Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литературы CLASS 15
1.1. Структура и функции гликозаминогликанов 15
1.2. Взаимосвязь обмена гликозаминогликанов с процессами детоксикации ксенобиотиков 19
1.3. Возрастные изменения биохимических процессов в печени 33
1.4. Возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови 43
1.5. Изменения белкового спектра при беременности 46
1.6. Теории старения и возрастные изменения биохимических показателей кожи 51
1.6.1. Генетическая теория старения 51
1.6.2. Свободнорадикальная теория старения 52
1.6.3. Элевационная теория старения 53
1.7. К вопросу о локализации биосинтеза полисахаридов и его связи с генетическим аппаратом клетки 65
1.8. Заключение по обзору литературы 76
Глава 2. Объекты и методы исследования . 77
Глава 3. Возрастная динамика содержания и метаболизма гликозаминогликанов 106
Глава 4. Влияние глюкозы на содержание гликозаминогликанов в ядерной фракции печени крыс 138
Глава 5. Исследование локализации биосинтеза гликозаминогликанов и его динамики с применением ,4с-глюкозы, меченной по с, 145
Глава 6. Квантово-химическии анализ образования водородных связей между основаниями днк и различными химическими группами полисахаридов 148
Глава 7. Дот-гибридизация полисахаридов с пурин- пиримидиновыми зондами 154
Глава 8. Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов, белка и нуклеиновых кислот в коже у женщин 170
Глава 9. Возрастные изменения фракционного состава белков в сыворотке крови женщин 181
Глава 10. Сопоставление возрастной динамики фракционного состава белков сыворотки крови у женщин с аналогичными показателями при беременности 193
Глава 11. Возрастная динамика биохимических показателей печени и фракционного состава гликозаминогликанов в сыворотке крови у женщин 206
Глава 12. Возрастная динамика биохимических показателей печени в сыворотке крови и биополимеров в коже у женщин . 221
Глава 13. Влияние препарата плацентарных гликозаминогликанов на процессы репаративнои регенерации 232
13.1. Качественная оценка влияния плацентарных ГАГ на репара-тивную регенерацию кожи 232
13.2. Количественная оценка влияние плацентарных ГАГ на репа-ративную регенерацию кожи. 236
13.3. Влияние плацентарных ГАГ на транскрипционную активность фибробластов, лимфоцитов и моноцитов в экспериментах in vitro. 239
Глава 14. Сведения об эффективности применения препарата «плазан» в медицине и дерматокосметологии 240
14.1. Применение препарата «Плазан» в хирургии 240
14.2. Применение препарата "Плазан" в гинекологии 243
14.3. Сведения об эффективности применение плацентарных гли-козаминогликанов в составе лечебно-профилактических средств в
дерматокосметологии 257
Заключение 263
Выводы 271
Практические рекомендации 273
Список цитированной литературы 274
Ср приложение ... 298
- Возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови
- Возрастная динамика содержания и метаболизма гликозаминогликанов
- Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов, белка и нуклеиновых кислот в коже у женщин
- Качественная оценка влияния плацентарных ГАГ на репара-тивную регенерацию кожи
Введение к работе
Актуальность работы. Биохимические механизмы адаптации организма к патологическим состояниям, неблагоприятным воздействиям со стороны окружающей среды, возрастным и физиологическим изменениям, например, таким как состояние беременности, в течение последних десятилетий постоянно привлекают внимание исследователей с целью создания средств, повышающих адаптационные возможности организма. В этом отношении недостаточно изучена роль гетерополисахаридов - гликозаминогликанов (ГАГ) (прежнее наименование "кислые мукополисахариды"), содержащих в своем составе гексозами-ны, гексозы и гексуроновые кислоты (Кочетков Н.К., 1967), подразделяющихся в основном на гиалуроновую кислоту (ГК), хондроитинсульфаты (ХС) и гепа-рансульфаты (ГС).
ГАГ содержатся в межклеточном матриксе, клеточных мембранах (Hunter G.K., Heersche J.N.M., Aubin J.E.,1983; Vogel K.G., Dolde J.,1979; Vogel K.G., Peterson D.W.,1981), а также в ядрах клеток в виде ассоциированных с хроматином протеогликанов (Onarheim Н., Missavage А.Е., Gunther R.A. et al., 1991; Stein G.S., Roberts R.M., Davis J.L. et al.,1975). В настоящее время известно (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Фукс Б.Б., Фукс Б.И.,1968), что ГАГ в составе протеогликанов соединительной ткани обеспечивают ее механические свойства, участвуют в воспалительных реакциях (Лабори Г., 1970) и репаративных процессах (Слуцкий Л.И., 1969), необходимы для нормального кроветворения (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Агафонов В.И. и др., 1995; Северин М.В., Юшков Б.Г., Ястребов А.П.,1993; Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Большаков В.Н.,1988) и полноценного иммунного ответа (Соловьев Г.М., Петрова И.В., Ковалев СВ., 1987), выполняют за счет влияния на проницаемость веществ в клетки трофическую и антитоксическую функции (Лабори Г., 1970). Следует подчеркнуть, что традиционные представления о механизмах антитоксических эффектов ГАГ основываются на их полианионных возможностях связывать гидрофильные токсические вещества основного характера в межклеточном матриксе, блокируя тем самым их поступление в клетки (Лабори Г., 1970; Переверзев А.Е.,1986).
