Введение к работе
-
Актуальность темы. Щелочная фосфатаза (Ш 3.1.3.1) -Ш - группа ферментов, катализирующих гидролиз эфиров ортофосфорний кислоты и различных органических соединений, как алифатических, так и ароматических (N.N.Femley , I97I;V.P. Hollauder, 1971). Распространенность в природе (бактерии, растительные и животные ткани) свидетельствует о том, что фермент ответственен за фундаглентальные биохимические процессы. Фермент присутствует практически во всех органах и тканях и особенно высока его активность в костной ткани, паренхиме печени, почек, слизистой кишечника, предстательной и молочной железах. Активность ЩФ обнаруживается и в сыворотке крови. По данным разных авторов, з сыворотке крови крупного рогатого скота присутствует от одного до трех изоферментов ЩФ. Сведения об изсферментном спектре Ш у крупного рогатого скота в зависимости от возраста и беременности носят фрагментарный характер. Изучение активности и изофер-ментного состава Щ сыворотки крови разных возрастных групп крупного рогатого скота в зависимости от физиологического состояния и уровня обмена веществ может открыть новые возможности для ветеринарной медицины з диагностике нарушения обмена и функции внутренних органов.
-
Цель и задачи исследований. Целью исследования явилось изучение изоферментного спектра и активности изоферментов ЩФ сыворотки крови крупного рогатого скота з динамике роста и развития, беременности и после родов, уровня минерального и белкового обменов.
Задачи исследований:
- изучить изферментный спектр и активность изоферментов
4 ЩФ сыворотки крови телят 3-х, 12-, 18-месячного возраста;
изучить изоферментный спектр и активность изоферментов ЩФ сыворотки крови нетелей и коров в зависимости от сроков беременности и после родов;
изучить возможные взаимосвязи активности изоферментов ЩФ и уровня общего кальция для вышеуказанных животных,
изучить возможные взаимосвязи активности изоферментов Ш и уровня неорганического фосфора;
« изучить частоту выявления и относительную активность от-дельных изоферментов ЩФ в зависимости от уровня белков (как показателя функциональной активности печени);
- изучить активность изоферментов ЩФ нетелей с нарушениями
минерального обмена.
Исследования выполнены в,соответствии с планом научно-исследовательских работ, утвержденных Отдедением ВАСХНИЛ по Нечерноземной зоне {№ Госрегистрации научно-технического задания 0].9.ТО 027738, шифр 0021).
Ч»3, Научная новизна. Изучен изоферментный состав и активность изоферментов ЩФ сыворотки крови крупного рогатого скота черно-пестрой породы в динамике роста и развития (телята 3-х, 12-, 18-месячного возраста), физиологического состояния (нетели и коровы в зависимости от сроков беременности и в течение 2-х месяцев после родов), нетелей с нарушениями минерального обмена. Получены новые данные корреляционной связи активности костной фракции ЩФ2 с уровнем неорганического фосфора разных возрастных груші и физиологического состояния; печеночной фракции ЩФ, с уровнем альбуминов и альбумин-глобулинового коэффициента, В сравнительном аспекте дана характеристика изоферментов ЩФ в зависимости от возраста, физиологического состояния и уровня обме-
5 на веществ.
1.4. Практическая значимость работы. Полученные результаты
могут быть использованы как биохимические критерия нормы и пато
логии у крупного рогатого скота черно-пестрой породы а диагности
ческих целях ветеринарной медицины.
Кроме тогов полученные результаты могут быть использованы в ветеринарной биохимии как исходные для крупного рогатого скота черно-пестрой породы, для оценки минерального обмена и функционального состояния органов и тканей.
1.5. На защиту выносятся следующие основные полонения дис
сертации:
основные фракции изоферментов ЩФ у крпного рогатого скота в зависимости от возраста и физиологического состояния;
активность изоферментов Ш и уровень общего кальция и неорганического фосфора у крупного рогатого скота в зависимости от возраста и физиологического состояния}
активность изоферментов ЩФ и уровень белкового обмена у крупного рогатого скота в зависимости от возраста и физиологического состояния;
сравнительный анализ изоферментов ЩФ у крупного рогатого скота в зависимости от возраста, физиологического состояния и обмена веществ.
-
Реализация результатов исследований. По итогам проведенных исследований получено 1 авторское свидетельство S 1720637 "Способ диагностики субклинической остеодистрофии у нетелей" заявка * 479890, приоритет 26.02.90.
