Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
ГЛАВА I. ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛЖОЗИДЫ - БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА МЕМБРАНОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ
1. Химическое строение, распространение и свойства тритерпенових гликозидов .... 8
2. Применение тритерпенових гликозидов в фармакологии и медицине 13
3. Мембранотропная активность тритерпенових гликозидов 15
ГЛАВА II. РОЛЬ СТЕРИНОВ В МЕМБРАНАХ 30
1. Структурно-функциональные свойства мембранных стеринов 30
2. Влияние стеринов на мембранную проницаемость 34
3. Стерины как "рецепторы" биологически
активных веществ 35
ЧАСТЬ III. СОБСТВЕННЫЕ ЭКСПЕРШЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
ГЛАВА ІV. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ТРИТЕШЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ 61
ГЛАВА V. ДЕЙСТВИЕ ТРИТЕРПЕНОБЫХ ГЛИКОЗИДОВ НА МЕМБРАННУЮ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ 71
1. Взаимосвязь меаду связыванием тритерпенових гликозидов с клетками и изменением проницаемости . . 71
2. Действие тритерпенових гликозидов на мембранную проницаемость для УФ поглощающих веществ
и их метаболизм 73
3. Влияние условий инкубирования на мембранную проницаемость, индуцированную тритерпеновими гликозидами 77
4. Особенности проницаемости мембран эритроцитов в присутствии тритерпенових гликозидов .... 84
5. Сравнительное изучение мембранотропной активности тритерпенових гликозидов и полиеновых антибиотиков '. . 88
ГЛАВА VІ. ВЛИЯНИЕ ЛИІЩОВ И СТЕРИНОВ НА АКТИВНОСТЬ ТРИТЕРПЕНОВИХ ГЛИКОЗИДОВ . . .' 94
1. Сродство липидов и стеринов к тритерпеновим гликозидам 94
2. Изменение чувствительности опухолевых клеток к действию тритерпенових гликозидов с помощью липосом 98
3. Влияние тритерпенових гликозидов на стабильность лилидннх и липид-стериновых мембран. . . 103
ГЛАВА VII. ДЕЙСТВИЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ НА БИСЛОЙНЫЕ ЛИПИДНЫЕ МЕМБРАНЫ (БЛМ) И ЛИПОСОМЫ 109
1. Связывание тритерпенових гликозидов с липосомами. 109
2. Действие тритерпенових гликозидов на проницаемость липосом. .................. ИЗ
3. Действие тритерпенових гликозидов на ионную проводимость бислойных липидных мембран .... 118
4. Особенности дискретной проводимости БЛМ, модифицированных голотурином А 122
5. Особенности дискретной проводимости БЛМ в присутствии каулозида С 132
6. О резистентности мембран, содержащих стерины трепанга и их метаболиты, к действию стихопозида А 137
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 144
ВЫВОДЫ 155
ЛИТЕРАТУРА 157
ПРИЛОЖЕНИЕ 183
- Химическое строение, распространение и свойства тритерпенових гликозидов
- Структурно-функциональные свойства мембранных стеринов
- СОБСТВЕННЫЕ ЭКСПЕРШЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ТРИТЕШЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ
- Взаимосвязь меаду связыванием тритерпенових гликозидов с клетками и изменением проницаемости
Введение к работе
Основным источником лекарств является растительный и животный мир нашей планеты. В настоящее время лекарственные вещества природного происхождения занимают около половины всех используемых в медицинских целях препаратов и их доля в последнее десятилетие имеет тенденцию к постоянному увеличению. В связи с этим поиск лекарственных средств растительного и животного происхождения и изучение механизма их действия представляют собой одну из важнейших задач современной науки.
Тритерпеновые гликозиды, выделенные из растений и морских беспозвоночных класса Holothuroidea составляют многочисленную группу лекарственных веществ /3, 56, 192 /. Широко известны препараты женьшеня, аралии маньжурской, конского каштана, календулы, действующим началом которых являются тритерпеновые гликозиды / 25, 210 /. В последнее время описаны и химически охарактеризованы новые тритерпеновые гликозиды, обладающие широким спектром медико-биологической активности и процесс накопления фактического материала продолжается /26, 35, 43, 133, 138 /. Высока вероятность создания на их основе новых противоопухолевых и анти-фунгалышх препаратов /15, 49, 170 /. Рассматриваются возможности использования тритерпенових гликозидов в качестве специфических сорбентов холестерина при гемосорбции для лечения атеросклероза. Значительный интерес представляет и то, что эти гликозиды являются естественными факторами устойчивости растений к различным грибковым заболеваниям / 178 / и защиты голотурий от их естественных врагов / 67 /.