Этот механизм не представляется исчерпывающим в связи с общностью метаболических путей обмена ГАГ, пентозофосфатного цикла, детоксицирую-щих реакций глюкуронидной конъюгации (Парк Д.В.,1973) и монооксигеназ-ной системы (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А.,1986).
Не вызывает сомнений, что именно механизмы устойчивости к ксенобиотикам определяют возможность самого выживания организмов в окружающей среде, которая становится все более насыщенной невероятным количеством разнообразных химических соединений. То есть, проблема адаптации организма к неблагоприятным ситуациям во многом может быть сведена к общебиологической способности клетки защищать себя от токсического воздействия экзогенных и эндогенных токсикантов, используя в качестве щита гетерополисаха-ридные компоненты межклеточного матрикса (Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., 2004).
Однако участие в процессах детоксикации, как уже отмечалось, только часть функций ГАГ в рамках глобального явления адаптации. Источники литературы свидетельствуют, что в организме человека с возрастом отмечаются морфологические и физиологические изменения, являющиеся следствием биохимических сдвигов. Данные литературы констатируют наличие возрастных изменений концентраций низко- и высокомолекулярных эндогенных соединений в органах и тканях организма человека и животных. Однако наблюдения авторов фрагментарны и часто противоречат друг другу. Так, например, не существует однозначного мнения о биохимических механизмах старения и их регуляции, о направленности обусловленных возрастом концентрационных сдвигов содержания альбуминов и глобулинов в крови, фракций ГАГ и ДНК в коже.
Не вызывает сомнений, что качество обмена биополимеров в организме во многом зависит от токсической нагрузки на него экзо- и эндогенных соединений, метаболизирующихся в реакциях микросомального окисления и различных типов конъюгации и, тем самым, отвлекающих на себя метаболические по токи субстратов и макроэргических соединений, а также загружающих бело-ксинтетический и каталитический аппараты клетки. Очевидно, что такие физиологические состояния как старение и беременность в силу различных причин сопровождаются интоксикацией. В указанной связи возникает закономерное предположение о наличии определенного сходства в направленности биохимических сдвигов при этих состояниях. В пользу этой гипотезы свидетельствуют, например, сведения различных авторов об уменьшении концентрации альбумина в сыворотке крови, как при старении (Маршалл В.Дж., 2002; Пименов Ю.С., 1993; Кипшидзе Н.Н., Ткешелашвили Л.К., Салуквадзе Н.С., 1963; Коркушко О.В., 1963; Нагорный Л.В., Никитин В.И., Буланкин И.И., 1963), так и при беременности (Кухта В.К., 1986).
В конце восьмидесятых годов прошлого века в руководимой нами лаборатории биотехнологии Отдела биохимии и цитохимии Уфимского научного центра РАН был разработан лекарственный препарат «Плазан», представляющий собой высокомолекулярную фракцию биополимеров из плаценты человека, основным компонентом которой являлись гетерополисахариды из класса ГАГ. В экспериментах на животных была продемонстрирована способность плазана стимулировать синтез РНК, подавлять рост патогенных микроорганизмов, значительно ускорять процессы репаративной регенерации. После успешного проведенных доклинических исследований безопасности препарата и получения разрешения на клиническую апробацию в начале девяностых годов была показана высокая терапевтическая эффективность плазана при лечении хирургических и гинекологических заболеваний.
В последующие годы плазан успешно использовался в качестве биологически активной добавки в изделиях лечебно-профилактической косметики, существенно улучшая у пациентов состояние кожных покровов и корригируя внешние проявления старения кожи. Именно в этот период середины девяностых годов стала очевидной взаимосвязь между качеством обмена ГАГ и функциональным состоянием кожи у человека, послужившая толчком к выполнению настоящих экспериментальных исследований, направленных на выяснение биохимических механизмов старения организма, сопряженных с обменом ГАГ. На наш взгляд, выполненная работа является примером того, как выяснение биохимических механизмов, лежащих в основе фармакологической активности препаратов, позволяет получить новую информацию о сути общебиологических процессов. В нашем случае исследование фармакологической активности ГАГ проливает свет на ранее неизвестные стороны метаболизма биополимеров и патохимических механизмов старения организма в целом. В указанной связи сведения о терапевтической эффективности плазана в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных и в клинике вынесены в заключительную часть работы, так как используются в качестве дополнительного подтверждения основной гипотезы исследования.
