Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Рибосомы и рибосомные гены 7
2. Биосинтез вителлогенина 20
3. Эстрогениндуцированный вителлогенез как модель для изучения экспрессии генов 30
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Материалы и методы 39
2. Определение рибонуклеазной активности в печени цыплят 60
3. динамика ответа печени цыплят на однократное введение эстрадиола и влияние дозы гормона 69
4. Фракционный состав белков плазмы крови цыплят после введения эстрадиола 81
5. Действие оС-аманитина, актиномицина Д, 5-бром-дезоксиуридина и тиоацетамида на эстрогениндуцированный вителлогенез у цыплят 89
6. Динамика ответа печени цыплят на однократное и повторное введение эстрадиола 99
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПО
ВЫВОДЫ 135
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЦЩЮЖЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 137
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 138
- Рибосомы и рибосомные гены
- Биосинтез вителлогенина
- Определение рибонуклеазной активности в печени цыплят
Рибосомы и рибосомные гены
Рибосомы являются органеллами, которые присутствуют во всех живых клетках и играют ключевую роль в синтезе белка. Впервые рибосомы наблюдались в цитоплазме и на поверхности мембран эндоплаз-матической сети. Впоследствии, в опытах с бесклеточными системами синтеза белка было показано, что эти рибонуклеопротеидные частицы являются местом включения меченых аминокислот.
Каждая рибосома состоит из двух субъединиц: большей и меньшей. Структурной основой каждой субъединицы является молекула(мо-лекулы) РНК, "покрытая" различными белковыми молекулами. В природе имеется два основных класса рибосом: рибосомы с константой седиментации 70 у прокариотов и рибосомы с константой седиментации 805 у эукариотов. Между ними имеются значительные различия, причем как в рибосомных РЖ, так и в белковой компоненте. 70S рибосомы прокариотов имеют массу примерно 2,8-10 дальтон; рибосомы эу-кариотов крупнее, масса их 4,0е10 дальтон. Рибосомы прокариотов состоят из частиц с константами седиментации 30S и 503; у эукариотов соответственно 405 и 60S. Меньшая частица рибосом прокариотов состоит из одной молекулы РЖ с константой седиментации 16 s , массой 0,6 ЛГ дальтон, длиной в 1600 нуклеотидов и 21 молекулы белка. Большая частица рибосом прокариотов содержит две молекулы РЖ: 236 и 5S, длиной в 3200 и 120 нуклеотидов и 34 молекулы белка. У эукариотов меньшая рибосомная частица имеет в составе также одну молекулу РЖ с константой седиментации 17-185, длиной примерно 2000 нуклеотидов и 30 молекул белка. Большая рибосомная частица эукариотов состоит из трех молекул РЖ: 26-285, 5,8S и 55, длиной в 4000-5000, 158 и 120 нуклеотидов соответственно и 40 молекул белка. Рибосомы эукариотов в среднем содержат равные количества РНК и белка, у прокариотов содержание РБК составляет примерно 65$. Для клеток печени высших эукариотов характерно следующее распределение РНК: около 11$ приходится на ядро (в основном это мРНК), около 15$ на митохондрии (рРНК и тРНК), свыше 50$ на цитоплазма-тические рибосомы (в основном рРНК) и около 24$ на цитозоль (в основном тРНК) (14, 29, 83, 129).
На структурном уровне между рибосомами прокариотических и эу-кариотических микроорганизмов существует гораздо больше отличий, чем между рибосомами сильно дивергировавшихся в ходе эволюции эукариотов. В чем причина этих отличий и почему они закрепились в ходе эволюции не известно, так как молекулярные механизмы синтеза белка у прокариотов и эукариотов практически одинаковы. Примечательно, что размер меньшей субъединицы рибосом эукариотов (0,7 Ю6) остается практически постоянным в эволюции, а РНК большей частицы варьирует в небольших пределах, от 1,3 10 у дрожжей и растений до 1,7 10 у млекопитающих (24, 29, 83). Таким образом, рибосомы представляют собой исключительно сложные образования для изучения их химического строения и пространственного расположения отдельных элементов структуры. Сложность заключается и в том, что для электронного микроскопа они малы, а для другого традиционного метода исследования структуры микрообъектов - рентгеновского рассеяния, - слишком велики и сложны, и пока не удавалось искусственно получить кристаллы рибосом. Когда впервые было выяснено, что рибосомы играют важную роль в синтезе белка, предполагалось, что рибосомная РЖ служит матрицей. Но только в I960 году было однозначно показано, что рибосомная РНК матричными свойствами не обладает. Матричную функцию выполняет особая РНК (мРНК), на долю которой приходится не более нескольких процентов от общего содержания РНК в клетке (29) Все молекулы рРНК представляют собой цепи с неодинаковым числом оснований способных спариваться друг с другом, образуя двухцепоцечные шпильки. В частности, для большей рибосомной РНК (28S рРНК) точно установлено наличие нескольких последовательностей в 100-500 нуклеотидов, содержащих до 78$ гуа-нина(Г) + цитозина(Ц) и образующих характерные двухцепочечные петли (84). Эти богатые Г+Ц участки представляются более поздним приобретением эволюции, поскольку они лучше выраженн в рРНК животных (83).
