероятно, с вовлечением в реакцию Э-амино групп лизиновых остатков гистонов Н2а и НЗ. Таким образом, ацетилирование богатых лизином гистонов совпадает по времени с деконденсацией хроматина и предшествует началу биосинтеза РНК,
Ацетилирование богатых лизином гистонов мало меняется в первые 16 Ч регенерации (Allfrey, 1969а, 1970). фосфорИЛИрОВаНИе гистона HI увеличивается, начиная с 16 ч после операции,с максимумом через 22 Ч (Hnilica, 1967; Ord, Stocken, 1968; Pawsє et ai., 1969). Метилирование гистонов в основном за счёт Э-амино групп остатков лизина в богатых аргинином гистонах начинается после окончания G2 азы первого клеточного цикла и связано, вероятно, с конденсацией хроматина и снижением биосинтеза нуклеиновых КИСЛОТ (Tidwell et al., 1968).
Хроматин содержит также негистояовые (кислые) белки, которые также фосфорилируются и часто комплексируются с РНК. Их образование многократно увеличивается на ранних стадиях регенерации, достигая максимума через 3 - 5 ч, с последующим постепенным Снижением UAllfrey, 1969а; Pogo et al., 1968). ОДНЭКО описан белок негистоновой природа, характерный для покоящейся печени, содержание которого в регенерирующей печени резко снижено (Catino et al., 1978).
Влияние ингибитора митохоядриальной трансляции хлор-амфеникола на ранний подъем биосинтеза ядерной РНК
Удельная радиоактивность ядерной и цитоплазматической РНК после 30-ти минутной метки 2- С-оротовой кислотой представлена на рисунке I.
Из рисунка I видно, что сразу после операции отмечается некоторый спад удельной радиоактивности ядерной РНК, который сменяется подъемом, достигающим максимума через 1,5 ч после частичной гепатэктомии. После некоторого снижения удельной радиоактивности через 2 ч после операции отмечается подъем удельной радиоактивности ядерной РНК, соответствующий достаточно хорошо описанному в литературе. Сопоставляя изменение удельной радиоактивности ядерной и цитоплазматической РНК, можно заключить, что изменение удельной радиоактивности ядерной РНК не сопровождается соответствующими изменениями цитоплазматической РНК. С определенными оговорками это означает, что изменения биосинтеза ядерной РНК происходят только в ядре и не затрагивают цитоплазмати-ческую РНК. Иными словами, изменение биосинтеза ядерных РНК через 1,5 ч после частичной гепатэктомии, вероятно, не сопровождается их транспортом в цитоплазму.
Мы исследовали влияние хлорамфе школа на обнаруженный нами подъем биосинтеза ядерной РНК через 1,5 ч после частичной гепатэктомии. Полученные данные представлены на рисунке 2. Хлорамфе-никол в концентрации 15 мг/ЮО г веса животного, введенный до операции, полностью блокирует увеличение удельной радиоактивности ядерной РНК.
Учитывая строгую специфичность действия хлорамфеникола на рибосомы митохондрий, можно выдвинуть два предположения о возможном механизме его блокирующего действия на биосинтез ядерной PHK.I) После операции в митохондриях транслируется белковый фактор, который активирует ядерную РНК-полимеразу; ингибирование митохондриальной трансляции предотвращает подъём биосинтеза ядерной РНК. 2) Блокирование биосинтеза некоторых митохондриаль-ных белков - звеньев дыхательной цепи - приводит к снижению окислительного фосфорилирования и, как результат этого, к недостаточности энергии для биосинтеза ядерной РЖ. Однако только незначительная часть белков дыхательной цепи кодируется митохон-дриальным геномом, а период полужизни функционирующих в мембране митохондрий белков превышает 1,5 ч.
Для уточнения механизма действия хлорамфеникола, а также для выяснения природы РНК, синтезированной через 1,5 ч после частичной гепатэктомии, была поставлена серия экспериментов с фракционированием ядерной РНК в градиенте плотности сахарозы. Результаты этой серии суммированы на рисунке 3.
