Содержание к диссертации
Стр,
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЭОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. СТРОЕНИЕ Г-рАТФ-азы
Молекулярный вес и субъединичный состав Ej-АТФ-авы 9
Стехиометрия субъединиц в молекуле tPj-АТФ-азы II
функции скбъединиц Tj-АТФ-азы 15
1.4. Пространственная структура ij-АТФ-азы 20
ГЛАВА 2. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ^-АТФ-азы
Общие каталитические свойства --АТФ~азы .... 25
Связывание -Г-рАТФ-азой нуклеотидов и неорганического фосфата 26
Влияние АДФ на каталитические свойства Fj-АТФ-азы 31
Кооперативность взаимодействия между каталитическими центрами Fj-АТФ-азы. Модель поочередно функционирующих каталитических центров 33
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Препаративные методы 42
Аналитические методы 48
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Прочное связывание адешшовых и гуаниновых
нуклеотидов митохондриальной --АТФ-азой.
Влияние связанных нуклеозиддифосфатов на ка
талитические свойства фермента 52
_ 4 -
Стр.
Кооперативность в связывании АДФ и неорганического фосфата в каталитическом центре митохондриальной |-АТФ-азы 74
Взашлодеиствие митохондриальной ij-АТФ-азы с новым фотоактивируемым аналогом АТФ-3-(2' М2-нитро-4-азидобензоия)-аденозин--5~ трифосфатом. Локализация центра, осуществляющего одно-центровый катализ 90
3 А К Л Ю Ч Е Н И Е Ю5
ВЫВОДЫ П6
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ П9
Введение к работе
Система превращения энергии в сопрягающих мембранах митохондрий, хлоропластов и бактерий является одной из наиболее сложных ферментативных систем, известных в настоящее время. Она состоит из переносящих электроны комплексов ферментов дыхательной или фотосинтетической цепи и Н+-АТФ-азного комплекса. Энергия, освобождаемая в результате окисления субстратов дыхания или при фотосинтезе, аккумулируется в виде трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода {aj*R+) и используется затем Н?-АТФ-азой для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата / 1-3 /. В большинстве типов животных клеток и у многих видов бактерий более 80% необходимого для жизнедеятельности АТФ синтезируется этим путем / 4 /.
Однако при отсутствии доступных субстратов окисления или в анаэробных условиях (митохондрии и бактерии), а также в темноте (хлоропласта и фотосинтезирующие бактерии) Н+-АТФ-азный комплекс способен гидролизовать АТФ, что приводит к генерации лДН"!" на сопрягающих мембранах / 4 /. Для ряда анаэробных бактерий, например Streptococcus faecalies , гидролиз АТФ и сопряженная с ним генерация дм Н"!" является основной физиологической функцией Н*-АТФ-азы / 5 /. В этом случае гидролиз АТФ - практически единственный источник длН*, необходимого для обратного переноса электронов, транспорта различных метаболитов, восстановления пиридиновых нуклеотидов, и, возможно, бактериального таксиса / 5,6 /. Такшл образом, ясно, что независимо от направления катализируемой Н^-АТФ-азой реакции и природы сопрягающих мембран, этот фермент играет ключевую роль в энергетическом обмене клетки. Неудивительно, поэтому, что механизм функционирования и регуляции Н+-АТФ-азы является объектом всестороннего изучения многочисленных групп ис-
следователей.
Исследования, проведенные в последние годы, подтвердили справедливость гипотезы Бойера и сотр. / 7,8 / об энергообеспечении реакции синтеза АТФ, осуществляемой Н+-АТФ-азным комплексом сопрягающих мембран. Согласно этой гипотезе, энергия ^мН+ необходима не для самой реакции образования АТФ из АДФ и неорганического фос-фата в каталитическом центре Н+-АТ^азы, а лишь для освобождения в раствор вновь синтезированной молекулы АТФ / 7,8 /. Действительно Фельдману и Сигману удалось продемонстрировать синтез прочно-связанного с ферментом АТФ на препаратах Н+-АТФ-азного комплекса в условиях деэнергизации / 9 /. Гидролиз же АТФ, по мнению этих авторов / 9 /, а также Бойера и сотр. / 7,8 / представляет собой обращение соответствующих стадий АТФ-синтетазной реакции.
