Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Протеогликаны 10
1.1.1. Строение и классификация гликозаминогликанов -. 10
1.1.2. Локализация и функции протеогликанов 14
1.1.3. Состав протеогликанов в трансформированных клетках 23
1.1.4. Биосинтез протеогликанов 26
1.2. D-глюкуронил С5-эпимераза 30
1.2.1. Субстратная специфичность D-глюкуронил С5-эпимеразы 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы 42
2.1. Материалы 42
2.2. Методы 45
2.2.1. Выделение РНК 45
2.2.2. Обратная транскрипция 45
2.2.3. Анализ экспрессии генов методом мультиплексной ОТ-ПЦР 46
2.2.4. Горизонтальный электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 46
2.2.5. Количественная ПЦР в реальном времени 47
2.2.6. Вестерн-блот анализ 47
2.2.7. Иммуногистохимия 48
2.2.8. Клонирование 49
2.2.9. Трансфекция и отбор клонов, стабильно экспрессирующих эпимеразу 49
2.2.10. Определение клеточной пролиферации in vitro 50
2.2.11. Определение влияния D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост экспериментальных опухолей in vivo 50
2.2.12. Статистическая обработка результатов 51
ГЛАВА 3. Результаты 52
3.1 . Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы 52
3.1.1. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека 52
3.1.2. Подбор условий ПЦР с различными праймерами для изучения экпрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы 53
3.1.3. Анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой тканях молочной железы человека методом мультиплексной ОТ-ПЦР 55
3.1.4. Анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой тканях молочной железы человека методом количественной ПЦР в реальном времени 57
3.1.5. Анализ экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в доброкачественных опухолях молочной железы методом мультиплексной ОТ-ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени 59
3.1.6. Определение присутствия белка D-глюкуронил С5-эпимеразы в тканях молочной железы человека методом Вестерн-блота 60
3.1.7. Анализ экспрессии гена D-глюкурнил С5-эпимеразы в злокачественных опухолях и гиперплазиях предстательной железы человека 62
3.2. Ген-инактивирующий тест (GIT - Gene Inactivaion Test) 63
3.2.1. Клонирование гена D-глюкуронил С5-эпимеразы 65
3.2.2. Влияние экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост стабильно трансфицированных клонов 67
3.2.3. Изучение влияния экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост экспериментальных опухолей in vivo 69
3.2.4. Анализ экспериментальных опухолей 71
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 75
Выводы: 78
Список литературы: 79
От автора 95
- Строение и классификация гликозаминогликанов
- Материалы
- . Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы
- Влияние экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост стабильно трансфицированных клонов
Введение к работе
В настоящее время открыто множество биологических молекул, которые участвуют в процессах злокачественной трансформации. К таким молекулам относятся и протеогликаны (ПГ) - сложные макромолекулы, состоящие из белкового кора и присоединённых к ним цепей гликозаминогликанов (ГАГ). Протеогликаны находятся на клеточной поверхности и во внеклеточном мат-риксе (ВКМ), выполняя разнообразные функции, в том числе связанные с участием в межклеточных взаимодействиях и во взаимодействиях клетки с ВКМ за счет связывания с различными компонентами ВКМ, включая факторы роста и их рецепторы (Ori et al., 2008; Lindahl et al., 2007, Santra et al., 2002). Изменения экспрессии или локализации этих молекул, так же как и ферментов, вовлеченных в их биосинтез и деградацию, ассоциированы с измениями пролиферативной активности клеток (Yip et al., 2006; Li et al., 2008), изменениями их подвижности (Gordon et al., 2008; Giordano et al., 2008) и ангиогене-за (Віх et al, 2008).
