Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы стр.10
1.1. Общие сведения о РНК-полимеразе и Транскрипционном цикле стр.10
1.2. Структурные особенности РНК-полимеразы стр.14
1.3. Структурно-функциональная модель активного центра РНК-полимеразы стр.27
1.3.1. Двуметаллический механизм катализа стр.27
1.3.2. Механизм катализа многосубъединичной РНКП стр.29
1.3.3. Характеристика реакции 3'-5'-экзонуклеазного расщепления стр.33
1.3.4. Влияние мутационных замен & fi-субъединице РНКП Е. cot/ на 3'-5'-экзонуклеазную активность стр.35
1.3.5. Молекулярное моделирование активного центра РНКП Е. Colt стр.38
1.4. Ингибиторы РНК-полимеразы. Антибиотики стр.42
1.4.1. Рифампицин стр.42
1.4.2. Тагетитоксин стр.49
1.4.3. Альфа-аманитин стр.53
1.4.4. Специфичность действия аманитина и тагетитоксина стр.56
14.5. Стрептолидигин стр.58
1.4.6, Липиармицин стр.60
1.4.7. МикроцинJ25 стр.62
14.8. Ингибиторы серии CBR703 стр.68
1.4.9. Дауномицин и марселломицин стр. 69
ГЛАВА2. Материалы и методы стр.72
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды стр.72
2.2. Полимеразы стр.72
2.3. Приготовление РНК-полимеразы из клеток стр.72
2.3.1. Выделение РНК-полимеразы E.coli стр.72
2.3.2. Выделение РНК-полимеразы Thermus aquaticus стр.74
2.4. Бактериальные среды стр.75
2.5. Электрофорез стр.76
2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) стр.76
2.7. Метод Ре2+-индуцированного расщепления белка стр.77
2.8. Радиоактивное мечение олигонуклеотидов стр.78
2.9. Транскрипция сТ7А1 промотора, абортивный синтез стр.78
2.10. Транскрипция на искуственных транскрипционных комплексах (нуклеиновокисл отных скаффолдах) стр.79
2.11. Эндонуклеотическое и экзонуклеотическое расщепление, пирофосфорол из стр.80
2.12. Измерение быстрых кинетик реакции элонгации стр,81
2.13. Определение скоростей реакций (Kobs ,Vmax) и константы Михаэлиса (Кт) стр.83
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение стр.85
3.1. Исследование механизма ингибирования бактериальной РНК-полимеразы антибиотиком стрептолидигином стр.85
3.1.1. Стрептолидигин ингибирует присоединение нуклеотида, разделяя злонгационноые комплексы на медленную и быструю фракции стр.86
3.1.2. Характеристика фракций элонгационных комплексов, образующихся в присутствии стрептолидигина стр.88
3.1.3. Стрептолидигин ингибирует внутреннее расщепление РНК, при этом также разделяя комплексы на медленную и быструю фракции стр.92
3.1.4. Присутствие стрептолидигина не изменяет значение Кмдпя входящего нуклеозидтрифосфата стр.93
3.1.5. Стрептолидигин замедляет некую стадию, предшедствующую синтезу фосфодиэфирной связи стр.95
3.1.6. Кристаллическая структура РНКП со связанным с ней стрептолидигином. Модель ингибирования РНКП стрептолидигином и функционирования активного центра РНКП стр.96
3.2. Изучение роли триады остатков аспарагиновой кислоты вдвуметаллическом механизме катализа в активном центре РНК-полимеразы стр.101
3.2.1 Замены остатков Asp в активном центре РНКП делают невозможной промотор-зависимую транскрипцию стр.104
3.2.2. Замены каталитических остатков Asp влияют на связывание /We2+ со свободной РНКП стр.105
3.2.3. Мутантные РНКП частично активны в элонгационном комплексе стр.107
3.2.4. Замены Asp лишь умеренно уменьшают кажущееся сродство каталитического центра к Ме2+ в транскрипционных комплексах стр .111
3.2.5. Расщепление транскрипта мутантными РНКП стр.114
Выводы стр.123
Список цитируемой литературы стр.124
Благодарности стр.142
- Общие сведения о РНК-полимеразе и Транскрипционном цикле
- Дауномицин и марселломицин
- Измерение быстрых кинетик реакции элонгации
- Характеристика фракций элонгационных комплексов, образующихся в присутствии стрептолидигина
Введение к работе
Актуальность проблемы.