Н+-АТФ-азные комплексы сопрягающие мембран состоят из двух структурно и функционально отличных компонентов - так называемых факторов 3?0 и j / 10 /. Фактор 3?0 - нерастворимый в воде комплекс гидрофобных белков, формирующий протонпроводящий путь к (или от) фактора j / II /. Фактор j (растворимая у-АТФ-аза), легко отделим от мембраны и фактора 0 и является собственно каталитическим компонентом іГ^-АТ^-азного комплекса / 12 /. Растворимая j-АТФ-аза катализирует те же самые парциальные реакции синтеза АТФ, что и мембраносвязанные препараты Н+-АТФ-азы в отсутствии дліН+ (см.обзоры / 13,14 /), а также синтез прочносвязанного АТФ из АДФ и неорганического фосфата / 15-17 /. Таким образом, ij-АТФ-аза представляется наиболее удобным объектом для исследования механизма кооперативных взаимодействий между каталитическими центрами фермента в процессе гидролиза (синтеза) АТФ.
Целью настоящей работы явилось исследование свойств нуклео-тидсвязывающих центров митохондриальной fj-АТФ-азы. Показано, что адениновые и гуаниновые нуклеозиддифосфаты связываются в каталити-
ческих центрах нативной ?--АТФ-азы, образуя в отсутствии АТФ или ГТФ прочные комплексы с ферментом. При связывании в одном из каталитических центров фермента АДФ, но не ГДФ,наблюдается ингиби-рование АТФ-азной активности.
Реактивация неактивного комплекса ^-АТФ-азы с АДФ может быть достигнута либо медленной АТФ ОТФ)-зависимой диссоциацией АДФ, либо связыванием в каталитическом центре фермента I молекулы Фн в дополнение к АДФ. В то же время, необходимшл условием для связывания ферментом Фн является наличие нуклеозиддифосфата САДФ или ГДФ) в одном из каталитических центров ij-АТФ-азы.
Переход из активного в неактивное состояние наблюдается также для З-^-АТФ-азы, лишенной прочносвязанных нуклеотидов, при одно-центровом гидролизе АТФ. Уменьшение начальной скорости АТФ-азной реакции в этом случае коррелирует с диссоциацией Фн из комплекса фермента с продуктами гидролиза АТФ. Обращение ингибирования также как и в случае нативного фермента достигается связыванием I молекулы неорганического фосфата на молекулу ?д--АТФ-азы.
Исследована локализация центра, осуществляющего одно-центро-вый катализ, при помощи нового фотоактивируемого аналога АТФ - 3-(2'М2-нитро-4-азидобензоил;-аденозин-5'-трифосфата (НАБ-АТФ;. Показано, что этот центр расположен на js-субъединице фермента, как и каталитические центры, функционирующие при стационарном гидролизе АТФ, и, по-видимому, является одним из них.
Из полученных результатов следует, что нуклеозиддифосфаты и неорганический фосфат связываются как в каталитических, так и в некаталитических центрах фермента кооперативно, причем характер кооперативных взаимодействий нуклеотидсвязывающих центров определяется типом гетероциклического основания нуклеотида. Медленные переходы ]--АТФ-азы из активного в неактивное состояние контроли-
руются типом связанного в каталитическом центре нуклеозиддифос-фата, а также связыванием другого продукта ЛТФ-азной реакции - Ф_. На основании полученных данных предложена гипотеза о функциональной неоднородности центров прочного связывания нуклеотидов мито-хондриальной ї^-АТФ-азой: один из "прочносвязанных" нуклеотидов локализован в каталитическом центре, а два других - в некаталитических центрах фермента.
ОБЗОР ЛР1ТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. СТРУКТУРА F-рАТФ-АЗЫ I.I. Молекулярный вес и субъединичный состав iFj-АТФ-азы
Растворимая Pj-АТФ-аза была изолирована из большого количества различных биологических систем, и во всех случаях молекулярный вес целого фермента и составляющих его субъединиц оказывается очень близким. Так, молекулярный вес \--АТФ-азы определенный методами ультрацентрифугирования или гель-фильтрации варьирует для препаратов фермента из различных источников от 320 до 400 КДа (для обзора см./ 18-20 /), В действительности этот диапазон еще меньше, а наблюдаемые различия в величинах молекулярных весов объясняются не столько отличиями препаратов ij-АТФ-азы друг от друга, сколько экспериментальной ошибкой в определении молекулярного веса, обусловленной склонностью фермента к диссоциации на субъединицы на холоду / 21 /.