В связи со сказанным, основной гипотезой нашей работы являлось предположении о том, что патохимические механизмы старения сопряжены с изменением обмена таких биополимеров как гликозаминогликаны, белки и нуклеиновые кислоты. В качестве объекта исследования мы, помимо лабораторных животных, намеренно выбрали женскую популяцию по двум причинам: во-первых, на наш взгляд, характеристика «практически здоровые лица» в старческом возрасте больше соответствует женщинам и, во-вторых, если говорить о прикладном аспекте наших исследований, то есть о прикладной геронтологии и дерматокосметологии, то женская популяция в силу исторически сложившейся структуры социальных отношений, системы культурных ценностей и норм поведения больше заинтересована в создании средств, корригирующих патологические изменения при старении.
Целью настоящей работы является теоретическое и экспериментальное обоснование значимой роли гликозаминогликанов и других биополимеров в биохимических процессах возрастных изменений, уточнение патохимических механизмов старения и разработка подходов к их направленной коррекции.
Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:
1. Изучить фракционный состав гликозаминогликанов в органах и тканях неин-бредных белых крыс.
2. Оценить интенсивность метаболизма в органах и тканях различных фракций ГАГ по интенсивности включения радиоактивного сульфата (35S042 ) и 14С-глюкозы, меченой по Сь у лабораторных животных различных возрастных групп.
3. Квантово-химическими и молекулярно-генетическими (дот-гибридизация) методами оценить возможность взаимодействия карбоксильной и гидрокси-метильной групп моно- и полисахаридов с генетическим аппаратом клетки.
4. Изучить фракционный состав ГАГ и белков в сыворотке крови у женщин различных возрастных групп.
5. Изучить фракционный состав ГАГ, уровни общего белка и ДНК в коже у женщин различных возрастных групп.
6. Исследовать возрастную динамику состояния печени по показателям «печеночных проб» у женщин.
7. Сопоставить возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин с аналогичными показателями в динамике беременности.
8. Оценить возможность стимуляции ГАГ транскрипционных процессов (синтеза РНК) и репаративной регенерации в целом.
9. Методами корреляционного, регрессионного, дисперсионного, факторного и кластерного анализов изучить взаимосвязи и взаимовлияния изучаемых показателей, описать их математически с помощью уравнений линейной регрессии, а также выявить латентные переменные и их конструкты.
10. Оценить принципиальную возможность патогенетически обоснованной коррекции негативных возрастных биохимических сдвигов.
11. Разработать концепцию дестабилизации системы гликозаминогликанов как одного из общих механизмов старения.
12. Обосновать возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.
13. Показать возможность практического использования результатов экспериментальных исследований биохимических механизмов фармакологической активности ГАГ в хирургии, гинекологии и дерматокосметологии.
Научная новизна. Проведенные исследования позволили существенно расширить представления о биохимических механизмах, лежащих в основе старения, сопоставить их с побочными эффектами беременности и выявить взаимосвязь с генетическим аппаратом клетки. При этом установлены зависимости между возрастом и показателями содержания в органах и тканях глико-заминогликанов, белков, а также их фракций и нуклеиновых кислот. Показано сходство сдвигов исследованных биохимических параметров при старении и беременности. Разработаны методические подходы к формированию оптимальных концентраций гиалуроновой кислоты в органах и тканях для профилактического применения с целью повышения резистентности организма к возрастным изменениям биохимических процессов. Предложена концепция дестабилизации системы гликозаминогликанов как одного из общих механизмов старения, заключающегося в том, что с возрастом нарушается генетически детерминированный обмен биополимеров межклеточного матрикса, приводящий к обеднению гликозаминогликанами органов, покровной ткани и повышением вследствие этого их концентрации в сыворотке крови. В экспериментах по изучению биохимических механизмов фармакологических эффектов гликозаминогликанов (и в частности, препарата «Плазан») установлено, что в их реализации существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности клеточных ядер, обеспечивающая интенсификацию репаративной регенерации тканей и антимикробной активности иммунокомпетентных клеток.
Практическая значимость выполненного исследования заключается в том, что показана принципиальная возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов путем определения фракционного состава гликозаминогликанов, белков в сыворотке крови с последующей подстановкой результатов в соответствующие уравнения линейной регрессии. Сопоставление данных биохимических исследований механизмов метаболизма гликозаминогликанов и результатов клинических испытаний препарата «Плазан», содержащего плацентарные ГАГ, при хирургических и гинекологических заболеваниях позволяет рекомендовать проведение дальнейших исследований с целью расширения показаний к применению плацентарных ГАГ и, в перспективе, широкого внедрения препаратов на их основе в практическое здравоохранение и дерматокосметологию. На защиту выносятся следующие научные положения:
1. В патогенезе старения существенное значение имеет снижение генетически детерминированного синтеза организмом несульфатированных и сульфати-рованных гликозаминогликанов.