Известно, что при злокачественной трансформации меняется структура, состав, степень сульфатирования (Theocharis et al., 2003; Achilleas et al., 2002) и эпимеризации протеогликанов - замещения остатков глюкуроновой кислоты (GlcUA) на идуроновую (IdoUA) (Timar et al, 2002; Valla et al, 2001). Содержание остатков идуроновой кислоты в составе протеогликанов (ПГ) имеет важное значение для нормального функционирования гепарансульфат протеогликанов (ГСПГ) (Westergren-Thorsson et al., 1991). Показано, что содержание идуронового компонента коррелирует с антипролиферативным эффектом гепарансульфат протеогликанов - ГС, богатые остатками идуроновой кислоты (IdoUA) оказывали значительный антипролиферативный эффект на клетки мезотелиомы, тогда как ГС, имеющие в своем составе в основном остатки глюкуроновой кислоты, не имели подобного эффекта (Syrokou et al., 1999). При опухолях прямой кишки (Tsara et al., 2002), толстого кишечника (Theocharis, 2002), опухолях поджелудочной железы (Skandalis et al., 2006а) и карциномы гортани (Skandalis et al., 2006b) содержание идуроновой кислоты в углеводных цепях ГАГ версикана и декорина снижается. Изменения в структуре и соотношении GlcUA/IdoUA в опухоли могут свидетельствовать о том,
что, возможно, при злокачественной трансформации происходит нарушение в процессе биосинтеза ПГ, в частности в процессе эпимеризации.
D-глюкуронил С5-эпимераза (GLCE) является одним из ключевых ферментов биосинтеза гепарансульфат протеогликанов. Этот фермент проводит реакцию эпимеризации остатков глюкуроновой кислоты в идуроновую в углеводных цепях ГСПГ, участвующих в поддержании межклеточного контакта и передаче сигнальной информации. Эпимераза является единственным ферментом биосинтеза ГСПГ, о котором практически ничего не известно. До настоящего времени эпимераза изучалась исключительно как фермент биосинтеза ПГ - определена ее субстратная специфичность, кинетические свойства (Hagner-McWhirter et al., 2000b), механизмы эпимеризации глюкуронила (Pri-har et al., 1980; Backstrom et al., 1979), клонирована кДНК эпимеразы из легкого быка (Li et al., 1997), мышиной печени (Li et al., 2001) и клеток мышиной мастоцитомы (Crawford et al., 2001).
Разрушение гена, кодирующего D-глюкуронил С5-эпимеразу у мыши, приводило к гибели эмбрионов, у которых были обнаружены дефекты развития почек, легких, нарушения в костной ткани (Hagner-McWhirter et al., 2004). Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия/акивность эпимеразы может иметь важное значение для правильного формирования органов.
Отсутствие других данных о D-глюкуронил С5-эпимеразе не позволяет получить представление о том, есть ли какая-либо тканеспецифичность в экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы у человека, изменяется ли экспрессия/активность этого фермента при злокачественной трансформации и существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Нами была высказана гипотеза, что при злокачественной трансформации клеток происходит нарушение экспрессии либо активности D-глюкуронил С5-эпимеразы, что приводит к изменению структуры и состава ГСПГ и пролифе-ративной активности клеток.
Цель данной работы: исследовать роль D-глюкуронил С5-эпимеразы в регуляции клеточной пролиферации и злокачественной трансформации.
В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:
Определить уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека.
Исследовать экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в клинических образцах злокачественных и доброкачественных опухолей и культурах опухолевых клеток рака легкого, молочной и предстательной желез человека.
Изучить влияние экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферативную активность опухолевых клеток карциномы молочной железы (MCF7), карциномы предстательной железы (LNCaP) и мелкоклеточного рака легкого (U2020) in vitro.
Изучить влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на формирование экспериментальных опухолей in vivo (мыши SCID) и провести анализ ее экспрессии в выросших опухолях.