Значение молекулярного веса, принятое для митохондриальной у-АТФ-азы составляет примерно 360 КДа (см.табл.1;. Для хлоро-пластной ї-рАТФ-азц более достоверной величиной долгое время считалось 320 КДа / 22,23 /. Однако, методом ультрацентрифугирования в присутствии метанола в качестве стабилизирующего агента Иошида и др. / 24 / получили значение молекулярного веса 380 КДа. Еще большее значение - 400 КДа было получено в лаборатории Хаммеса / 257. Авторы пришли к выводу, что заниженные величины молекулярного веса, полученные в ранних работах обусловлены значительной примесью диссоциировавшего на субъединицы фермента в использованных препаратах. В диапазоне 360-380 КДа лежат и данные для наиболее изученных бактериальных -Г-^-АТФ-аз: 360 КДа - для fj;tie-
- 10 -rich і a. coll / 26 / и 380 КДа - для термофильной бактерии Р5 -3 / 24/.
Методом гель-электрофореза препаратов ї-г-АТФ-азн в присутствии ДЦС-N а обычно выявляется 5 хорошо различимых белковых полос (для обзора см. / 18-20,35 /), обозначаемых в порядке убывания молекулярного веса c,j2> ,^, & и . Значения молекулярных весов этих субъединиц препаратов -З-^-АТФ-азы, выделенных из различных источников, лежат в следующих интервалах: о - 53-62 КДа, fi - 50-57 КДа, % - 28-43 КДа, <Г - 12-21 КДа, 6 - 7,5-14 КДа / 18-20,35 /.
Таблица I
Молекулярный вес растворимой митохондриальной iy-АТФ-азы и ее субъединиц
!Т-АТФ--азы
Источник митохондрий
Молекулярный вес .килодальтоны '.Литературный
субъединшы источник
fi
Сердце быка
Сердце быка
Сердце быка
Сердце быка
Печень крысы
Бурнії жир хомяка
Souccharofnuces сепз-
Wsiae
& олскаг-оniyt&s cere-
i/i\ji'cxe
, 380 53 50! 25 12,5 7,5 / 18,27 /
1 347 54 50; 33 17 5,7 / 28 /
: 330 53 50: 25 12,5 7,5 / 29 /
j 394 59 55 29 ІЗ 8,7 / ЗО /
I 380 62 57 36 ~ - / ЗІ /
' 380 56 54 33 13,4 9,5 / 32 /
400 58,5 55 34 10 8,6 /33/
340 58,5 54 38,5 ЗІ 12 / 34 /
Значительное расхождение в опубликованных величинах молекулярных весов субъединиц -г-АТФ-азы обусловлено, по-видимому, несовершенством метода гель-электрофореза в присутствии ДДС-Na, использованного в подавляющем большинстве исследований. Действительно,как
- II -
видно из табл.1, значения молекулярных весов, определенные этим методом, сильно различаются между собой даже для препаратов фермента, выделенного из одного и того же источника.
В ряде случаев были описаны препараты -Г-рАТФ-азы, не содержащие минорных ( о~-, - или , -) субъединщ. Так, Козлов и Микель-саар / 36 /, применяя ультразвуковую обработку митохондрий при рН 5,2 выделили У-рАТФ-азу, не содержащую <$*- и I-субъединиц. Фермент, содержащий лишь о- и jS-субъединвды, причем с одинаковым молекулярным весом, был получен Бикетовым и др. / 37,38 / из анаэробной бактерии LouctaUaciLus case**. В зависимости от методики выделения бактериальные / 39 / и хлоропластные / 40 / Fj-АТФ-азы могут быть получены без 6*-субъединицы. Эти результаты не представляются удивительными, так как предполагается, что минорные субъединицы осуществляют связь между факторами-FJ и 3?0 (см.ниже). По-видимому, в определенных условиях сродство минорных субъединиц к фактору -Fq оказывается выше, чем к JS -субъединицам їрАТФ-азы. Альтернативным объяснением является их потеря во время длительной процедуры очистки.
Резюмируя данные, описанные в главе I.I,необходимо отметить, что выделенные из различных источников ї-рАТФ-азьЕ структурно чрезвычайно похожи между собой. Это полисубъединичные ферментные комплексы, обычно состоящие из пяти типов полипептидов, с общим молекулярным весом 360-380 КДа. Значения молекулярных весов двух больших ft -субъединиц для всех описанных препаратов также близки и лежат в диапазоне 50-60 КДа.