2. Существуют возрастные различия во фракционном составе гликозаминогликанов и белков в органах и тканях у подопытных животных, а также в сыворотке крови и коже у женщин.
3. Существуют возрастные различия показателей состояния печени у женщин.
4. Существуют возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин, сопоставимые с аналогичными показателями в динамике беременности.
5. В норме в организме существуют взаимосвязи и взаимовлияния показателей возраста, беременности и обмена биополимеров.
6. Существует принципиальная возможность коррекции негативных возрастных биохимических сдвигов путем стабилизации обмена биополимеров межклеточного матрикса.
7. В биохмическом механизме фармакологической активности гликозаминогликанов существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности ядер клеток, обеспечивающей интенсификацию репаративной регенерации тканей и антимикробной активности иммунокомпетентных клеток.
8. Дестабилизацию системы гликозаминогликанов правомерно рассматривать в качестве одного из общих механизмов старения организма.
9. Существует возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на IV Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik internationai»(MocKBa,2005), на II Всероссийском симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные, аспекты тканевой терапии» (Самара, 2004), на IV Международном конгрессе по эстетической медицине (Москва, 2004), на III Международном форуме по пластической хирургии и дерматокосметологии (Москва, 2004), на III Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international» (Москва, 2004), на Международной конференции «Профессиональная косметика и современные технологии в эстетической косметологии» (Санкт-Петербург, 2004), на Международном форуме по пластической хирургии и дерматокосметологии (Москва, 2003), на II Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international» (Москва, 2003), на IV конгрессе по пластической, реконструктивной и эстетической хирургии (Ярославль, 2003), на IV Коференции «Косметология будущего — косметология antu-age» (Санкт-Петербург, 2003), на X Юбилейной научно-практической конференции «Клиническая эффективность нелекарственных оздоровительных продуктов: пара-фармацевтики, нутрицевтики, космецевтики» (Москва, 2003), на VII Всероссийской конференции по проблеме термических травм (Челябинск, 1999), на IV Съезде травматологов и ортопедов России (Нижний Новгород, 1997), на Научной конференции «Люминесцентный анализ в медицине и его аппаратурное обеспечение» (Рига, 1988), на Международной конференции «Медицина и катастрофы» (Уфа, 1990), на Научно-практической конференции «Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов (Уфа, 1989).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 54 научные работы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 334 страницах, содержит 125 таблиц, 79 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, предметов и методов исследования, 14 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 235 источников, из которых 132 отечественных и 103 иностранных авторов.
Возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови
Обмен гликозаминогликанов в организме тесно сопряжен с обменом других биополимеров, в частности, белков. Подчеркнем, что гликозаминогликаны находятся в организме в комплексе с белками, а именно: в составе протеогли-канов, имеющих белковый кор и ковалентно связанные с ним линейные полимеры ГАГ. Рассматривая возрастную динамику содержания ГАГ в органах и тканях, представляется целесообразным изучить ее сопряженность с изменениями белковых показателей при старении.
В 50-е - 70-е годы 20 века было проведено большое количество исследований, посвященных изучению возрастных сдвигов биохимических показателей в органах и тканях (Слуцкий Л.И., 1969), однако при этом малое внимание уделялось такой важной ткани организма как кровь: считалось, что это — достаточно стабильное образование. По нашему мнению, интегральный процесс старения не может не воздействовать на систему крови. Представляется важным, что выявление интегральных возрастных изменений биохимических показателей крови позволит углубить представления о патогенетическом механизме старения по аналогии с тем, как разработка теории стресса Г. Селье позволила уточнить патогенез многих заболеваний.
Доказано, что с возрастом в сыворотке крови повышается концентрация таких веществ как глюкоза, щелочная фосфатаза, мочевая кислота, холестерин, уменьшается содержание общего белка и альбуминов (Маршалл В.Дж., 2002). Однако сведения относительно возрастной динамики других фракций сывороточных белков довольно противоречивы.
К белкам плазмы крови относится группа белков, удовлетворяющих следующим требованиям:
1) содержатся в плазме крови;
2) синтезируются в печени или ретикулоэндотелиальной системе (реже в специализированных тканях);
3) проявляют основную функцию в пределах сосудистой системы;
4) в кровь секретируются, а не попадают в результате повреждения тканей;
5) находятся в плазме в концентрации большей, чем в других биологических жидкостях.