Имеются немногочисленные данные, касающиеся механизма действия тритерпенових гликозидов. Подобно полиеновым антибиотикам гликозиды образуют специфические комплексы со стеринами и действуют, главным образом, на стериносодержащие биологические и модельные мембраны /46, 82 /. Они вызывают общую перестройку структуры мембран / 191 / и нарушение избирательной проницаемости / 162 - 168 /. Эти факты легли в основу "стериновой гипотезы" механизма действия тритерпенових гликозидов / 107, 184 /. Тем не менее, из-за противоречивости имеющихся на настоящий момент данных / 65, 186 /, единство мнений,по многим основным вопросам, связанным с биологической активностью и механизмом действия этих соединений, у исследователей отсутствует и остается еще много нерешенных проблем.
В настоящее время слабо исследован спектр биологической активности большинства тритерпенових гликозидов. Важной проблемой остается установление взаимосвязи между структурой данных соединений и биологической активностью. До сих пор не изучен вопрос о механизме нарушения этими гликозидами барьерных свойств мембран. Остается не выясненным вопрос о роли структуры стерина в мембрано-тропной активности тритерпенових гликозидов.
Знание механизма мембранотропного действия тритерпенових гликозидов представляет большой теоретический и практический интерес, поскольку может служить основой для создания наиболее рациональных способов их применения в медицине и целенаправленного поиска наиболее активных препаратов. Кроме того, исследование механизма мембранотропной активности тритерпенових гликозидов имеет непосредственное отношение к информации о роли этих веществ в природе и о роли стеринов как "рецепторов" физиологически активных веществ в биологических мембранах /17, 89, 175 /.
Исходя из вышесказанного, цель работы состояла в изучении биологической активности и некоторых сторон механизма действия тритерпенових гликозидов на различные биологические и модельные мембраны. В задачу исследования входило:
Изучить спектр биологической активности некоторых тритерпенових гликозидов.
Исследовать влияние этих гликозидов на проницаемость биологических и модельных мембран.
Выяснить особенности взаимодействия исследуемых тритерпенових гликозидов с липидами, природными стеринами и их метаболитами.
Определить основные принципы и индивидуальные особенности действия тритерпенових гликозидов на модельные липидные и биологические мембраны.
Материалы исследований представлены в пяти главах. Первая из них включает описание материалов и методов исследования, вторая -- результаты изучения спектра биологической активности ряда тритерпеновых гликозидов, третья - посвящена изучению их действия на проницаемость биологических мембран, в четвертой - приведены данные о взаимодействии исследуемых тритерпеновых гликозидов с липидами и стеринами. Последняя глава включает результаты исследований, проводившихся на модельных мембранах.
Основные результаты исследований являются частью плановой работы, проводимой в лаборатории биоиспытаний (зав.лаб. - ст. н.с, к.б.н. Анисимов М.М.). Тихоокеанского института биорганиче-ской химии (ТИБОХ) ДВНЦ АН СССР. Отдельные фрагменты работы были выполнены на базе лаборатории ионного транспорта (зав.лаб.-профессор Антонов В.Ф.) ВДИЛ 2-го МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова (г.Москва) и лаборатории физической и коллоидной химии (зав.лаб.-ст.н.с., к.ф.м.н. Ровин Ю.Г.) института химии ДВНЦ АН СССР (г.Владивосток).
Химическое строение, распространение и свойства тритерпенових гликозидов
Тритерпеновые гликозиды состоят из агликона (генина) три-терпеновой природы и углеводной части. По строению агликона они могут относится к об - ( I ) или оС - амириновоиу ( П ), лупановоэду ( Ш ), гопановоаду (ІУ), даммарановолцу (У), ланоста-новому ( УІ ) и голостановому ( УП ) рядам /3, 25, 56, 201 /:В составе углеводной части найдены моносахариды: D -глюкоза, 3-0-метил- D -глюкоза, D -галактоза, D -ксилоза, D -хиновоза, L- арабиноза, L -рибоза, D -фуко-за, ь _ рамноза, ь -ликсоза и D -глюкуроновая кислота. При этом в сахарных цепях тритерпенових гликозидов могут находиться от I до II различных моносахаридов, отличающихся как способом связи с другими моносахирами, так и местом присоединения к агликону / 30 /. Помимо традиционного присоединения углеводной цепи в С-3 положении, у некоторых тритерпенових гликозидов возможны и другие варианты её расположения и даже одновременное присоединение двух углеводных цепей / 37, 201 /.