При 30 мин экспозиции меченой оротовой кислоты ядерная РНК из печени контрольных животных распределяется двумя пиками радиоактивности в зонах 35 и 4s. При этой же экспозиции с меченым предшественником через 1,5 ч после частичной гепатэктомии отмечается, во-первых, значительное увеличение удельной радиоактивности РНК, во-вторых, появление дискретных пиков в зонах 28, 18 и 10 -12 s. Через 1,5 ч после операции низкие дозы актиномицина Д, которые, как известно, эффективно блокируют синтез рибосомальных
РНК и практически не затрагивают синтез ДНК-подобных РНК, полностью подавляют включение меченого оротата в 35, 28, 18s РНК. Это свидетельствует о том, что синтезируемая через 1,5 ч после частичной гепатэктомии РНК представляет собой в основном рибосо-мальную РНК. Актияомицин Д в этих дозах (23 мкг на крысу) не влияет на включение метки в РНК седиментирующую в зоне 4 - I2s.
Предварительное введение хлорамфеникола контрольным животным приводит к снижению общей и удельной радиоактивности ядерной РНК на 25 % (табл. I), не меняя профиль радиоактивности РНК. Что же касается гепатэктомированных животных, то предварительное введение хлорамфеникола приводит к полному исчезновению включения метки в 18 и 28s РНК и к значительному снижению удельной радиоактивности РНК, которая приближается к контрольному уровню. Снижение удельной радиоактивности ядерной РБК полностью коррелирует с данными, представленными на рисунке 2. Как явствует из таблицы I, хлорамфеникол снижает общую и удельную радиоактивность РНК на 47,5 %.
Суммирование полученных результатов позволяет сделать следующие выводы:
1) Через 1,5 ч после частичной гепатэктомии значительно увеличивается биосинтез 28 и I8S РНК.
2) В печени контрольных животных хлорамфеникол снижает удельную радиоактивность ядерной РЖ на 25 %.
3) Предварительное введение хлорамфеникола приводит к снижению удельной радиоактивности ядерной РЖ через 1,5 ч после операций почти на половину.
4) Хлорамфеникол полностью блокирует наблюдаемое при регенерации включение метки в 28 и I8s РЕК.
Изучение сложности ядерной РНК, транскрибируемой с различных последовательностей ДНК
Изучение транскрибируемости повторяющихся последовательностей ДНК методом гибридизации затрудняется параллельно идущей реассо-циацией. Предложенные для исключения реассоциации методы иммобилизации ДНК дают лишь грубую качественную оценку гомологичяости ДНК и РНК. Получение количественных характеристик стало возмож ым благодаря разработанному недавно методу гибридизации в присутствии ВЫСОКИХ Концентрации денатурируЩЙХ агентов (Casey, Davidson, 1977; Vogelstein, Gillespie, 1977). Он ОСНОВЭН на увеличении в этих условиях различия термостабильности ДНК - РНК гибридов и ДНК - ДНК дуплексов, что было показано на нуклеиновых кислотах прокариот. Отличительные особенности нуклеиновых кислот эукараот, заключающиеся в наличии повторяющихся последовательностей ДНК, шпилек в ДНК и РНК, вынудили нас дополнительно исследовать физико-химические характеристики и реакционноспособность ДНК и РНК крысы в растворах такого денатурирующего агента как формамид.
Для того чтобы реакция гибридизации в растворе протекала в отсутствие реассоциации, необходимо, чтобы условия инкубации были благоприятны для образования гибридов ДНК - РНК, но не для дуплексов ДНК - ДНК и РНК - РНК. Возможность этого для нуклеиновых кислот крысы демонстрируют опыты по влиянию формамида на их термостабильность. Из рис. 33а и d следует, что снижение температуры плавления (Тдд) двуспиральных структур РНК, ДНК и РНК -ДНК при повышении концентрации формамида на I % составляет соответственно 0,9, 0,6 и 0,4 С. Поскольку оптимальные температуры реакций реассоциации и гибридизации изменяются в той же мере, что и Тдд соответствующих комплексов, то при достаточно болыпихх концентрациях формамида области протекания реакций не перекрываются (рис. 34). Видно, что в растворе 2 х ssc - 80 % формамида реассоциация даже наиболее ГЦ-богатых часто повторяющихся последовательностей ДНК не происходит при температуре выше 44 С. Следовательно, она не происходит и для остальных фракций ДНК. В том же растворе реакция гибридизации уникальных последовательностей, составляющих основную часть генома крысы, имеет оптимум при 43 - 44 С. Учитывая это, а также средний нуклеотидный со став ДНК крысы, для проведения гибридизационных экспериментов были выбраны условия 48 С, 2 х ssc - 80 % формамид.