1.2. Стехиометрия субъединиц в молекуле ^--АТФ-азы
Стехиометрия субъединиц в молекуле -Fj-АТФ-азы являлась предметом оживленной дискуссии в течение многих лет. Основная проблема
заключалась в том, сколько копий тав фермента - 2 или 3. Некоторые авторы на основании измерения
площадей пиков, соответствующих различным субъединицам, на элек-
трофореграмме Fj-АТФ-азы, а также на основании сопоставления мо
лекулярных весов отдельных субъединиц и целого фермента пришли к
выводу, что состав митохондриальной ij-АТФ-азн соответствует фор
муле <6ьъ$* /33,41/.
Однако Сениор, анализируя количество 5Н-групп в ij-АТФ-азе
и ее субъединицах, предположил, что I молекула фермента содержит
2о-, 2у- и 2 &-субъединицы / 42 /. Версхур и др. / 43 /, а также
Статтерхейм и др. / 44 /, изучая связывание ауровертина с -Fj-АТФ-
азой и изолированной ft -субъединицей высказали предположение, что
в молекулу фермента входят 2ft-субъединицы. Таким образом, сфор
мировалась альтернативная точка зрения на стехиометрию субъединиц
^j-АТФ-азы 4/^ » что такке примерно соответст-
вует общему молекулярному весу фермента. В пользу этой стехиометрии говорили и данные по ковалентному перекрестному "сшиванию" субъединиц митохондриальной Pj-АТФ-азы бифункциональными реагентами/45 /, а также рентгеноскопическое изучение кристаллов фермента / 46 /.
Исследования последних лет, однако, показали, что стехиомет
рия субъединиц в митохондриальной ij-АТФ-азе все-таки соответст
вует формуле cC^ftsfSb . Такая стехиометрия подтверждается,
например, данными по включению радиоактивной метки в субъединицы
Fj-АТФ-азы из митохондрий Scuuckcxrom^oe-s сегеі/«/ае, выращенных в
среде с добавленными С]-аминокислотами / 47 / и данными по опре
делению количества ^Н-групп в «>-, V-, , -субъединицах этого фер
мента / 48 /. С другой стороны, аналогом адениновых нуклеотито-
дов - р-фторсульфобензоилденозином - могут быть избирательно моди-
- IS -фицированы 3 J> -субъединицы на моль митохондриальной ^-АТ^-азы / 49 /.
Кроме того, были уточнены данные Сениора по содержанию .SH-mnn в сб-субъединвдах ^-АТФ-азы из митохондрий сердца быка / 50 /, а Бичи и сотр. / 51 / показали, что в ранних работах, посвященных
связыванию ауровертіша, авторы использовали завышенный коэффициент
экстинции антибиотика. Сходные опыты по связыванию [ С] -ауровер-
тина, проведенные Винье и сотр. / 52 /, свидетельствуют в пользу наличия трех J> -субъединиц в молекуле -рАТФ-азы. Амзель и сотр.
/ 53 /, исследуя кристаллы т-АТФ-азы из митохондрий печени крысы
х о
методом дифракции рентгеновских лучей с 9 А разрешением, обнаружили, что в каждой симметричной половине молекулы фермента расположены по три глобулы, соответствующие по размеру J,- и yS-субъединицам, тем самым уточнив свои ранние данные / 46 /, полученные с меньшим разрешением. Необходимо отметить и функциональные исследования последних лет, прямо свидетельствующие в пользу того, что в молекуле митохондриальной ij-АТФ-азы имеется шесть нуклеотид-связывающих центров, расположенных лишь на Л- и f> -субъединицах (подробно см.ниже).
Также по три копии ji -субъединиц входят в состав молекулы бактериальной -Fj-АТФ-азы. Так, Р-^-АТФ-аза из термофильной бактерии PS -3 содержит всего три SH-группы, которые титруются только в JL-субъединицах фермента / 54 /. Химическая модификация Fj-АТФ-азы, изолированной из EscheriohfcL ool>i , дициклогексилкар-бодиимидом приводит к ингибированию АТФ-азной активности фермента, которое коррелирует с ковалентным включением в j> -субъединицу I моля ингибитора на моль Fj-АТФ-азы / 55 /. Анализ модифщировэнного фермента методом электрофокусировки в присутствии диссоциирующих агентов выявил, что при полной инактивации всего лишь
- 14 -
30-35$ j3 -субъединиц содержат остаток дициклогексижарбодиимида
/ 56 /. (Модифицированная дициклогексилкарбодиимидом j> -субъеди
ница содержит на один отрицательный заряд меньше, чем нативная).