Содержание различных белков в плазме колеблется в широких пределах. Например, концентрация альбумина составляет 40 г/л. Около десяти белков составляют примерно 90% количества всех белков плазмы. На остальные 10% приходится свыше 100 различных белков, содержание некоторых может быть в пределах всего 50-200 мкг/л. Это - так называемые минорные белки. Большинство белков плазмы крови являются гликопротеинами. Исключение составляют лишь альбумин и небольшое число других белков и ферментов плазмы. При электрофорезе на ацетатцелюллозе обычно происходит разделение пяти основных фракций белков сыворотки крови. Выделяют фракции альбумина, альфа 1-, альфа 2-глобулинов, бета- и гамма- глобулинов (Галь Э, Медьеши Г., Верецкеи Л., 1982).
Альбумин — в количественном отношении наибольшая и самая однородная фракция белков плазмы. В организме альбумин выполняет следующие функции: транспортную, регулятора коллоидно-осмотического давления плазмы, белкового резерва организма. Одной из основных особенностей альбумина является способность связывать большое число различных соединений. Среди этих соединений - жирные кислоты, стероиды, билирубин, гемин, органические красители, лекарственные препараты (салицилаты, сульфаниламиды, барбитураты, антибиотики), ионы кальция, меди и другие. В плазме содержится 35-55 г/л альбумина. Этот белок синтезируется в печени со скоростью 10-12 г в сутки и примерно столько же разрушается, причем 20% в желудочно-кишечном тракте.
Большинство белков острой фазы входят в группу альфа-глобулинов. Их концентрации нарастают в остром периоде заболевания, когда имеет место воепаление, аллергия или деструкция (Меньшиков В.В., 1982). В зоне альфа 1-глобулина располагаются следующие главные белки: альфа 1-антитрипсин, альфа-липопротеид, альфа-1-кислый гликопротеин, протромбин, тиреоид-связывающий глобулин (Кухта В.К., Олецкий Э.И., Стожаров А.Н., 1986), альфа 1-антихимотрипсин, Gc-глобулин, промежуточный альфа-ингибитор трипсина. Альфа-1-антитрипсин является ингибитором протеиназ, синтезируется гепатоцитами, физиологическая концентрация в сыворотке крови составляет 2-4 г/л. Альфа-1-кислый гликопротеин (орозомукоид) синтезируется в печени, в плазме его содержание составляет по данным Кухты В.К., Олецкого Э.И., Сто-жарова А.Н. (1986) 0,6-0,9г/л, а по сведениям Меньшикова В.В. (1982) - 0,55-1,4 г/л.
Альфа-1-антитрипсин и орозомукоид - белки острой фазы воспаления. Альфа-1-липопротеид осуществляет транспорт холестерина и жирорастворимых витаминов, относится к липопротеидам высокой плотности (ЛПВП). Протромбин является фактором свертывания крови, его физиологическая концентрация составляет 0,05-0,1 г/л. Тиреоидсвязывающий глобулин осуществляет транспорт тироксина, его концентрация в плазме достигает 0,015 г/л. Концентрация альфа-1-химотрипсина составляет 0,3-0,6 г/л, Gc-глобулина — 0,2-0,55 г/л; промежуточного альфа-ингибитора трипсина — 0,2-0,7 г/л (Меньшикова В.В., 1982). Общее содержание альфа 1-глобулинов колеблется от 1 до 4 г/л при солевом фракционировании или 2,5-5% от общего содержания белка по данным электрофореза (Хмелевкий Ю.В., Усатенко O.K., 1987).
К альфа-2-глобулинам относятся - альфа 2-макроглобулин, гаптоглобин, це-рулоплазмин, альфа 2-Н8-гликопротеид, альфа-липопротеид, эритропоэтин (Кухта В.К., Олецкий Э.И., Стожаров А.Н.,1986), суммарное содержание альфа-2-глобулинов составляет 4-12 г/л, или 7-13 % от общего белка (Хмелевкий Ю.В., Усатенко O.K., 1987). Альфа-2-макроглобулин — один из самых больших по размерам гликопротеинов плазмы крови. Синтезируется в печени, в плазме содержится в физиологической концентрации 2-3,5 г/л, является ингибитором протеиназ широкого спектра действия. Гаптоглобин связывает свободный гемоглобин крови и тем самым предупреждает потерю железа, в норме его концентрация составляет 0,4-0,75 г/л (Хмелевкий Ю.В., Усатенко O.K., 1987), а по сведениям Кухты В.К., Олецкого Э.И., Стожарова А.Н.(1986) - 0,6 -1,8 г/л. Це-руплазмин обеспечивает транспорт ионов меди, его концентрация составляет 0,3-0,6 г/л. Содержание альфа-З-Ш-гликопротеида колеблется от 0,4 до 0,85 г/л (Меньшиков В.В, 1982).