Научная новизна работы
В данной работе впервые было показано, что:
ген D-глюкуронил С5-эпимеразы экспрессируется во всех изученных нормальных тканях человека (молочная железа, легкое, тимус, щитовидная железа, почка, кишечник, предстательная железа) и показана тканеспецифичность экспресии данного гена
при злокачественной трансформации ткани молочной железы и предстательной железы человека происходит снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с нормальной тканью. Снижение экспрессии гена эпимеразы детектируется даже в неизмененной ткани, окружающей опухоль молочной железы
восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы оказывает антипролиферативное влияние на культуру опухолевых клеток различного происхождения - культуру клеток рака молочной железы линии MCF7, рака предстательной железы линии LNCaP и мелкоклеточного рака легкого линии U2020
восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы оказывает су-прессирующий эффект на формирование и рост экспериментальных опухолей у иммунодефицитных мышей линии SCID.
Практическая значимость
Полученные данные о снижении гена D-глюкуронил С5-эпимеразы не только в опухоли молочной железы, но и в неизмененной ткани, окружающей опухоль, привлекает внимание к этому гену как новому возможному маркеру доклинической диагностики рака молочной железы.
Способности эпимеразы супрессировать пролиферацию опухолевых клеток in vitro и рост экспериментальных опухолей in vivo дают основу для дальнейших исследований гена D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможного кандидата для генотерапии злокачественных новообразований.
Основные положения, выносимые на защиту
Ген D-глюкуронил С5-эпимеразы человека экспрессируется во всех исследованных тканях человека, с наивысшим уровнем экспрессии в молочной железе и легком и меньшей экспрессией в тканях почки, тимуса и щитовидной железы.
В злокачественных опухолях молочной и предстательной железы человека происходит значительное снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5 -эпимеразы, при гиперплазии и в доброкачественных опухолях экспрессия гена в большинстве случаев сохраняется на нормальном уровне.
Усиление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках при введении плазмидной конструкции, несущей полноразмерную кДНК эпимеразы, супрессирует пролиферацию опухолевых клеток in vitro для клеточных линий MCF7 (рак молочной железы), LNCaP (рак предстательной железы) и U2020 (мелкоклеточный рак легкого).
4. D-глюкуронил С5-эпимераза подавляет формирование экспериментальных опухолей in vivo у мышей SCID - при инокуляции экспрес-сирующих эпимеразу клеток U2020 опухоли образовались лишь у 5 из 10 экспериментальных мышей, в выросших опухолях экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы практически отсутствует.
Апробация работы
Результаты работы были представлены и обсуждены на 42ой Международной Научной Студенческой Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 14 апреля 2004), на 8ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 17-21 апреля 2004), на Мировом конгрессе по онкологии и Симпозиуме по молекулярной медицине (The World Congress on Advances in Oncology, and International Symposium on Molecular Medicine), (Крит, Греция, октябрь 2004, 2005, 2006, 2007, 2008), на 6ой Европейской конференции по раку молочной железы (6th Europeam Breast Cancer Conference ), (Белин, Германия, 15-19 апреля 2008), на 8ой Международной конферении по исследованию рака (8 International Conference of Anticancer Research ) (Кос, Греция, октябрь 2008), на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная Онкология» (Новосибирск, Россия, 1-3 октября 2008).
Строение и классификация гликозаминогликанов
Практически все клетки продуцируют протеогликаны (ПГ), которые затем могут транспортироваться во внеклеточный матрикс (ВКМ), встраиваться в плазматические мембраны или оставаться в секреторных гранулах.
Протеогликаны внеклеточного матрикса (ВКМ) в основном содержат ДС/ХС цепи ГАГ, тогда как ПГ на поверхности клеток в основном представлены ГС (Tumova et al, 2000). Основные функции протеогликанов обусловлены их локализацией - протеогликаны ВКМ чаще всего формируют его структуру за счет связывания с другими макромолекулами, ПГ клеточной поверхности являются рецепторами для факторов роста и компонентов внеклеточного матрикса.