ДНК-зависимые РНК-полимеразы (РНКП) осуществляют процесс транскрипции, т.е. создание РНК-копии генов для последующей трансляции. Выделяют три стадии транскрипционного цикла: инициацию, элонгацию и терминацию, при этом непосредственно реакция полимеризации происходит на стадии элонгации. Ключевым этапом процесса элонгации является образование фосфодиэфирнои связи между входящим субстратом (нуклеозидтрифосфатом) и З'-концевым нуклеотидом цепи РНК в активном центре РНКП. Несмотря на множество биохимических и структурных данных, механизм функционирования активного центра РНКП в целом остается не полностью изученным,
Недавно была предложена универсальная модель, по которой реакция образования фосфодиэфирнои связи в активном центре РНКП, также как и другие виды активностей, такие как расщепление РНК, пирофосфоролиз,
происходит при участии двух ионов магния, находящихся в активном центре РНКП (Sosunov et al, 2003). Однако необходима дальнейшая исследовательская работа по проверке и совершенствованию этой модели.
Кроме того, не изучены другие процессы в активном центре, предшествующие образованию фосфодиэфирной связи, и в этом направлении остается огромное поле для деятельности.
Понимание всех этих этапов в работе РНКП необходимо для выяснения механизма функционирования активного центра РНКП в целом.
Помимо чисто научного, понимание функционирования активного центра РНКП несет в себе и практический интерес, особенно в случае бактериальной РНКП, поскольку его можно применить в разработке новых антибиотиков. Цель работы и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение структурно-функциональной организации активного центра бактериальной РНКП. В задачи данного исследования входило;
1. Изучить механизм ингибирования РНК-полимеразы антибиотиком
стрептолидигином, действующим на уровне активного центра.
2. На основе структурных и биохимических данных по ингибированию
РНКП стрептолидигином предложить общую схему
функционирования активного центра РНКП.
3. Произвести проверку универсальной модели двуметаллического
механизма катализа в активном центре РНКП.
Научная новизна.
В работе исследован механизм действия антибиотика стрептолидигина на бактериальную РНК-пол имеразу. Несмотря на то, что этот антибиотик известен уже очень давно (Siddhikol et al.,1969), до настоящего времени исследования механизма его действия детально не проводились. При этом известно, что ингибирование РНКП стрептолидигином непосредственно связано с активным центром РНКП (Severinov et al., 1995), поэтому исследование механизма ингибирования РНКП стрептолидигином представляло существенный интерес в понимании функционирования активного центра РНКП.
В настоящей работе впервые, с помощью структурных и биохимических данных, был детально изучен механизм действия стрептолидигина. Было показано, что стрептолидигин ингибирует РНКП по необычному механизму, когда РНКП, связанная со стрептолидигином остается активной, но скорость реакций, осуществляемых РНКП, сильно снижена. Это первый пример описанного ингибитора РНКП, действующего таким образом, а не полностью инактивирующим РНКП при связывании с ней.
Кроме того, с помощью стрептолидигина впервые было получено свидетельство существования некой стадии процесса элонгации, предшествующей синтезу фосфодиэфирной связи.
На основе результатов данной работы была предложена новая модель функционирования активного центра РНКП.
Также, в данной работе, при помощи мутагенеза была проверена и подтверждена недавно предложенная модель двуметаллического катализа образования фосфодиэфирной связи в активном центре. В этой модели два иона магния координированы в активном центре тремя консервативными остатками аспарагиновой кислоты. В настоящей работе показано, что каждый из трех остатков аспарагиновой кислоты участвует в акте катализа, а также впервые экспериментально показано, что нуклеиновые кислоты принимают серьезное участие в связывании Мд2+ в активном центре. Практическое значение работы.