Биосинтез вителлогенина
Местом синтеза большинства желточных белков у яйцекладущих позвоночных является печень. Белки желтка в основном происходят из вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности (ІОНИ), синтез которых начинается в печени самок по достижении ими репродуктивного, периода. Лучше всего изучен вителлогенез у африканской шпорцевой лягушки ксенопуса и кур.
С наступлением яйценоскости печень курицы приобретает новую функцию (репродуктивную) без утраты предсуществутащих. Эта дальнейшая дифференцировка уже специализированной ткани находится под контролем эстрогенов. Синтез вителлогенина может быть вызван также у самцов и неполовозрелых животных введением им эстрадиола. Этот феномен позволяет изучать гормон-индуцированную экспрессию до этого"молчащих" генов. Действие эстрадиола на печень, приводящее к включению определенных генов, происходит по охарактеризованной в общих чертах схеме, отдельные детали которой, впрочем, остаются неизученными. Сущность этой схемы заключается в том, что эстрадиол в комплексе с рецептором переносится на хроматин, где он и действует на генном уровне. Возможно, перенос из цитоплазмы в ядро сопровождается модификацией цитоплазматического рецептора или заменой его на ядерный рецептор. Все полученные до сих пор результаты говорят о том, что главная регуляция экспрессии вителлогенинового гена происходит на уровне транскрипции.
Бителлогенин, характеристика и биологическая роль
Желточные белки куриного яйца фосвитин и липовителлин синтезируются в печени кур в виде одного общего предшественника, вителлогенина (39, 69). В крови вителлогенин содержится в виде димера с молекулярной массой 450000-500000 дальтон (193). Вителлогенин представляет собой гликофосфопротеид, фосфатные группы которого расположены в основном на фосвитиновой части молекулы. Вителлогенин содержит 2,2$ фосфора (68). Кроме того молекула вителлогенина связана с липидами. Таким образом, вителлогенин представляет собой липогликофосфопротеид,и эта его особенность затрудняет точное определение молекулярной массы вителлогенинового мономера, поэтому имеется некоторое расхождение в данных, полученных ведущими группами ученых, изучающих вителлогенин: 200000 дальтон (65) и 240000(94, 103, 104). Фосвитины представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой 32000-35000 дальтон, содержащие 55$ серина. Около 30$ молекулярной массы фосвитина представлено фосфатными группаїли. Он содержит 80$ вителлогенинового фосфора и совсем не содержит лейцина (56). Липовителлины представляют собой липогликопротеиды с молекулярной массой от 30000 до 135000 дальтон. Так Алпиповителлин состоит из трех полипептидов с молекулярными массами 40000, 105000 и 135000, а липовителлин из двух -30000 и 135000 дальтон (69). Липовителлин и фосвитин происходят из вителлогенина, который транспортируется кровью из печени, где он синтезируется, в яичник и захватывается там растущими ооцитами, в которых эта длинная молекула специфически расщешшется (52, 123). Расщепление вителлогенина в яичнике стимулируется низкими дозами трипсина. По-видимому, участки специфической "нарезки" вителлогенина столь доступны действию протеаз, что расщепление происходит преимущественно по ним. Однако нарезка трипсином не столь специфична, как энзимами яичника « Шо , так как кроме специфических связей атаке подвергаются и прочие пептидные связи (79).
Определение рибонуклеазной активности в печени цыплят
В одну из задач нашего исследования входило изучение динамики активности рибонуклеаз печени цыплят после эстрогенизации, а также при воздействии некоторых химических агентов. С этой целью нами была проведена работа по подбору ряда условий определения рибонуклеазной активности в гомогенатах печени цыплят.
В основе методов определения активности ферментов лежит проведение реакции между препаратом фермента и его субстратом в стандартных условиях, по возможности приближенным к оптимальным. Об активности фермента обычно судят по скорости появления продуктов реакции, так как определение убыли субстрата обычно крайне затруднительно на фоне его высоких насыщающих концентраций в среде инкубации. Для определения активности рибонуклеаз в различных биологических субстанциях обычно инкубируют аликвоту, содержащую фермент с препаратом РНК. О скорости реакции судят по концентрации моно- и олигонуклеотидов, до которых расщепляется РНК под действием ферментов (32). Если в реакции используется меченая радиоактивным изотопом РНК, то концентрацию нуклеотидов определяют в-счетчиках радиоактивности. Если РНК не меченая, то концентрацию продуктов реакции оценивают фотометрированием при 260 нм. В обоих случаях непременным условием является наиболее полное отделение продуктов расщепления (нуклеотидов) от недеградированной РНК. Для этого обычно используют осаждение РЖ кислотами - хлорной и три-хлоруксусной. Спектрофотометрическое определение накладывает дополнительное ограничение: используемый осадитель и прочие компоненты не должны обладать значительным поглощением в ультрафиолете.
Нами была проведена сравнительная оценка эффективности ряда осадителей. В работе использовалась несколько раз переосажденная этанолом коммерческая дрожжевая РНК. К 400 мкл 0,3% раствора РНК добавляли 4000 мкл осадителя, выдерживали при 00 15 минут и центрифугировали при 25000/15 минут. Определение проводили в 5 параллелях. Супернатанты и чистый осадитель фотометрировали при 260 нм против воды. Полученные оптические плотности приведены в таблице I.
Похожие диссертации на Биогенез рибосом и экспрессия вителлогенинового гена в печени цыплят