Протеогликаны в ВКМ формируют его структуру за счет взаимодействия с ламинином, фибронектином (Schamhart et al, 1997), коллагеном I (Schonherr et al, 1995). Известно, что декорин связывается с коллагеном I, II (Bianco et al, 1990), IX (Fleischmajer et al, 1991), причем как в эмбриональных тканях, так и в тканях взрослого человека (Fleischmajer et al, 1991). Фибромо дулин, так же как и декорин, связывается с коллагеном I и II и влияет на их фибриллогенез (Oldberg et al, 1989), тогда как бигликан коллаген не связывает, но его большое количество было обнаружено во внеклеточном матриксе мезенхимальных эмбриональных клеток (Fleischmajer et al., 1991). Аггрекан в суставных хондроцитах быка образует комплекс с гиалуроновой кислотой и связывающим белком (Embry et al, 2003), кроме того, подобный комплекс может образовывать и другой ПГ - версикан (Matsumoto et al, 2003). Показано, что молекула версикана из культуры клеток ACHN взаимодействует с хе-мокинами (Hirose et al, 2001), L-селектином (Kawashima et al, 1999), P-селектином, рецептором CD 44 (рецептор CD 44 играет важную роль в процессах воспаления, аутоиммунном ответе, прогрессии опухолей). Связь образуется посредством взаимодействия ХС цепи версикана с углевод-связывающим доменом L-, Р-селектина, CD44 (Kawashima et al, 2000).
Протеогликаны клеточной поверхности встроены в мембрану посредством трансмембранного домена как, например, синдеканы, либо, как глипика-ны, могут быть заякорены через гликозилфосфатидилинозитол (GPI) (Рис. 6) Рисунок. 6. Протеогликаны клеточной поверхности (Varki et al., 2009). ПГ поверхности клеток часто представляют собой рецепторы для различных компонентов ВКМ, регуляторных макромолекул, факторов роста и играют ключевую роль в информационной связи между клеткой и ВКМ (Рис.7.) (Wuet al, 2003) Молекулы клеточной адгезии Белки цитоскелета Взаимодействие клетка-матрикс Протеоглика-ны клеточной поверхности Гликозаминогликаны Межклеточное взаимодействие Ж. Протеогликаны внеклеточного матрикса Внутриклеточные связывающие белки Нити коллагена Адгезивные белки Рисунок 7. Локализация протеогликанов (Freeman et al., 2000). На поверхности кератиноцитов идентифицирован гепарансульфат проте-огликан эпикан (Haggerty et al, 1992), после секвенирования его корового белка было обнаружено, что он является протеогликановой формой рецептора CD44 (Kugelman et al, 1992). Более того, это альтернативно сплайсированная форма корового белка CD44, содержащая дополнительный экзон (Brown et al, 1991). Другой мембранный гепарансульфат протеогликан перлекан является ко-рецептором для различных факторов роста: для факторов роста фибробластов (FGF1, -2, -7, -9, -10, и -18), эндотелиального фактора роста (VEGF) и PDGF (Віх et al, 2008, Knox et al, 2006). Перлекан связывает, накапливает и «представляет» факторы роста для их функциональных рецепторов. При злокачественной трансформации в опухоли повышается содержание гепараназы, она разрушает перлекан и происходит высвобождение накопившихся факторов роста. Увеличение содержания факторов роста приводит к связыванию их с соответствующими рецепторами и активации Akt-путей, что в конечном счете усиливает ангиогенез и опухолевый рост (Whitelock et al., 2008; Melrose et al, 2008). Помимо того, что перлекан является сильным ангиогенным кофактором, имеются данные, что он обладает анти-онкогенными свойствами. (Whitelock etal, 2008) (Рис.8).
Материалы
В работе были использованы следующие материалы и реактивы: фенол, ксилол, хлорид калия, хлорид натрия, хлороформ, изопропиловый спирт, уксусная, соляная кислоты - отечественного производства категории ОСЧ, перегнанный этиловый спирт.