Понимание каталитического механизма бактериальной РНКП расширяет горизонты для различных стратегий антибактериальной защиты. В частности, изучение стрептолидигина представляет большой интерес, так как этот антибиотик или его производные в перспективе могут найти применение в клинической практике вообще и в борьбе с устойчивыми штаммами бактерий в частности.
Общие сведения о РНК-полимеразе и Транскрипционном цикле
Предполагается, что взаимодействие домена «подвижной заслонки» со специфическими вторичными структурами на РНК-транскрипте, может индуцировать «информационные изменения, приводящие к терминации транскрипции (Toulokhonov et al., 2001).
В месте разделения главного и выходного канала расположена «coited-coil» спираль, лежащая в основании петли, пронизывающей главный канал снизу вверх (рис. 6 А,Б). Эта петля образована консервативным р С районом и носит название «шип» (rudder). Первоначально ей приписывалась функция разделения ДНК/РНК гибрида, однако, изучение свойств РНКП с делецией района, образующего «шип» показало, что эта структура образует стабилизирующие ТЭК контакты с растущей РНК, но не участвует в разделении ДНК/РНК гибрида (Kuzhnedelov et al., 2002). Неподалеку от «шипа» располагается ещё две петли: «крышка» (lid) и «застежка» (zipper), также образованные р -субъединицей, которые также, по-видимому, образуют стабилизирующие взаимодействия с задним дуплексом ДНК (Korzheva et al., 2000; Cramer et al., 2001).
Ещё один канал, так называемый «вторичный канал» в случае бактериальной РНКП и «.пора» в случае РНКП-И, диаметром около 12 А, в котором может располагаться только одна цепь НК, соединяет активный центр с поверхностью РНКП (рис. 4 и рис, 6 Г)- Стенку вторичного канала, отделяющую его от главного канала, образует консервативный район p G, содержащий G-петлю (рис.6 Б), которая, предположительно, участвует в процессе транслокации (Epshtein et al., 2002). Считается, что через вторичный канал в активный центр попадают NTP в процессе элонгации, а также выходит одноцепочечный З -концевой фрагмент РНК, потерявший контакт с активным центром РНКП, в процессе обратного соскальзывания РНКП по ДНК(бэктрэкинга).
На границе главного и вторичного каналов проходит длинная а-спираль, образованная консервативным районом P F (F-bridge helix, F-мостовая спираль), соединяющая противоположные стороны главного канала, непосредственно напротив активного центра (рис. 4). В структурах РНКП-ІІ и Taq РНКП F-мостовая спираль находится в разных конформациях: выпрямленной и согнутой (Cramer et а)., 2001; Zhang et al., 1999). В согнутой конформации участок спирали занимает место входящего нуклеотида в активном центре фермента (і+1 сайт). Считается что стадия транслокации в элонгации состоит из следующих этапов. Когда ТЭК находится в посттранслокационном состоянии, З -конец РНК-транскрипта расположен в / сайте, F-мостовая спираль при этом находится в прямой конформации, входящий комплементарный NTP занимает і+1 сайт. Только в таком (посттранслокационном) состоянии может происходить элонгация, в результате чего ТЭК переходит в претранслокационное состояние: З -конец РНК теперь в і+1 сайте, F-спираль в прямой конформации. Для того, чтобы произошел следующий акт элонгации З -конец РНК должен перейти опять в / сайт. Было предположено, что движение F-спирали вызывает транслокацию, выталкивая З -концевой нуклеотидный остаток РНК из і+1 сайта в / сайт, или сопровождает транслокацию РНКП в каждом новом акте присоединения нуклеотида (рис. 7) (Cramer et al., 2001). Эта гипотеза подтверждается данными по картированию контактов З -конца РНК с РНКП в области активного центра. На основании этих данных и анализа конформационной спирали и, таким образом, ингибирует стадию транслокации РНКП (Epshtein et а!., 2002).