Четыре вышеперечисленных белка относятся к белкам острой фазы. Во фракции альфа-2-глобулина обнаруживаются ЛПОНП и хиломикроны (Кухта В.К., Олецкий Э.И., Стожаров А.Н., 1986). Самая богатая липидами группа белков-это бета-глобулины. В этой фракции содержится около 75% всех липидов плазмы и только от 8 до 14 % всех сывороточных белков. По данным солевого фракционирования ее концентрация колеблется в пределах 5-11 г/л (Хмелевкий Ю.В., Усатенко O.K., 1987).
Возрастная динамика содержания и метаболизма гликозаминогликанов
Исследовали образцы печени, мозга и кожи крыс различного возраста (3, 6, 12 и 24 месяца). Определяли содержание гликозаминогликанов, несульфати-рованных и сульфатированных ГАГ, а также интенсивность включения радио-активного сульфата ( SO4 ") во фракцию сульфатированных ГАГ. Полученные результаты представлены в таблице 3.1. Статистически значимые различия между средними значениями показателей представлены в таблицах 3.2 — 3.13.
Содержание гликозаминогликанов в печени крыс достоверно уменьшалось с возрастом (табл. 3.3) и составило в сравнении с трехмесячными животными в остальных группах соответственно 85,1%, 75,3%, 64,2% (табл. 3.1 и 3.2). Различия в показателях между 6- и 24-месячными животными составили 1,33 раза.
В таблице 3.4 представлены значения вероятностей различий средних значений содержания ГАГ в мозге крыс различного возраста. Полученные значения позволяют на высоком уровне значимости (Р = 0,014207) отвергнуть гипотезу о сходстве показателей у 3- и 24-месячных животных и констатировать снижение ГАГ в мозге на 15,5% (табл. 3.1 и 3.2).
Наибольшее количество статистически достоверных возрастных различий в концентрации ГАГ отмечалось в коже подопытных животных (табл. 3.5). Так, по сравнению с 3-месячными крысами, уровень ГАГ снижался у 12-месячных животных в 1,31 раза, а у 24-месячных - в 1,70 раза (табл. 3.1 и 3.2). Различия между 6-месячными и 12-месячными составили 15,3%, а между 6- и 24-месячными - 34,6%. Содержание ГАГ в коже 12-месячных крыс превышало в 1,30 раза этот показатель у 24-месячных животных.
В печени подопытных животных с возрастом снижалось содержание несульфатированных (НС) ГАГ, то есть гиалуроновой кислоты (табл. 3.6 и 3.7). По сравнению с 3-месячными животными у 12- и 24-месячных этот показатель был снижен соответственно на 35,5% и 61,5% (табл. 3.1 и 3.2). У 24-месячных крыс уровень НС ГАГ был меньше, чем у 6- и 12-месячных на 50,9% и 40,4%.
Показатели НС ГАГ в мозге также снижались в зависимости от возраста, однако их динамика была менее выраженной по сравнению с аналогичными процессами в печени (табл. 3.6 и 3.8). Статистически значимые различия наблюдались только между группой «3 месяца» и группами «12- и 24 месяца». Уменьшение показателей составило соответственно 22,6% и 32,1%.
Наиболее выраженное возраст-зависимое уменьшение концентрации несульфатированных ГАГ наблюдалось в коже подопытных животных. Следует подчеркнуть, что статистически значимые различия по этому показателю наблюдались во всех сравниваемых группах (табл. 3.6 и 3.9). Так, у 3-месячных животных уровень НС ГАГ был выше, чем у 6-, 12- и 24-месячных соответственно в 1,37; 1,78 и 3,16 раза. У 6-месячных показатели были выше, чем у 12- и 24-месячных в 1,30 и 2,31 раза. Уровень НС ГАГ у 12-месячных крыс был выше, чем у 24-месячных в 1,77 раза.
Представляется важным, что в мозге животных снижение содержания доли несульфатированных ГАГ было достаточно небольшим и составило 9,1 % (табл. 3.6). В печени доля НС ГАГ уменьшилась более значительно: на 22,1%. Наиболее выраженным было уменьшение доли НС ГАГ в коже, которое составило 28,4%.
Временная динамика содержания сульфатированных ГАГ в печени, мозге и коже крыс представлена в таблице ЗЛО. В печени (табл. 3.11) и мозге (табл. 3.12) статистически значимых различий между сравниваемыми группами не наблюдалось. Значения вероятностей сходства групп, рассчитанные при помощи t-критерия Стьюдента, достигали очень больших значений.
Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов, белка и нуклеиновых кислот в коже у женщин
Исследовали 50 образцов кожи женщин в возрасте от 15 до 90 лет. Сводные результаты по основным обследованным группам представлены в таблице 8.1.