Трис, SDS (додецилсульфат натрия), борная кислота - "ICN" (США). Этидий бромистый- "Merck" (Германия) EDTA, красители бромфеноловый синий, ксиленцианол - "Serva" (Германия) Агароза -"Лаборатория Медиген" (Россия, Новосибирск) Taq-ДНК-полимераза -"Лаборатория Медиген" (Россия, Новосибирск) Обратная транскриптаза (M-MLV RT) "Sibenzyme" (Россия, Новосибирск) нуклеозидтрифосфаты - "Sibenzyme" (Россия, Новосибирск) Раствор для демаскировки антигенов (Antigen Unmusking Solution) (Vector,CIIIA) IMDM-среда, L-глютамин, пенициллин/стрептомицин - Sigma (США), Fetal Bovine Serum - Gibco (Invitrogen, США), Панель кДНК из нормальных тканей человека - Clontech (США), Epimerase TaqMan Custom Assay - AppliedBiosystems (США), Поликлональная сыворотка против эпимеразы - GenScript Corporation (США). Брэдфорд - Bio-Rad (Великобритания) ECL Plus Western Blot System - Amersham Biosciences (Великобритания). Клинические образцы:
В работе использовали образцы из зоны опухолевого очага и наименее измененных удаленных участков молочной железы одного и того же пациента, удаленные в ходе хирургического вмешательства. Нормальными образцами считали ткань молочной железы от пациентов, не страдающих злокачественными заболеваниями (косметические операции).
Операционный материал получали в Городской Клинической Больнице N1 г. Новосибирска, забор образцов проводили под контролем главного онколога г. Новосибирска д.м.н., проф. С. В.Сидорова, диагноз верифицирован гистологическим исследованием. Преобладающим гистологическим типом опухолей молочной железы являлся протоковый инфильтрующий рак (72 пациента из 74) различной степени злокачественности - I степень - 13 пациента, II степень - 41 пациентов, III - 20 пациентов. Большинство исследованных пациентов находились на второй стадии прогрессии злокачественного процесса - T2N1-2M0 - 54 пациентов, T1N1-2M0 - 13 пациентов, T3N1-2M0 - 7 пациентов.
Образцы доброкачественных опухолей (21 образец) представляли собой фиброаденомы молочной железы. В качестве нормальной ткани использовали клинические образцы молочной железы от пациентов, не страдающих злокачественными заболеваниями, удаленные в ходе косметических операций (21 образец). От всех пациентов имеется письменное информированное согласие на участие в исследовании, эксперименты соответствуют этическим принципам Хельсинкской Декларации и стандартам биоэтического комитета ГУ НИИ МББ СО РАМН.
Образцы опухолей предстательной железы были получены из Университета Крита, Лаборатория Клинической Вирусологии, Греция. Преобладающим гистологическим типом опухолей являлась карцинома предстательной железы, большинство исследованных пациентов находились на второй и третьей стадии прогрессии злокачественного процесса - T2N1-2M0 - 16 пациентов, T3N1-2M0 - 23 пациентов, T1N1-2M0 - 3 пациента. Дополнительно было исследовано 41 образец гиперплазии предстательной железы. В качестве нормы использовались 5 образцов, полученных от людей, погибших в результате несчастного случая. Диагноз для каждого из образцов верифицировали гистологическим исследованием.
Блоки для иммуногистохимического исследования экспериментальных мышиных опухолей изготовляли в Кемеровском областном патологоанатомиче-ском бюро, централизованной иммуногистохимической лаборатории диагностики опухолей человека. Гистологические срезы были сделаны в НИИ Региональной Патологии и Патоморфологии СО РАМН. Праймеры
Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали праймеры, синтезированные в компании "Лаборатория Медиген", Новосибирск. Праймеры для гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека (NM_015554.1) и гена глице-ральдегид-3-фосфат дегидрогеназы GAPDH (NM_002046.2).
Выделение суммарной клеточной РНК проводили с помощью PureLink Total RNA Purification System (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. 30-50 мг ткани растирали в 1 мл лизирующего буфера в ступке, добавляя жидкий азот. К гомогенату добавляли 500 мкл этанола, перемешивали, переносили на колонку, центрифугировали при 2 000 g на центрифуге "Eppendorf (Германия) в течение 30 сек. Добавляли 500 мкл буфера I, центрифугировали 30 сек при 2 000 g, повторно промывали 700 мкл буфера II, центрифугировали при 2 000 g 30 сек. Высушивали центрифугированием в течение 2 мин при 10 000 g. Элюировали суммарную РНК в 50-100 мкл воды, свободной от РНКаз.