Структурный домен, в составе которого находится «шип», образованный N-концевой частью р субъединицы и С-концевой частью р, носит название «зажима» (clamp). Сравнение трёхмерных структур свободной РНКП и ТЭК показало, что «зажим» может менять свое положение, в результате чего главный канал открывается или закрывается.
Связывание ДНК на стадии инициации приводит к повороту этого домена на 30 и захлопыванию главного канала вокруг РНК/ДНК гибрида. Предполагается, что это движение индуцируется взаимодействием ДНК с несколькими петлями-переключателями (switches), соединяющими «зажим» с остальной частью РНКП (Cramer et al., 2000; Gnatt et al., 2001; Darst, 2001). Всего в основании «зажима» у РНКП-И расположены пять петель-переключателей, которые в свободной РНКП неструктурированы. При взаимодействии с ДНК/РНК гибридом в районе активного центра в петлях-переключателях происходят масштабные информационные изменения. Поэтому захлопывание «clamp» домена может происходить только после того, как синтезировался короткий РНК-транскрипт и образовался ДНК/РНК гибрид (Cramer et al., 2000). При связывании ДНК бактериальной РНКП происходит также изменение положений доменов (31 и р2 р-субъединицы (Korzheva et al., 2000; Ebright, 2000) и другие до конца не изученные конформационные изменения. Недавно были получены новые данные по механизму транслокации РНКП с представлением модели движения (Bar-Nahum et al., 2005). Авторы исследовали роль F-мостовой спирали РНКП в процессе элонгации. Ранее Gnatt et al. (2001) предположили, что F-мостовая спираль обеспечивает движение фермента вперед путем переключения между его изогнутой и прямой конформацией. Скрининг возможных мутаций в Escherichia coli позволил отобрать две мутации в G-петле, которая примыкает к F-мостовой спирали, и было сделано предположение, что эта петля регулирует конформацию F-мостовой спирали. Одна мутация, G1136S, приводила к ускорению процесса элонгации и к тому, что РНКП плохо отвечала на регуляторные сигналы. Другая, I1134V, приводила к замедлению элонгационной активности и к большей чувствительности к регуляторным сигналам. Используя сшивающие агенты, эффективные для либо прямой, либо изогнутой конформации F-мостовой спирали, Bar-Nahum et al. (2005), обнаружили, что 11134 V ограничивала движение F-мостовой спирали путем сдвига в ее изогнутую конформацию, a G1136S потенцировала движение F-мостовой спирали путем ускорения перехода от изогнутой к прямой конформации. Это позволило предположить, что G-петля контролирует движение F-мостовой спирали и управляет движением РНКП.
Дауномицин и марселломицин
Эти соединения были отобранны по их фунгицидной активности. Они являются первыми синтетическими ингибиторами РНК-полимеразы, по-видимому, специфичными по отношению к РНК-полимеразе III. Обнаруженная мутация устойчивости к данным соединениям представляет собой замену остатка G на S в положении, соответствующем положению 927 Р -субъединицы E.coli. Их активность по отношению к РНК-полимеразе E.coli была проверена, Бактериальный фермент оказался устойчив к их действию в концентрации, которая превышала максимальную концентрацию, использованную в работе (Wu et al.,2003).