В соответствии с классификациями, принятыми в геронтологии и возрастной психологии (Маралов В.Г., 2002), мы достаточно условно распределили данные по возрастным градациям: 40-50 (зрелость), 50-60 лет (кризис зрелости), 60-70 лет (пожилой возраст), 70-80 лет (ранняя старость) и 80-90 лет (поздняя старость). Помимо содержания белка, ГАГ, ДНК приведены коэффициенты ДНК/белок, ГАГ/белок и ГАГ/ДНК.
Из данных, представленных в таблице 8.1, следует, что с возрастом содержание ГАГ в коже достоверно уменьшается со 178,91±39,54 до 44,72±27,19, то есть в 4,0 раза. Уровень белка и ДНК в коже с возрастом статистически достоверно не изменялся.
Сравнение средних значений содержания ГАГ (на г ткани) по t-тесту Стьюдента выявило шесть значимых различий между всеми возрастными группами (табл. 8.2).
При использовании в качестве показателя коэффициента ГАГ/белок количество статистически достоверных различий средних значений существенно уменьшалось (до двух) и они были менее сильными (табл. 8.3), что, очевидно, обусловлено варьированием уровня белка в образцах.
Аналогичные результаты получены при статистической обработке коэффициентов ГАГ/ДНК (табл. 8.4): только два статистически значимых различия средних на уровне Р 0,05. По-видимому, как и в случае коэффициента ГАГ/белок, причиной снижения различий между группами явилось варьирование уровня ДНК в тканях.
Расчет коэффициентов корреляции Пирсона между исследованными переменными показал наличие сильной отрицательной корреляционной связи между возрастом и уровнем ГАГ. Корреляции отсутствовали между возрастом, белком и ДНК. Введение в корреляционный анализ коэффициентов ГАГ/ДНК и ГАГ/белок уменьшало силу корреляционных связей до средней и умеренной соответственно (табл. 8.5). Также в таблице 8.5 приведены «технические» корреляции между ГАГ и содержащими ГАГ коэффициентами, обусловленные корреляцией ГАГ-ГАГ, равной 1,0. Той же причиной обусловлены достоверные «технические» корреляции между белком и содержащим его коэффициентом, а также между ДНК и ее коэффициентом.
Для математического описания статистически значимых линейных корреляционных зависимостей между изученными показателями нами был проведен регрессионный анализ, результаты которого с надежностью Р 0,05 приведены на рисунках 8.1 - 8.7.
На рисунке 8.1. приведено описание содержания ГАГ в коже женщин в зависимости от возраста, подчиняющееся уравнению линейной регрессии (1):
На рисунке 8.2. приведено описание содержания показателя ГАГ/белок в коже женщин в зависимости от возраста, подчиняющееся уравнению линейной регрессии (2):
Качественная оценка влияния плацентарных ГАГ на репара-тивную регенерацию кожи
Эксперименты выполнены на крысах-самках, которым на освобожденном от шерсти участке кожи спины межлопаточной области вырезали лоскут кожи размером 1x1 см. Животные были разделены на 3 группы: 1-ая группа (п=15) -нелеченые животные, 2-ая группа (п=15) ежедневно получала плацебо, 3-я группа (п=15) ежедневно получала субстанцию гликозаминогликанов в виде 0,1% мази. Забор материала для гистологического исследования проводили на 3, 7, 14, 21 и 30 сутки эксперимента в каждой группе у 3 крыс, которые в указанные сроки забивались декапитацией. В ходе опыта проводилось цитологическое исследование ран методом раневых отпечатков.
Описание гистологических препаратов.
3 сутки эксперимента.
1. Нелеченые животные. Эпидермис по краям утолщен в 3-4 раза. В со-сочковом слое фибриноидное набухание, переходящее в фибриноидный некроз. Мышечные волокна набухают неравномерно. В центре раны с поверхности некроз по типу пикноза и рексиса, по краям раны некроз по типу лизиса, ниже -толстым слоем некроз по типу лизиса. Под раной слабовыраженный инфильт-рационно-пролиферативный процесс, в небольшом количестве клеточные элементы полиморфного состава. В подкожной клетчатке кровоизлияния.
2. Животные, получавшие плацебо.
Клеточная инфильтрация и пролиферация неактивная. Выражены 3 слоя: верхний - некроз по типу кариолизиса; средний - некроз по типу кариопикноза и кариорексиса, нижний - обширное кровоизлияние с некрозом ткани по типу кариолизиса.