Обработка РНК от возможной примеси ДНК проводили при помощи набора реагентов TURBO DNA-free (Ambion inc., UK). К выделенной РНК добавляли 1/10 объема ДНКазного буфера, 2 ед. акт. ДНКазы и инкубировали 20 минут при 37 С. Добавляли 1/10 объема инактивирующего реагента (DNase Inactivation Reagent), инкубировали 2 мин при комнатной температуре. Центрифугировали 2 мин при 12 000 g, переносили в новую прибирку.
. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы
Уровень экспрессии эпимеразы в нормальной ткани молочной железы человека был изучен при помощи набора праймеров для кДНК GLCE (NM015554.1). Поскольку нет никакой информации о существовании изо-форм или альтернативно сплайсированных форм эпимеразы, то нами были подобраны комбинации праймеров для различных участков гена эпимеразы (Рис.22). primer paii Рисунок 22. Схема расположения сайтов для праймеров для амплификации различных участков гена D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Экспрессия гена эпимеразы была исследована в нормальной ткани молочной железы человека (от пациентов, не страдающих злокачественными заболеваниями - косметические операции) и в клинических образцах молочной железы (опухолевая и контрольная ткань от одного и того же пациента) при помощи 6 различных пар праймеров. Образец Ж Образец №2. Анализ экспрессии эпимеразы методом мультиплексной ПЦР. (А) Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР из нормальной ткани молочной железы человека. (Б) Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР из клинических образцов опухолевой (О) и контрольной (К) ткани. 1-6 - различные пары праймеров. В качестве внутреннего стандарта использовался ген GAPDH.
В нормальной ткани молочной железы все праймеры давали фрагмент ДНК ожидаемого размера, приблизительно одинаковой интенсивности (Рис. 23А). Однако у некоторых пациентов в опухолевых образцах наблюдалось различие в интенсивности и размерах амплифицированных фрагментов (Рис. 23Б). Так, пара праймеров на 4 экзон (1 и 2 пара) в опухоли и контроле давала полосы одинаковой интенсивности, тогда как пары 3, 4 и 5 (затрагивающие 2 и 3 экзон) показывали значительные различия в опухоли по сравнению с контролем (Рис.23Б) - полоса в опухоли была заметно меньшей интенсивности, 4 пара праймеров давала фрагмент меньшего размера. Возможным объяснением такого различия в экспрессии при использовании различных пар праймеров может быть альтернативный сплайсинг или укорочение мРНК эпимеразы в опухолях молочной железы в районе 3 экзона.
Таким образом, пара праймеров №4 была выбрана для дальнейшего анализа экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолях молочной железы методом мультиплексной ПЦР. Анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой тканях молочной железы человека методом мультиплексной ОТ-ПЦР
Для сравнительного анализа экспрессии гена эпимеразы в тканях молочной железы человека были использованы три типа образцов, обозначенные как норма, контроль и опухоль. Нормальными образцами считались клинические образцы молочной железы пациентов, не страдающих злокачественными новообразованиями, полученные в результате косметической хирургии. Опухолевая и контрольная ткань - центральная часть опухоли и максимально удаленный образец неизмененной ткани железы одного и того же пациента. Выделенная РНК использовалась в дальнейшем ОТ-ПЦР анализе с использованием праймеров для эпимеразы (пара 4) и внутреннего контроля гена GAPDH (Рис. 24) I
Анализ экспрессии гена эпимеразы в нормальной, контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека. (А) Электрофоре-грама продуктов мультиплексной ОТ-ГЩР с праймерами для генов эпимеразы (пара 4) и GAPDH. (В) Относительный уровень экспресссии гена эпимеразы в норме (Н), контроле (К) и опухоли (О) у различных (1-125) пациентов. Каждая реакция проводилась трижды, приведены средние значения ± SD.