Другие данные, указывающие на стехиометрию ^bfihY^^ Д^
препаратов бактериальных -АТФ-аз,были получены в опытах по выделению фермента из Escherichia соЫ / 57,58 /, M/'crococcu, s lyjocfaibtf&u>s / 59 /, и PS -3 / 60 /, выращенных на средах, содержащих радиоактивно-меченные аминокислоты или сахара, а также в опытах по реконструкции активной З-^-АТФ-азы из индивидуальных очищенных субъединиц / 61,62 /.
Менее определенная ситуация сложилась к настоящему моменту в случае хлоропластной Fj-АТФ-азы. На основании многочисленных данных, аналогичных приведенным выше, долгое время считалось, что в состав молекулы этого фермента входят две J, - и две ft -субъединицы / 63-66 /. Стехиометрия ^а А, #**. хорошо соответствовала принятому до последнего времени молекулярному весу хлоропластной Tj-АТФ-азы - 320 КДа (подробно см.выше). Однако, проверка этих данных, проведенная независимо в нескольких лабораториях, привела к неожиданному результату: во всех случаях авторы сделали вывод в пользу стехиометрии
Таким образом, можно заключить, что все ^-АТФ-азы, независи-
мо от объекта, из которого они были изолированы, содержат по три копии (/- и f> -субъединиц и одну f -субъединицу. $ - и ,-субъеди-ницы, по-видимому, также представлены одной копией на молекулу фермента, хотя данные по их содержанию в Pj-АТФ-азе не так многочисленны. Кроме того, следует отметить функциональную и структурную негомологичность о - и -субъединиц для различных препаратов фермента. Так, первичная последовательность 6-субъединицы бактериальной и хлоропластной Р-^-АТФ-азы гомологична первичной последовательности о -субъединицы митохондриального фермента / 71,72 /, а бактериальная и хлоропластная о-субъединица - белку, придающему чувствительность митохондриальной Pj-АТФ-азе к олигомицину (0SCP) и ассоциированному с фактором 3?0 / 73 /.
1.3. Функция субъединиц Р-рАТФ-азы
Одним из наиболее продуктивных методов исследования специфических функций субъединиц, входящих в состав Pj-АТФ-азы, является получение фермента, тем или иным способом лишенного соответствующих субъединиц. Впервые Pj-АТФ-азу без Ь - и I-субъединиц удалось получить в нашей лаборатории Козлову и Микельсаару / 36 /. Полученный препарат обладал такой же АТФ-азной активностью и каталитическими свойствами, что и нативная Fj-АТФ-аза, однако не реконструировался с фактором Р0 / 35,74 /. Авторы сделали вывод о том, что об -, J> - и f -субъединицы формируют каталитический центр фермента, a S и t осуществляют контакт между факторами 3?0 и -Fj / 74/.
Позднее справедливость этого вывода была подтверждена Кагавой и сотр. в опытах по реконструкции Р-^-АТФ-азы из термофильной бактерии Р5-3 из индивидуальных очищенных субъединиц / 62,75 /. Для реконструкции активного фермента оказались необходимыми только /-, /,- и ^ -субъединицы / 62,75 /. Авторы также пришли к выводу, что
комплексы oCfi выполняют собственно каталитические функции, а #* -субъединица играет структурную роль в образовании каталитически активных oCfi- комплексов / 75 /. Кагаве и сотр. удалось реконструировать и - -субъединицы с фактором F0 / 76 /. При этом наблюдалось существенное ингибирование протонной проводимости через фактор Q / 76 /. По-видимому, комплекс с> играет роль про-тонпроводящих "ворот" между ?0 и комплексом ^1 fib 1С ж 0СУ~ ществляет структурную связь между протонным каналом и каталитической частью фермента.
Сходные результаты были получены и с ї^-АТФ-азой из Escherichia, ooti. Смешение очищенных препаратов о-, ^-и ^-субъеди-
2+
ниц с последующим диализом против буфера, содержащего АТФ и Мд
привело к реконструкции АТФ-азной активности / 61,77-79 /. Интересно отметить, что наиболее эффективно реконструкция проходила при молярном соотношении о - и -субъединиц в стехиометрии 1:1 / 80 /. В случае ^-АТФ-азы из Lsoh&ichicx col} / 61,81 / и хлоропластной Pj-АТФ-азы / 40,82 / комплекс о, или просто о-субъединица также осуществляют связь между cC^J^bf и фактором Qnблокируют пассивную протонную проводимость последнего.