В настоящее время изучена структура около 200 тритерпенових гликозидов. Подавляющее большинство растительных тритерпенових гликозидов относится к д$-амириновому ряду /3, 23, 56, 75 /. Первое упоминание о наличии тритерпеновых гликозидов в голотуриях ( класс Holothuroidea ) относится к 1952 году, когда был выделен первый тритерпеновый гликозид животного происхождения - голотурии из Actinopyga agassizi / 158 /. Строение его было установлено Чанли с сотрудниками / 86 /. Дальнейшее сравнительное изучение химической структуры тритерпенових гликозидов голотурий Тихого, Индийского и Атлантического океанов показало, что каждому семейству свойственны определенные типы гликозидов /24, 26, 35, 43, 98, 137 /, относящиеся к голоста-новому ряду ( УП ).
Отдельные виды рода Holothuria и Actinopyga семейства истинных голотурий Holothuriidae содержат гликозиды типа голотуринов А и В, характерной особенностью которых является наличие, соответственно, четырех ( В -ксилоза, В -глюкоза, D -хиновоза и 3-0-метил- D -глюкоза) и двух ( в -ксилоза 10 -и D -хиновоза) моносахаридов и агликонов (1-5) с 12 аО -оксп-9 (II) -еновым фрагментом. Углеводная цепь содержит также суль-фогруппу /26, 35, 43 /.
Структурно-функциональные свойства мембранных стеринов
Понимание механизма мембранотропной активности тритерпенових гликозидов невозможно без исчерпывающих и глубоких знаний о структуре и функции стеринов в мембранах.
а) Структура стеринов и их расположение в мембране
Стерины весьма чувствительный компонент по отношению к функции мембран. В зависимости от вида мембраны содержание стеринов в ней колеблется от 2 до 25 % общего количества мембранных липидов /53, 94 /. Клеточные стерины располагаются, главным образом, в плазматических мембранах. В мембранах клеточных органелл стеринов содержится значительно меньше В структуре мембран животных клеток, в основном, со - ЗІ держится холестерин. Главными стеринами мембран растительных клеток являются стигмастерин и fS -ситостерин. Эргостерин является преимущественным стерином грибов и дрожжей. Бактериальные мембраны лишены стеринов / 94 /.
Для всех природных стеринов характерно наличие жесткого стероидного ядра с энергетически выгодным транс-сочленением составляющих его циклов; ОН-грушш, присоединённой к атому G-3 и гибкого углеводородного "хвоста", присоединённого в положении С-І7 / 28, 157 /. Боковые поверхности стероидного ядра были бы почти плоскими, если бы не ангулярные метильные группы, присоединённые к С-10 и С-ІЗ и делающие одну из сторон молекулы более выпуклой. Эта сторона обычно обозначается как J2 -, а противоположная ей - оО . Гидроксильная группа основных природных стеринов находится в Ъ В -положении, т.е. направлена в ту же сторону, что и ангулярные метильные группы / 119 /. Продольный размер молекулы холестерина был щенен для "сухих" мульти-бислоёв методом дифракции ренгеновских лучей / 112, 213 /. Период таких мультибислоев составляет 33,8 Ж , поэтому длина молекулы в направлении нормали к молекулярной плоскости должна составлять около 17 А , что достаточно хорошо совпадает с оценкой, сделанной с использованием молекулярных моделей. Энгельман и Ротман показали / 99. /, что Ъ в -ОН группа молекулы стерина находится на расстоянии около 17,5 А от центра бислоя, т.е. примерно там, где расположен глицериновый "остов" лецитина. При максимально плотной упаковке одна молекула холестерина полностью окружена семью углеводородными цепями при соотношении фосфолипид - холестерин равном 1,9 ( 34,5 мол.$ холестерина ) внесли существенные дополнения в модель, предложенную Энгельманом и Ротманом. Авторы рассматривают возможность димеризапии холестерина при его концентрации в ли пидном бислое выше 30 мол.%, что позволяет объяснить некоторые различия в свойствах бислоев при варьировании дозы холестерина в мембране / 53 /.
Собственные экспершентальные исследования глава ш. материалы и методы исследования
При изучении антидрожжевой активности тритерпенових глико-зидов в- качестве теста был использован музейный штамм дрожжей Sacchromyces carlsbergensis, полученный из Всесоюзного научно-исследовательского института пиво-безалкогольной промышленности (г.Москва).
Дрожжеподобные грибы Candida albicans, использованные для тестирования антифунгальной активности гликозидов, были выделены от больных с подозрением на кандидомикоз полости рта в бактериологической лаборатории (заведующая - врач-бактериолог Л.А.Логунова) Приморской краевой клинической больницы.