Микроцин J25 пополнил обширную и разнообразную группу пептидов, обладающих антибактериальным действием. Структуры антибактериальных пептидов разнообразны (Zasloff, 2002). Их можно подразделить на линейные и циклические. Линейные, в свою очередь - на а спиральные (грамицидинА, магаинин), и пептиды с необычным набором аминокислот - одни обогащены остатками Pro и Arg (PR-39), другие - Тгр (индолицидин), третьи - His (хистатины). Циклизация осуществляется посредством образования дисульфидных, пептидных или тиоэфирных связей (Epand and Vogel, 1999). Циклические пептиды во многих случаях имеют р-складчатую структуру (лактоферрицин, полимиксин В). Все антимикробные пептиды синтезируются из предшественников . больших по размеру, включающих сигнальную последовательность. Многие затем подвергаются посттрансляционным модификациям - гликозилированию, амидированию, галогенированию ит.д. (Simmaco et al., 1998). Созревание может включать также циклизацию и даже объединение 2 фрагментов в один пептид (В буфорин) (Tang et al., 1999). Интересно, что многие пептиды, обладающие антибактериальным действием, образуются при расщеплении больших белков с совершенно иной известной функцией, отличной от бактерицидной. Например, лактоферрин, белок, найденный в коровьем молоке, в кислой среде расщепляется пепсином, образуя лактоферрицин В, пептид длиной 25 аминокислотных остатков, обладающий ярко выраженным антибактериальным действием (Bellamy et al.,1992). Сходные с секропином антимикробные пептиды, продуцируемые Helicobacter pylori, представляют собой N-концевые фрагменты рибосомного белка L1 (Putsep et al.,1999). Аналогично, буфорин и ларазин являются N-концевыми фрагментами гистона 2А, образующимися при его протеолизе с помощью пепсина (Kim et al.,2000).
Механизм действия большинства этих пептидов изучен недостаточно. Предполагается, что для многих из них одной из мишеней является клеточная мембрана. Строению клеточной мембраны бактерий присуща характерная особенность, которая отличает ее от строения мембран многоклеточных животных. Бактериальная мембрана устроена таким образом, что ее внешний, обращенный в окружающую среду слой, обогащен отрицательно заряженными фосфолипидами. Внешний слой мембраны клеток растений и животных содержит липиды, не несущие суммарного заряда. Принято считать, что именно фофолипиды являются мишенью специфического действия антибактериальных пептидов, большинство которых катионны.
Поскольку бактериальные пептиды способны проникать сквозь внешнюю и внутреннюю мембраны бактериальной клетки, они могут поражать какую-то внутриклеточную мишень. Накапливается все больше данных, свидетельствующих в пользу этого предположения.
Например, N-концевой район лактоферрина, содержащий антимикробный пептид лактоферрицин, связывается со специфическим сайтом ДНК. Не исключено, что это связывание может каким-то образом регулировать транскрипцию (Kanyshkova et al., 1999). Буфорин II неспецифически связывается с бактериальной ДНК (Park et al., 1998). Аттацины и гловерины подавляют синтез специфических мембранных белков (Axen et al., 1997). PR-39 вызывает арест синтеза ДНК (Boman et al., 1993). Дефенсины участвуют в расщеплении одноцепочечной ДНК (Bateman et al., 1991). Лактоферрицин стимулирует апоптоз эукариотических клеток и вызывает автолиз прокариотических Velasco et al., 1997).
Некоторые другие пептиды, например, хистатины и NAP-2 ингибируют бактериальные ферменты, действуя либо как псевдосубстрат, либо прочно связываясь в активном центре и препятствуя доступу природных субстратов. Хистатины в суб микромолярных концентрациях ингибируют активность трипсиноподобной протеиназы Bacteroides gingivalis (Nishikata et al., 1991). eNAP-2 лошади ингибирует другие бактериальные сериновые протеазы (Couto et al., 1993). Показано также (Kragol et al., 2001), что пептиды пирхокорицин и дрозоцин специфически связываются с бактериальным липополисахаридом и с 70 kDa белком теплового шока DnaK и неспецифически связываются с 60 kDa шаперонином GroEL Было показано, что связывание пирхокорицина и дрозоцина мешает открыванию/закрыванию крышки, расположенной над пептид-связывающим карманом DnaK, В результате этот карман становится недоступным для пептидов и их фолдинг, таким образом, блокируется.