Другим чрезвычайно эффективным способом выяснения специфической роли субъединиц, входящих в состав ?2-АТФ-азы, является химическая, афинная и фотоафинная модификация фермента. Остановимся сначала на модификации Pj-АТФ-азы фотоактивирующими аналогами нуклеотидов. Для изучения нуклеотидсвязывающих центров фермента были использованы два основных типа фотоафинных меток. Это 8-азидо- и 3-арилазидо-производные адениновых нуклеотидов. В первом случае реакционноспособная азидная группа располагается на
- 17 -пуриновом кольце, а во втором - связана с рибозным остатком нук-леотида через цепь углеродных атомов. Оба класса фотоактивируемых аналогов обладают хорошим сродством к ї-рАТФ-азе и их связывание и/или фотозависимое включение предотвращается адениновыми нуклео-тидами, т.е. модифжация фермента 8-азидо- или з'-адрилазидо производными нуклеотидов может рассматриваться как истинно афинное мечение.
Фотооблучение митохондриальной / 83-85 /, бактериальной / 86 / и хлоропластной / 87,88 / РрАТФ-азы в присутствии 3'-арилазидо-производных АТФ или АДФ приводит к ковалентному включению аналога нуклеотида в сС - и f>-субъединицы фермента. При этом обе субъединицы метятся примерно в одинаковой степени. Также в <- и ^З-субъ-единицы ^ЕрАТФ-азы ковалентно включается после фотооблучения 3'-арилазидопроизводное негидролизуемого аналога АТФ-АМФ-РШ5 / 89 /. Сходные результаты были получены и при использовании другого фото-активируемого аналога АТФ (АДФ), в котором реакционноспособная бензофенольная группа тоже связана с третьим атомом углерода ри-бозного остатка нуклеотида - 3'-0-(4-бензоил)бензоил-АТФ ЩФ) / 90,91 /. Ни в одном случае не описано взаимодействие фотоактивируемых з'-производных нуклеотидов с минорными субъединицами рАТФ-азы.
Фотооблучение митохондриальной рАТФ-азы в присутствии 8-азидо-АТФ приводит к ковалентному включению нуклеотида в />-субъединицу фермента / 92 /. Однако, при добавлении ионов Мд^+ метятся как об- так и jS-субъединицы / 93 /. 8-азидо-АДФ также включается в обе субъединицы Pj-АТФ-азы из митохондрий / 94 /, хлоро-пластов / 95 / и бактерий / 98 / независимо от присутствия ионов Mcj ?. Данные для препаратов- бактериальных -ГрАТФ-аз, однако, противоречивы. Так, 8-азидо АТФ преимущественно включается в ^5-субъ-
- 18 -единицу фермента, выделенного из Micrococcus luteins / 97 / и в об -субъединицу фермента ив термофильной бактерии PS-3 / 98 /. Напротив, 2-азидо-АДФ / 99 / и 8-азидо-1-Лг-этено АТФ / 100 / включаются только в jS-субъединицы х-АТФ-азы. Опять-таки ни в одном случае не описано взаимодействие аналогов нуклеотидов с минорными субъединицами.
Таким образом, из результатов по фотоафинному мечению Pj-АТФ-азы однозначно следует, что нуклеотидсвязывающие центры расположены только на об- и ^6-субъединицах. Однако, на основании вышеизложенных данных нельзя сделать определенного вывода о локализации каталитического центра (центров) на субъединицах фермента. Хотя в ряде случаев ингибирование АТФ-азнои активности коррелирует с модификацией J&-субъединицы / 92,98,100 /, этого явно недостаточно для однозначного заключения о локализации активного центра.
Более определенная информация о расположении каталитических и некаталитических центров на субъединицах -Ут-АТФ-азы была получена в опытах с пршленением химически реакционноспособных аналогов АТФ и реагентов, модифицирующих функциональные группы белков.
Модификация ^-АТФ-азы реакционноспособными аналогами адени-новых нуклеотидов - ^-4-(Н-2-хлорэтил^-метиламино)бензоиламидом АТФ / 101 /, смешанным ангидридом АТФ и мезитиленкарбоновой кислоты / 102 /, р-фторсульфонилбензоиладенозином / 103,105 / приводит к специфическому включению радиоактивно-меченных аналогов в fi-субъединицы фермента и параллельному уменьшению АТФ-азной активности. С другой стороны, включение I моля диальдегидного производного АДФ в оС -субъединицу Fj-АТФ-азы практически не влияет на каталитическую активность фермента / 108 /. Таким образом, можно сделать вывод, что каталитические центры Pj-АТФ-азы расположены на J3 -субъединицах.