Музейные штаммы бактериальных культур Staphylococcus aureus, Escherichia coli, любезно предоставленные сотрудниками кафедры микробиологии (зав.кафедрой - д.м.н., профессор Н.С.Мотавкина) Владивостокского медицинского института, использовали для исследования антибактериальной активности гликозидов.
Для определения цитостатической активности тритерпенових гликозидов использовали развивающиеся эмбрионы морских ежей ylocentrotus intermedius Иylocentro.tus nudus. Морских ежей собирали на юге Приморского края в прибрежной зоне залива Посьет. мужские и женские гаметы получали путем инъекции в полость тела ежа 0,5 М раствора KCI. Оплодотворенные яйцеклетки получали в соответствии с методикой, описанной Бузнаковым и Подморевым / 20 /. Необходимо отметить достоинства морских ежей как модели для биологических испытаний - возможность получения больших партий гамет и синхронно развивающихся эмбрионов, простоту их инкубации в контролируемых условиях, легкость многих прижизненных наблюдений. Это привело к широкому использованию гамет и эмбрионов морских ежей для массового тестирования медицинских препаратов и определения цитостатической активности различных биологически активных веществ / 20, 176 /.
Цитотоксическое действие гликозидов изучали, используя в качестве тест-объектов суспензии опухолевых клеток саркомы 37 и карипиномы Эрлиха, музейные штаммы которых были получены из Всесоюзного онкологического центра (г.Москва).
Биологическая активность тритешеновых гликозидов
Из литературных данных известно / 15, 118 /, что тритерпе-новые гликозиды среди морских животных обнаружены только у морских огурцов класса Holothuroidea, относящиеся к типу иглокожие Echinodermata . Эти соединения обладают широким спектром медико-биологического действия / 158, 199 /, наибольший интерес из которого представляют антиопухолевая / 159, 170 / и антифун-гальная / 49, 193 / активности. В настоящее время описано более 900 видов голотурий, среди которых тритерпеновые гликозиды обнаружены приблизительно у 100 , а химико-биологические свойства изучены и того меньше / 15 /. Это указывает на необходимость поиска новых источников гликозидов и дальнейшего изучения их биомедицинских свойств.
Данные сравнительного изучения биологической активности различных типов гликозидов из более чем 20 видов голотурий приведены в табл. 1-3.
Как видно из табл. I, гликозиды типа бивитозидов / 137 /, изолированные из морских огурцов рода Bohadschia (семейство Holothuriidae ) имеют самую высокую активность. Эти соединения обладают ингибирующим действием в дозах от 1,5 до 3,1 мкт/мл в отношении роста дрожжей. Их действующие концентрации на суспензию опухолевых клеток несколько выше - от 6,2 до 25 мкг/мл.
Гликозиды, относящиеся к типу голотурина А (см. стр. 10 ), полученные из указанных в таблице видов, существенно отличаются по степени ингибирующего действия как на дрожжевые, так и на опухолевые клетки. Их эффективные концентрации варьируют от 1,5 до 100 мкг/мл. Следует отметить также разную активность
Взаимосвязь меаду связыванием тритерпенових гликозидов с клетками и изменением проницаемости
При исследовании антифунгальной активности тритерпенових гликозидов каулозида С, теасапонина и стихопозида А было определено / 47 /, что они локализуются на цитоплазматических мембранах клеток дрожжей и действуют в нативном виде, не претерпевая изменений в химической структуре. Однако, взаимоотношения между процессами связывания и изменения проницаемости мембран в присутствии тритерпенових гликозидов не изучались.
Как видно из рис. 2, кинетика связывания каулозида С, теасапонина, голотурина А и стихопозида А клетками дрожжей приблизительно одинакова и через I час достигает величины 30-40%. Тем не менее, по эффективности нарушения избирательной проницаемости данные гликозидн можно расположить в убывающий ряд: голотурии А, стихопозид А, каулозид С и теасапонин. Другими словами, для одинакового изменения проницаемости, к примеру, голотурина А требуется в несколько раз меньше, чем каулозида С и теасапонина. Результаты наших исследований согласуются с данными, полученными Троном / 198 /, который исследовал процесс гемолиза, индуцированный голотурином А, стероидным гликозидом дигитонином и двумя растительными тритерпеновыми гликозидами. По расчетам Трона, для одинакового гемолитического эффекта голотурина А в мембране требуется в 8 раз меньше, чем дигитонина и в 2 раза меньше, чем растительного гликозида из Quillaya.
Что лежит в основе наблюдаемой высокой эффективности действия голотурина А на мембрану? Изучение взаимодействия этого гликозида со стеринами в растворе (см. глава УІ-І) и эксперименты на модельных мембранах (см.глава ЛИ) в определенной мере помогают разобраться в этом вопросе.