Экспрессия гена эпимеразы была определена в 10 образцах нормальной ткани и 43 парах образцов опухолевой и контрольной ткани, при прочих равных условиях. Уровень мРНК гена GLCE оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности амплифицированного фрагмента GLCE к интенсивности фрагмента гена GAPDH. Относительный уровень экспрессии гена эпимеразы определяли с помощью компьютерной программы "Total Lab, Nonlinear Dynamics, UK". Обнаружено, что уровень мРНК D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли был значительно ниже, чем в нормальной ткани - у 82% исследованных пациентов экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы снижена более чем в два раза. Более того, в большинстве случаев уже в контрольной ткани было отмечено снижение экспрессии эпимеразы по сравнению с нормой.
Влияние экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост стабильно трансфицированных клонов
Полученные конструкции epi-pETE/Bsd и epi-pCEP4 были использованы для восстановления экспрессии эпимеразы в клетках мелкоклеточного рака легкого линии U2020, клетках карциномы молочной железы линии MCF7 и клетках карциномы предстательной железы линии LCNaP. Была проведена трансфекция клеточных линий U2020 и LNCaP конечной конструкцией epi-pETE/Bsd, полученные клоны были обозначены как epi-U2020 и ері- LCNaP. Трансфекцию клеточной линии MCF7 проводили конструкцией epi-pCEP4, полученные клоны были обозначены как epi-MCF7. В качестве контроля проводили трансфекцию пустыми векторами pETE/Bsd и рСЕР, полученные клоны обозначали как pETE-U2020, pETE-LCNaP, pCEP-MCF7.
После трансфекции были отобраны стабильные клоны, наличие экспрессии эпимеразы в которых было проверено методом мультиплексной ОТ-ПЦР (Рис. ЗЗА). Стабильно трансфицированные клоны epi-U2020, epi-MCF7 и epi-LNCaP. А. Электрофореграмма экспрессии гена эпимеразы в стабильных клонах по сравнению с иходными клеточными линиями. Наибольшей экспрессией обладают epi-MCF7 клон 3, epi-LNCaP клон 5, epi-U2020 клоны 4, 7, 8.
Б. Кривые пролиферации стабильных клонов epi-MCF7 1, 3, 4, рСЕР4-LCNaP, 5, epi-U2020 4, 7, 8 с использованием CyQUANT NF Cell Proliferation Assay Восстановленный уровень экспрессии эпимеразы в клонах epi-MCF7 кл.З, epi-LNCaP кл.5 и epi-U2020 кл. 4 , кл.7 и кл.8 был значительно выше, чем в контрольных клонах с пустыми векторами (Рис. 33 А). Стабильные клоны с наивысшей экспрессией эпимеразы были использованы для определения пролиферативной активности клеток методом CyQUANT NF Cell Proliferation Assay (Invitrogen), позволяющим определять содержание клеточной ДНК при связывании ее со специфическим флюоресцентным красителем. Измерения флюоресценции проводились каждые 24 часа и по полученным данным строили прямую линию, угол наклона которой и определяет скорость клеточного деления (Рис. 33 Б).
Из приведенных графиков видно, что во всех клеточных линиях эпиме-раза тормозила скорость деления клеток in vitro, хотя и в разной степени. Поскольку снижение пролиферации наблюдалось в клеточных линиях различного гистохимического происхождения (мелкоклеточного рака легкого линии U2020, клетках карциномы молочной железы линии MCF7 и карциномы предстательной железы линии LCNaP), то можно предположить, что D-глюкуронил С5-эпимераза может обладать ткане-неспецифичным антипроли-феративным эффектом.