Справедливость этого вывода подтверждается данными по химической модификации фермента реагентами, взаимодействующими с функциональными группами белков. Так, Fj-АТФ-азы, выделенные из различных источников, ингибируготся 4-хлор-7-нитробензофуразаном / I07-II0 /, дщиклогексижарбодиимидом / 55,111,112 /, N-этокси-карбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолином / 113,114 /, 1-циклогексил--3-^2-морфолшоэтил)карбодимтадом / 115 / и хинокриновым производным иприта / IIS /. Во всех случаях инактивация сопровождается ковалентным включением ингибитора только в /> -субъединицу фермента. Ингибирования Pj-АТФ-азы, вызванного специфической модификацией оС- или #-субъединицы5в литературе не описано.
На первый взгляд представляется удивительным, почему информация, полученная при помощи фотоактивируемых аналогов АТФ оказывается менее определенной, чем в случае химически реакционноспо-собных аналогов нуклеотидов. Эти различия объясняются, по-видимому, двумя причинами. Во-первых, после фотооблучения возбужденный остаток нитрена может неспецифически реагировать практически с любым аминокислотным остатком белка. В то же время для ковалентного включения химически реакционноспособного аналога АТФ (АДФ) в фермент необходимо наличие соответствующего (обычно нуклеофиль-ного) аминокислотного остатка в непосредственной близости от ре-акционноспособной группы нуклеотида. Действительно, легко представить себе ситуацию, когда в ферменте для нуклеотида доступны как каталитический, так и некаталитический центры, и фотоактиви-руемый аналог будет реагировать с обоими центрами (субъединицами), а химически реакционноспособный - лишь с тем, где в непосредственной близости имеется необходимый аминокислотный остаток.
Второй причиной меньшей специфичности фотоактивируемых аналогов нуклеотидов является локализация по крайней мере одного
из доступных нуклеотидсвязывающих центров ij-АТФ-азы в области контакта об- и f>-субъединиц. Действительно, Шафером и др. / 117 / было показано, что фотооблучение фермента в присутствии З'-арил-азидо-(8-азидо)-АТФ приводит к ковалентному "сшиванию" <- и J&-субъединщ. В тех случаях, когда азидная группа связана с пуриновим кольцо нуклеотида, часто удается наблюдать включение фото-активируемых аналогов только в /-субъединицу (8-азидо-АТФ,2-ази-до-АДФ, 8-азидо-1-Ш -этено-АТФ). С другой стороны, при модификации Згт-АТФ-азы 3'-производными АТФ или АДФ наблюдается ковалент-ное включение аналогов как в о-, так и в fi -субъединицы (см.выше). На основании этого можно предположить, что рибозный остаток АТФ (АДФ), связанного в каталитическом центре,находится в области контакта оС- ж j5-субъединиц. В то же время химически реакционноспо-собные аналоги нуклеотидов / I0I-I03 / взаимодействуют с ферментом в области связывания %-фосфата АТФ и модифицируют только ^5-субъ-единицу Г-г-АТФ-азы.
В заключение этой главы резюмируем данные о специфических функциях субъединиц, входящих в состав --АТФ-азы. Большие об- и
Ji> -субъединицы несут нуклеотид связывающие центры фермента, причем каталитический центр (центры) расположен на ,$-субъединице, а некаталитический - на об . ^-субъединща необходима, по-видимому, для поддержания каталитически активной конформации комплекса ІА
(Г- и & -субъединицы формируют протонные "ворота" фактора ?0 и осуществляют связь с каталитическим компонентом oCbfi^^ Н+-АТФ-азного комплекса.
1.4. Пространственная структура --АТФ-азы
Электронно-микроскопическое исследование препаратов Pj-АТФ-азы, выделенных из митохондрий сердца быка / 118 /, печени крысы
/ 119 /, дрожжей / 34,120 /, а также иг хлоропластов / 121 / и
бактерий / 122-124 /, показало, что фермент представляет собой
о сферическую частицу с диаметром около 100 А. Из приведенных в
о этих работах рассчетов следует, что при диаметре в 100 А белковая
глобула должна обладать молекулярным весом примерно в 300-400 КДа,
что соответствует экспершлентально измеряемым величинам (см.главу
I.I этого раздела). На электронных микрофотографиях видно, что
молекула 3?т-АТФ-азы состоит из шести хорошо различимых глобул с
± о
диаметром около 30 А каждая, расположенных в виде правильного
шестиугольника / II9-I24 /. Они, по-видшлому, соответствуют шести
большим (*/ и J5 ) субъединицам фермента.