-
Апробация работц. Основные положения диссертации доложены на: Всеосюзном симпозиуме "Микроэлементозы человека", М., 15-17 ноября 1989; Конференции "Проблемы диагностики, профилак-
тики и лечения сельскохозяйственных животных в Нечерноземной зоне". Нижний Новгород, 1992; Всесоюзной научно-производственной конференции "Гигиена, ветсанитария и экология животноводства", Чебоксары, 22-24 сентября 1994; Научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов, посвященной 65-^летию основания ЧГСХА 19-22 марта 1S96, Чебоксары, 19S6; Юбилейной научной и учебно-методической конференции, посвященной 70-летио ^ факултета ветеринарной медицины Воронежского государственного аграрного университета им, К,Д.Глинки, Воронеж, 21-23 октября 1996.
Основные научные положения и практические рекомендации используются в Республиканской ветеринарной лаборатории для диагностики патологии минерального обмена веществ у животных,
-
Публикация результатов исследований. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 7 печатных работах,
-
Объем и структура диссертации» Диссертация изложена на 148 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов, практических предложений, списка литературы и приложения; иллюстрирована 45 таблицами и 11 рисунками. Список литературы включает 212 источника, в том числе 147 иностранный,
Характеристика групп животных. Экспериментальные исследования проводились в лабораториях Чувашского отдела Научно-исследовательского ветеринарного института Нечерноземной зоны Российс-
кой Федерации и производственных условиях хозяйств Чувашской Республики: СХПК "Канаш" Канашского, "Заветы Ильича" Ядринского и "Чебоксарский" ..Чебоксарского районов. Группы животных подбирались по принципу аналогов с учетом породности, пола, возраста, количества лактации, сроков беременности. 3 опытах использованы телята в возрасте 3, 12, 18 месяцев, нетели в динамике беременности 5-9 месяцев, первотелки после родов в течение 2-х месяцев, коровы 2-4 лактации продуктивностью 3500-4000 кг молока в год в динамике беременности 6-9 месяцев и после родов в течение 2-х месяцев. В группах нетелей в отдельную подгруппу выделялись животные с нарушениями минерального обмена. Для экспериментальных исследований подбирали крупный рогатый скот черно-пестрой породы, исследования проведены в стойловый период содержания. Группы отбирались комиссионно научными сотрудниками Чувашского отдела и специалистами хозяйств.
Материалы и методы. Материалом исследования слуаила кровь крупного рогатого скота. Всего исследовано 879 проб сыворотки крови, из них: телята в возрасте 3 месяца - 6, 12 месяцев - 6, 18 месяцев - 13; нетелей в динамике беременности - 179; первотелок в течение 2-х месяцев после родов - 108; коров в динамике беременности - 202; коров в течение 2-х месяцев после родов -365.
Во всех пробах крови определяли активность ЩФ, изоферменты Щ$, содержание общего кальция и неорганического фосфора, общего белка и белковых фракций с расчетом альбумин/глобулинового (А/Г) коэффициента.
Для решения поставленных задач использовались следующие методы исследования:
-
Общую активность Щ5 (ОЩФ)определяли по гидролизу р-нигро фенидфосфата оптималиэованным методом с использованием наборов реактивов фирмы "ЛАХЕМА" (Чешская Республика).
-
Белковые фракции определяли методом электрофореза на ацетатцеллюлозных мембранах на трис-глициновом буфере с последующим окрашиванием амидочерным 10 В и количественной оценкой после элюирования в смеси 1н NaOH : 0,1 н трилон Б : Н20 в соотношении 5,0:0,5:5,0 (Пушкарев И.А., Зариньш Э.В. и др., 1977).
-
Общий белок определяли рефрактометрическим методом.
-
Неорганический фосфор определяли по методу В.Ф.Коромыс-ловой и Л.А.Кудрявцевой.
-
Общий кальций определяли комплексонометрическим титрованием.
-
Раделение изоферментов ЩФ проводили методом электрофоре-
«
за в пластинчатом 7 % полиакриламидном геле в трис-глициновой буферной системе рН 3,3 на аппарате для вертикального электрофореза марки ПЗФА с использованием камеры для пластинчатых гелей марки АВГЭ № 1 ("Химифил" РК "ХИЙУ КАЛУР" Эстонская Республика). Проявляли изоферменты методом одновременного азосочета-ния с использованием в качестве субстрата 2-нафтилфосфат и в качестве солей диазония - краситель синий прочный В. Количественную оценку изоферментов проводили на микрофотометре МФ-2 и активность рассчитывали исходя из общей активности.
Предварительно в качестве метода выбора для разделения изоферментов ЩФ был опробирован также электрофорез в 1 % агаровом геле, в процессе которого было выявлено, что в агаровом геле отдельные фракции ІДФ частично перекрываются и метод в дальнейшем не использовался, как не имеющий достаточную разрешающую способность.
Результаты исследований обрабатывали методами вариационной статистики, для чего определяли среднее выборки, ошибку средней, достоверность различий между группами, коэффициент корреляции, коэффициенты линейной регрессии; применяли также метод оценки и сравнения бинарных отношений с использованием меры Кульбака,