Измерение быстрых кинетик реакции элонгации
Добавление пирофосфата вызывало процессивную деградацию 13А РНК (полоса 5). Инкубация в отсутствие NTP в присутствии Мд2+ приводила к укорочению 13А РНК до 11А вследствие внутренней активности эндонуклеотического расщепления каталитического центра РНКП (полоса 2), при чем эта активность была стимулирована белковыми факторами расщепления транскрипта GreA и GreB (полосы 6 и 7).
Надо заметить, что фактор-зависимое расщепление в скаффолдовых комплексах требовало стехиометрических количеств факторов расщепления. Это не соотносится с данными, полученными на природных элонгационных комплексах, где требовались большие количества Gre (Borukhov et al., 1993). Причина этого различия на данный момент неизвестна, но она может быть вызвана более сильным связыванием факторов Gre с искусственно-собранными ТЭК.
Все три мутанта с Asp/Asn заменами были проверены на их способность удлинять 13А РНК на скаффолде и результаты этой проверки представлены на Рис. 36 Б. Как можно видеть, все три мутанта демонстрировали заметные уровни полимеризации РНК в этой системе. Мутант D462N был самым активным (полосы 11-16). Активность полимеризации РНК мутантными ферментами увеличивалась по мере возрастания концентрации NTP и при повышении температуры (сравните, например, полосы 13 и 15 и полосы 15 и 16 соответственно). Однако даже при 37С и в присутствии 1 мМ NTP ни один из мутантов не был в состоянии полностью удлинить 13А РНК до полноразмерного продукта. Напротив, ДТ РНКП быстро удлиняла 13А РНК до полноразмерного продукта в присутствии 100 мкМ NTP при 21 С (сравните полосы 1 и 2). Активность мутантных РНКП не могла быть объяснена наличием загрязнения от ДТ РНКП, так как загрязняющий фермент должен был полностью удлинять 13А транскрипт. Поэтому мы сделали вывод о том, что мутантный фермент может удлинять РНК в нуклеиновокислотном скаффолде. По сравнению с ДТ РНКП, элонгация мутантным ферментом происходит очень медленно.
Используя нуклеиновокислотные скаффолды, была также проверена активность ранее описанного тройного Asp-Ala мутанта (Рис. 37 В). В отличие от мутанта с одиночной заменой, тройной мутант был полностью неактивен даже при инкубации в течение нескольких часов {Рис. 36 В, полоса 8).
Мы не можем сделать каких-либо выводов о природе сильного дефекта, наблюдаемого в мутантах с одиночными заменами в проведении прямой реакции синтеза РНК, на основании экспериментов, представленных на Рис. 36 В, так как фермент дикого типа проводит реакцию крайне быстро (при 37С в присутствии 1 мМ NTP, то есть в условиях, при которых мутантные ферменты не полностью удлиняли 13А РНК даже после 15 мин инкубации, фермент дикого типа завершал реакцию за несколько секунд). Более того, элонгация 13А РНК мутантными ферментами приводит к появлению множественных продуктов элонгации, делая трудным количественный анализ. Для преодоления этих проблем мы изучали элонгацию 13А РНК в присутствии СТР, который позволяет продвинуться лишь на один шаг. Медленная реакция добавления нуклеотида мутантным ферментом изучалась вручную; быстрая реакция ДТ РНКП изучалась в реальном времени, методом быстроостановленной реакции с использованием быстрого смесителя (рис. 23).
Для определения констант скоростей и значений кажущихся Км (для СТР как субстрата), переход 13А в 14С был изучен как функции времени и концентрации СТР (последняя варьировала в пределах от 1мкМ до 2мМ). Кажущиеся константы скорости для трех мутантов при насыщающих (2мМ) концентрациях СТР представлены в Табл. 3. Как можно видеть, замены в мотиве DFDGD приводили к драматическому уменьшению скорости присоединения нуклеотидов. Построение зависимости скоростей реакции как функции концентрации СТР позволило получить значения кажущейся Км. Замена в мотиве DFDGD незначительно меняет значения кажущейся Ки, которые колебались в пределах от 25 мкМ (D460N) до 200 мкМ (D464N), при этом в ДТ РНКП наблюдалось промежуточное значение (100 мкМ). Ясно, что эти незначительные различия не могут объяснить драматические различия в скоростях реакции между мутантными ферментами и ферментом дикого типа.