Однако, кажущемуся планси-фному расположению ой- ж J>-субъединиц на электронных микрофотографиях противоречат многочисленные данные по модификации ЭЕ^-АТФ-азы бифункциональными "сшивающими" реагентами. Так, Вингфильд и Боксер / 125 /, показали образование сшивок между о--субъединицами фермента, обработанного диметилсуберимидатом, образующим ковалентные "мостики" между 6-аминогруппами лизина. При этом димеров субъединиц типа JJL и J>jh не наблюдалось / 125 /. Винье и сотр. / 126,127 / также не наблюдали образования димеров типа J>Jb при перекрестном "сшивании" субъединиц митохондриальной Fj-АТФ-азы. Сходные результаты были получены к при использовании других бифункциональных сшивающих реагентов / 45,57,64,128,129 /. Из анализа данных, полученных с бифункциональными сшивающими реагентами с различным расстоянием между реакционноспособными группами, следует, что Л -субъединицы в молекуле Pj-АТФ-азы в значительно большей степени сближены между собой, чем ji -субъединицы, что противоречит их кажущемуся пленарному расположению в углах- правильного шестиугольника.
Значительный прогресс в исследовании четвертичной структуры
$у-АТФ-азы был достигнут в последние годы благодаря использованию компьютерной обработки изображений как отдельных частиц, так и тонких кристаллов фермента. Применение этой техники для изучения ми-тохондриальной ij-АТФ-азы / ISO / и ?-АТФ-азы, выделенной из ba,bto&aciIns casei/ 38 /, выявило двуслойное расположение субъединиц в молекуле фермента. Схематическое изображение полученной модели представлено на рис.1. Видно, что шесть субъединиц З^-АТФ-азы располагаются в двух слоях (по три в каждом слое) в вершинах треугольной антипризмы. При этом, имея общую вершину, две треугольные пирамиды, образующие антипризму, развернуты примерно на 60 относительно друг друга. Сходная модель была предложена Шаффером и сотр. / 131 / при наложении изображений ЗЕ-рАТФ-азы,полученных при повороте подложки образца на определенный угол.
Предложенная модель хорошо согласуется с данными по рентгено-
о структурному анализу рАТФ-азы, выполненному с 9 А разрешением
/ 53 /. Амзель и др. / 53 / показали, что фермент состоит из шести морфологических единиц, расположенных в виде двух тримеров, причем пространственное расположение глобул может быть аппроксимировано треугольной антипризмой,
К сожалению, в настоящее время нет данных о взаимном расположении /- и jS-субъединиц в молекуле -Fj-АТФ-азы. Наиболее привлекательной выглядит гипотеза об их расположении в разных слоях таким образом, что при реконструкции У-рАТФ-азы с фактором-Г0 ft-субъединицы оказывались бы ближе к плоскости мембраны (т.е. к протонному каналу), чем X-субъединицы / 132 /. Косвенно в пользу этой гипотезы говорит тот факт, что об-субъединицы легко могут быть экстрагированы из Н+-АТФ-азного комплекса при обработке суб-митохондриальных частиц Li СЕ / 133 /. Остальные белки, входящие в состав Н+-АТЗьазного комплекса,в этих условиях не диссоциируют,так
Рис. I Подборка отдельных молекул митохондриальной Р-рАТФ-азы. Контрастирование уранилацетатом. Увеличение 300 000. Различные проекции предложенной модели показаны в правой части рисунка. Цупрун и др. /130/.
- 24 -как добавление очищенной об-субъединицы восстанавливает каталитическую активность фермента и способность к генерации дйН+ при гидролизе АТФ / IS3 /.
В заключение этого раздела кратко резюмируем основные данные о структурной организации растворимой -Fj-АТФ-азы. Фермент представляет собой полисубъединичный комплекс с молекулярным весом примерно 360 КДа. В его состав входят пять типов полипептидов, обозначенных в порядке убывания молекулярного веса оС,^,у> сГ и в стехиометрии о^з Д ^, . Нуклеотидсвязывающие центры ij-АТФ-азы расположены на больших субъединицах, причем каталитические центры - на jS-субъединицах, а некаталитические - на об-субъединицах, f ,