Вследствие высокой вязкости формамида скорость реакции в этих условиях примерно на порядок ниже, чем в стандартных 2 х
X SSC, 60 С (Casey, Davidson, І977).ОДШКО В ПРИСУТСТВИИ форм амида молекулы РНК и ДНК реагируют столь же полно, как и в водных растворах, а высокая растворимость ДНК в формамиде и замедление деградации РНК и ДНК (Hutton, 1977) позволяют достичь высоких уровней гибридизации.
Важным достоинством проведения гибридизации в формамидной системе является значительное упрощение её математического описания. В отсутствии реассоциации, при большом избытке одного из компонентов, гибридизация является реакцией псевдо-первого порядка (Bishop, 1972):
H = 1 — е о
где н - степень гибридизации следового компонента, к - константа скорости гибридизации, со - концентрация избыточного компонента, t - время. Если избыточный компонент гетерогенен по числу копий последовательностей, то приведенное уравнение следует суммировать по семействам повторов (в случае ДНК),либо по классам транскриптов (в случае РНК). Тогда :
н = 1 - 2Xe KiCot і = 1,2...
где мі и к± - соответственно доля в общей массе и константа скорости гибридизации для каждого семейства либо класса избыточного компонента.
При помощи последнего уравнения анализ кинетических данных ЧИСЛеннымИ методами На ЭВМ (Krieg et al., 1979; Grady et al., 1979) позволяет получить ценную инфорлацию даже при гибридизации тотальных препаратов эукариотических нуклеиновых кислот. Однако наиболее прямым методом изучения транскрибируемости различных семейств последовательностей ДНК является гибридизация их чистых фракций. Для частых повторов это возможно лишь в отсутствии реассоциации, быстро снижающей их реакционноспособность. Благодаря применению формамидной методики гибридизации при избытке РНК была изучена экспрессия фракций повторяющихся и уникальных последовательностей в нормальной и регенерирующей печени. Данные по гибридизации с больштл избытком РНК представлены в таблице II. Изучение транскрибируемости повторяющихся последовательностей ДНК методом гибридизации затрудняется параллельно идущей реассо-циацией. Предложенные для исключения реассоциации методы иммобилизации ДНК дают лишь грубую качественную оценку гомологичяости ДНК и РНК. Получение количественных характеристик стало возможным благодаря разработанному недавно методу гибридизации в присутствии ВЫСОКИХ Концентрации денатурируЩЙХ агентов (Casey, Davidson, 1977; Vogelstein, Gillespie, 1977). Он ОСНОВЭН на увеличении в этих условиях различия термостабильности ДНК - РНК гибридов и ДНК - ДНК дуплексов, что было показано на нуклеиновых кислотах прокариот. Отличительные особенности нуклеиновых кислот эукараот, заключающиеся в наличии повторяющихся последовательностей ДНК, шпилек в ДНК и РНК, вынудили нас дополнительно исследовать физико-химические характеристики и реакционноспособность ДНК и РНК крысы в растворах такого денатурирующего агента как формамид.
Для того чтобы реакция гибридизации в растворе протекала в отсутствие реассоциации, необходимо, чтобы условия инкубации были благоприятны для образования гибридов ДНК - РНК, но не для дуплексов ДНК - ДНК и РНК - РНК. Возможность этого для нуклеиновых кислот крысы демонстрируют опыты по влиянию формамида на их термостабильность. Из рис. 33а и d следует, что снижение температуры плавления (Тдд) двуспиральных структур РНК, ДНК и РНК -ДНК при повышении концентрации формамида на I % составляет соответственно 0,9, 0,6 и 0,4 С. Поскольку оптимальные температуры реакций реассоциации и гибридизации изменяются в той же мере, что и Тдд соответствующих комплексов, то при достаточно болыпихх концентрациях формамида области протекания реакций не перекрываются (рис. 34). Видно, что в растворе 2 х ssc - 80 % формамида реассоциация даже наиболее ГЦ-богатых часто повторяющихся последовательностей ДНК не происходит при температуре выше 44 С. Следовательно, она не происходит и для остальных фракций ДНК. В том же растворе реакция гибридизации уникальных последовательностей, составляющих основную часть генома крысы, имеет оптимум при 43 - 44 С. Учитывая это, а также средний нуклеотидный со став ДНК крысы, для проведения гибридизационных экспериментов были выбраны условия 48 С, 2 х ssc - 80 % формамид.