Замены Asp лишь умеренно уменьшают кажущееся сродство каталитического центра к Me2 в транскрипционных комплексах.
Возникло предположение, что сильные каталитические дефекты, проявляемые в мутантных ферментах вызваны их неспособностью связывать каталитический Мд2+. Для проверки этой идеи мы определили эффект разных концентраций Мд2+ на реакцию одношагового удлинения 13А РНК. Для того, чтобы избежать хелирования Мд2+ нуклеозидтрифосфатом, эксперимент был выполнен при низкой концентрации СТР. Результаты показывают, что выше 5 мМ Мд2+ не наблюдалось значительной стимуляции и что в относительных терминах, мутантные и ДТ ферменты сходно отвечали на изменение концентрации Мд2+ (Рис.37).
Результат указывает на то, что в нуклеиновокислотном скаффолде замена Asp - Asn приводит к небольшому ( 5 раз) эффекту на связывание Mgz+, кроме того стандартный реакционный буфер содержал ЮмМ Мд2+, поэтому сильный каталитический дефект, наблюдаемый в мутантных ферментах не может быть вызван ослаблением связывания Мд2+.
Характеристика фракций элонгационных комплексов, образующихся в присутствии стрептолидигина
Так как мутантные ферменты образуют активные комплексы с нуклеиновокислотным скаффолдом, мы исследовали влияние замены Asp на скорость пирофосфоролиза (оцененного по скорости накопления множественных продуктов пирофосфоролиза, см. Рис. 37 А, полоса 5), внутреннее расщепление РНК (оцененное по скорости накопления полосы 11 А, см. Рис. 37 А, полоса 2) и фактор Gre-зависимое расщепление (оцененное из скорости накопления полосы 11 А, Рис. 37 А, полосы 6 и 7). Так как реакции расщепления, выполняемые ферментом дикого типа, относительно медленные, характеристические константы скоростей могут быть определены из экспериментов по временной зависимости вручную. Результаты, которые суммированы в Табл. 3, показывают, что деградация РНК драматически уменьшается при всех трех заменах. Однако каждая замена приводит к различной степени остаточной деградационной активности. Например, замена Asp464 уменьшает внутреннее расщепление ниже порога чувствительности метода, в то время как замены в Asp460 и Asp462 дают измеряемые уровни расщепления. Любопытно, что хотя Мп3+ стимулировал прямую реакцию мутантных ферментов больше чем для ДТ РНКП, обратное наблюдалось для внутренней реакции расщепления, что в относительных терминах означает, что дефект мутантного фермента увеличивался в присутствии Мп2+ (Табл.3). Что касается Gre фактор-зависимого расщепления зарождающейся РНК, только мутант Asp464, в котором не представлялось возможным детектировать активность внутреннего расщепления, стимулировался GreA (Табл.3). Однако даже в присутствии фактора скорость расщепления транскрипта мутантным ферментом все же остается медленной по сравнению с ДТ РНКП. Из этих данных мы делаем вывод, что замены в мотиве DFDGD влияют не только на прямую реакцию синтеза РНК, но и на обратную реакцию пирофосфоролиза и внутреннюю реакцию эндонуклеотического расщепления. Этот результат находится в согласии с моделью, которая постулирует, что все виды известных каталитических активностей РНКП определяются ионами Мд2+, связанными в одном и том же каталитическом центре (Sosunov et at., 2003).