Для подтверждения возможной антипролиферативной активности D-глюкуронил С5-эпимеразы необходимо было провести эксперименты in vivo. Изучение влияния экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост экспериментальных опухолей in vivo Влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на развитие опухоли in vivo было изучено методом инокуляции суспензии опухолевых клеток, стабильно трас-фецированных плазмидой epi-pETE\Bsd, иммунодефицитным мышам линии SCID (дефицит Т-клеток у SCID связан с дефектом процесса рекомбинации рецепторных генов). Для инокуляции были отобраны клоны epi-U2020 с максимально выраженным усилением экспрессии эпимеразы (клоны 4, 7, 8). В качестве контроля использовали клетки, несущие пустой вектор - pETE-U2020 (Рис. 34). 2000 1600 Влияние эпимеразы на рост опухолей у иммунодефицитных мышей линии SCID. Для инокуляции использовали три различных epi-U2020 стабильных клона (4, 7 and 8), в качестве контроля - клетки, несущие пустую плазмиду pETE-U2020. Измерения размера опухолей (ммЗ) проводились в течение 35 дней.
Практически все экспериментальные опухоли epi-U2020 росли значительно медленнее по сравнению с контрольными (Рис. 34) либо не вырастали вообще. В течение 35 дней опухоли были выявлены у 5 из 6 контрольных мышей, инокулированных клетками pETE-U2020. У экспериментальных мышей, инокулированных клетками epi-U2020 клонов, образовались лишь 5 опухолей из 10 (Рис. 35). epi-U2020 клон 4 клон Рисунок 36. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в экспериментальных опухолях. А. Электрофореграмма мультиплексной ОТ-ПЦР, в качестве внутреннего стандарта использовали ген GAPDH. Б.Относительная экспрессия гена эпимеразы по отношению к GAPDH. (К) - клетки, использованные для инокуляции, (О) - выросшие из них опухоли Подписи на графике соответствуют дорожкам на электрофореграмме. Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD
Уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в выросших опухолях был значительно ниже, чем в исходных клетках epi-U2020, использованных для введения SCID мышам. Результаты количественной ПЦР в реальном времени подтвердили данные мультиплексной ОТ-ПЦР - экспрессия эпимеразы в опухолях, выросших из epi-U2020 клеток практически полностью отсутствовала, при уровне экспрессии 720-960 молекул эпимеразы/1000 молекул GAPDH в исходных клетках, использованных для инокуляции. Наличие белковой молекулы эпимеразы в опухолях, выросших у SCID мышей, определялось с помощью иммуногистохимического исследования опухолей с использованием анти-эпимеразной поликлональной сыворотки (GenScript Corp., USA) (Рис. 37). Рисунок 37. Иммуногистохимический анализ экспериментальных опухолей, выросших у SCID мышей.
Синим окрашены ядра (гематоксилин). Коричневым окрашена белковая молекула эпимеразы. Первичные антитела - поликлональная сыворотка. Вторичные антитела (anti-rabbit)- HRP антитела. Окраска ДАБ и гематоксилином. А. Гистологический срез опухоли, выросшей из клеток исходной клеточной линии U2020, содержащих пустую плазмиду. Б. Гистологический срез опухоли, выросшей из клеток эпимераза-Ш020, 4 клон. Было продемонстрировано, что в опухолях белок D-глюкуронил С5-эпимеразы не детектируется (рис. 37 А, Б).
Полученные данные согласуются с результатами ОТ-ПЦР анализа о снижении уровня мРНК эпимеразы в экспериментальных опухолях по сравнению с уровнем мРНК в клонах, использованных для инокуляции мышам SCID. Это подтверждает наше предположение о том, что в опухолях происходит инактивация GLCE, что по-видимому, является необходимым условием развития опухоли, и, следовательно, D-глюкуронил С5-эпимераза может являться потенциальным геном, супрессирующим развитие опухоли. В целом, полученные данные свидетельствуют в пользу возможного су-прессорного эффекта гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферацию опухолевых клеток и развитие опухоли. Наличие такого эффекта в случае D-глюкуронил С5-эпимеразы привлекает внимание к этому гену как возможному гену-супрессору развития опухоли и новому участнику механизмов регуляции пролиферативной активности клеток.