3. Животные, получавшие СГАГ. Эпидермис по краям раны утолщен в 3-4 раза. Над ростковым слоем появляется зернистый слой, состоящий из 2-3 рядов плоских клеток. В цитоплазме имеются зерна кератогиалина. Около ядер располагаются крупные разной формы глыбки. Роговой слой также утолщен. В сосочковом слое фибриноидное набухание, встречается небольшая гиперемия с кровоизлияниями. Скелетные мышечные волокна под кожей набухшие со слабо выраженной поперечной исчерченностью. Рана с поверхности розовая с небольшим количеством нечетко выраженных клеток с некротическими процессами по типу лизиса. Под этим слоем - некроз по типу кариопикноза и кариорексиса. Под некротической массой выражены явления пролиферации и инфильтрации клеточных элементов полиморфного состава. Особенно много бла-стных форм и гистиоцитов. Увеличено количество тканевых базофилов. В области раны гиперемия и обширные кровоизлияния. 7 сутки эксперимента. 1. Нелеченные животные. 8 эпидермисе вакуольная дистрофия, в сосочковом слое фибриноидное набухание. Эпителий нарастает на раневую поверхность под струп, который еще плотно лежит на ней. В струпе четко видны слои: верхний (очень тонкий) представляет собой бесструктурную розовую аморфную массу, под ним слой некроза по типу пикноза и рексиса, еще ниже - слой гнойных телец, под кото рым гнойные тельца диффузно распределяются в некротической массе. Встре чаются обширные кровоизлияния. В грануляционной ткани под струпом наряду с фибробластами, кровеносными капилярами встречается значительное количе ство клеточных элементов полиморфного состава, много жировых клеток. 2. Животные, получавшие плацебо. Эпидермис утолщен, начинается наползание эпителия на раневую поверхность, но ороговение эпителия неполное, то есть клетки не до конца ороговевают и образуют слой клеток с сохранившимися пикнотическими ядрами. В сосочковом слое набухание, переходящее в некроз. На раневой поверхности под струпом расположен тонкий слой, в котором идет активная деструкция ткани с явлениями пикноза и рексиса. Ниже располагается грануляционная ткань, в которой еще преобладают клетки полиморфного состава с явлениями активного пикноза и рексиса. Кровеносных сосудов незначительное количество. Со стороны подкожной клетчатки в грануляционную ткань внедряются жировые клетки. Капиляры грануляционной ткани и сосуды в подкожной клетчатке гиперемированы. Встречаются кровоизлияния.
3. Животные, получавшие СГАГ.
Эпидермис - в шиповатых клетках встречается вакуольная дистрофия. Зернистый слой имеет 8-10 слоев. Кератогиалин в виде зерен и крупных глы-бок. Наблюдается репаративная регенерация эпителия путем нарастания его на раневую поверхность под струп. В сосочковом слое фибриноидное набухание. Под раной очень активно протекает грануляция. Среди клеток полиморфного состава в большом количестве появились фибробласты. Грануляционную ткань в различных направлениях пронизывает множество новообразованных капилляров. В этой области в большом количестве присутствуют жировые клетки различной величины. В подкожной клетчатке, особенно по ходу сосудов, в значительном количестве встречаются тканевые базофилы.
14 сутки эксперимента.
1. Нелеченые животные.
Эпителий покрывает рану не полностью. В шиповатых клетках вакуольная дистрофия, хорошо выражен зернистый слой, состоящий из 3-4 рядов клеток. Рубцовая ткань нежная, петлистая. Коллагеновые волокна тонкие, располагаются свободно. На границе с подкожной клетчаткой - гиперемия и небольшие кровоизлияния. В подкожной клетчатке много лимфоцитов и с ними часто встречаются плазмоциты.
2. Животные, получавшие плацебо.
Морфологическая картина аналогична 1 группе.
3. Животные, получавшие СГАГ.
Эпителий восстановлен по всей поверхности кожи. Толщина его примерно в 2 раза больше нормы. В шиповатых клетках часто встречается вакуольная дистрофия, слегка выражен зернистый слой, в котором включения имеют форму зерен и глыбок. Рогового слоя нет. В сосочковом слое отмечается набухание коллагеновых волокон. В области раны появилась рубцовая ткань с нежными продольно расположенными коллагеновыми волокнами.
21 сутки эксперимента.
1. Нелеченые животные.
Эпидермис в 2-3 раза толще, чем в норме. Вакуольная дистрофия в шиповатом слое. Местами появляется тонкий роговой слой. Рубцовая ткань петлистая. Коллагеновые волокна в сосочковом слое слегка набухшие.
2. Животные, получавшие плацебо. Морфологическая картина аналогична 1 группе.
3. Животные, получавшие СГАГ.
Эпидермис в 2-3 раза толще, чем в норме. Зернистый слой 2-3 ряда. Появился тонкий роговой слой. Под эпителием в сосочковом слое находятся кровеносные сосуды. В рубцовой соединительной ткани коллагеновые волокна четко оформлены и располагаются вдоль бывшей раны. Ткань слегка петлистая.
![Перекисное окисление липидов и барьерная функция кожи в условиях старения организма [Электронный ресурс]](/i/i/4505/199416.png "Перекисное окисление липидов и барьерная функция кожи в условиях старения организма [Электронный ресурс] Ермакова Екатерина Юрьевна")