Принципиальное наблюдение данной работы состоит в том, что каждая из трех замен Asp/Asn в металл-связывающем центре РНКП вызывает драматическое уменьшение всех видов каталитической активности РНКП (суммировано в Табл.3). Для каждой мутантной РНКП падение каталитической активности было сравнимым с наблюдаемым в односубъединичных полимеразах (таких как ДНК полимераза (ДНКП) I, ДНКП р, HIV обратная транскриптаза и др.), несущих замены в каталитических аминокислотных остатках (Табл.4). Из этого мы делаем вывод, что в многосубъединичных РНКП, каждый член Asp триады напрямую участвует в каталитическом акте.
Каждая из замен вызывала значительное ослабление связывания Ме2+ в свободной РНКП, как это свидетельствовало из неспособности мутантов поддерживать Fe2+ - опосредованное белковое расщепление и из неспособности повышенных концентраций Fe2+ компенсировать дефект. Результаты находятся в согласии с моделью, в которой в свободном уменьшают сродство к Fe2+ по крайней мере в 20 раз. Это находится в хорошем согласии с 30-кратным эффектом, ожидаемым от потери одной координационной связи, как следует из сравнений констант диссоциации Мд2+ и ионов цитрата (Cit3") и оксалата (Охг ) (1СГ4 М и 3x1 О 3 М соответственно (Лурье, 1989)). Интересно, что эти значения близки к ранее определенным константам диссоциации для свободной ДТ РНКП (Mustaevetal., 1997).
В ТЭК кажущаяся потеря сродства к Мд2+, вызванная Asp-Asn заменой, была менее чем 10-кратной. Это может указывать на то, что взаимодействия, осуществляемые Мд2+ в свободной РНКП и в ТЭК, не эквивалентны. Очевидно, что фосфаты входящих NTP и/или 3 -гидроксильные остатки РНК вносят свой вклад в связывание Mg2f в ТЭК и компенсируют дефект, наблюдаемый в свободной РНКП (Рис. 33 Б). В дополнение к этому, общее уменьшение свободной энергии при образовании элонгационного комплекса может также иметь стабилизирующий эффект.
Ясно, что наблюдаемые уменьшения сродства к ионам Ме2+ у мутантных ферментов количественно не могут отвечать за наблюдаемое драматическое падение каталитической активности (Табл.3), Действительно, увеличение концентрации Мд2+ не восстанавливает каталитические функции мутантов. Другими словами, даже в условиях насыщения мутантного фермента Мд2+ его активный центр функционирует неправильно. Каждая из замен вызывает лишь небольшие изменения в кажущийся Км для входящего СТР, которые не могут быть ответственными за наблюдаемые падения каталитической активности. Эти наблюдения показывают, что изученные замены должны влиять на химию образования фосфодиэфирной связи, наиболее вероятно через изменение ориентации каталитических ионов Мд2+ в активном центре. Механистическая интерпретация разнообразий каталитической активности, проявляемой мутантными ферментами, лежит за пределами разрешения нашего современного генетического и биохимического анализа и требует структурного анализа.
Ранее (Sosunov et al., 2003) была предположена универсальная модель активностей многосубъединичной РНКП, в соответствии с которой все реакции деградации и синтеза, наблюдаемые в ТЭК идут с использованием двух одинаковых ионов Мд2+, координированных той же самой триадой Asp. В согласии с моделью, пирофосфоролиз, который в действительности представляет собой обращение реакции полимеризации, драматически замедлялся в результате точечной замены в мотиве DFDGD, изучаемом в данном исследовании. В более существенной степени замены также уменьшали внутреннее расщепление РНК в ТЭК. Это в значительной мере укрепляет точку зрения, что эндонуклеазная реакция механистически связана с полимеризацией и пирофосфоролизом и обеспечивается теми же Asp остатками в активном центре. В опытах также наблюдался сильный ингибирующий эффект замен остатков Asp на GreA, GreB-опосредованное расщепление РНК, что находится в согласии с точкой зрения (Sosunov et al., 2003), что белки Gre просто стимулируют активный центр фермента путем подачи дополнительных карбоксилатных остатков для координации слабо связанного Мд2+ П.
