Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Понятие об адаптогенах 12
1.2. Общая характеристика экдистероидов 15
1.3 Молекулярные механизмы действия 20
1.4. Экдистероидсодержащие препараты и БАД к пище 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Экспериментальные животные 35
2.2 Характеристика используемых материалов 38
2.3 Получение фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев серпухи венценосной. 39
2.4. Моделирование стресса путем электрокожного раздражения на лапы 39
2.5. Дизайн экспериментов in vivo. 40
2.6. Физико-химические методы исследования 45
2.6.1. ВЭЖХ методы количественного анализа содержания фитоэкдистероидов в экстрактах. 45
2.6.2 Определение молекулярно-массового распределения белково-пептидных фракций 48
2.6.3. Определение содержания щавелевой кислоты в экстрактах 49
2.7.Биохимические методы. 49
2.7.1. Иммуноферментные методы анализа. 49
2.7.2 Определение содержания норадреналина в плазме крови 50
2.7.3 Определение содержания норадреналина в моче 51
2.7.4 Определение содержания кортикостерона в моче 51
2.7.5 Определение содержания окисленной и неокисленной формы 8-гидрокси-2 дезоксигуанозина в моче 51
2.7.6 Определение активности апоптоза 52
2.7.7 Исследование апоптоза лимфоцитов крыс методом проточной цитометрии 52
2.8. Физиологические методы 54
2.8.1 Обучение крыс инструментальному пищедобывательному навыку 54
2.8.2. Определение порога острой болевой чувствительности 55
2.9. Статистическая обработка результатов исследований 56
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 57
3.1. Экспериментальное обоснование применимости болевого электрокожного раздражение на лапы крыс линии Вистар в качестве модели стрессорного воздействия. 57
3.1.1 Влияние электрокожного раздражения на некоторые биомаркеры ОАС . 57
3.1.2 Влияние витаминной обеспеченности растущих крыс-самцов линии Вистар на их устойчивость к воздействию электрическим током на лапы. 61
3.2. Характеристика фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев серпухи венценосной. 62
3.3 Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на некоторые биомаркеры ОАС у интактных (не стрессированных) крыс. 64
3.4. Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на некоторые биомаркеры ОАС у крыс после стрессорного воздействия. 71
3.5. Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на изменение порога острой болевой чувствительности и потенциальные анальгезирующие эффекты в ответ на термическое раздражение . 77
3.6. Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на способность лабораторных животных (крыс) к обучению инструментальному пищедобывательному навыку. 79
3.7. Получение и характеристика фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев шпината огородного 84
ГЛАВА 4. Заключение. 90
Выводы 100
Список цитированной литературы 102
- Молекулярные механизмы действия
- Определение молекулярно-массового распределения белково-пептидных фракций
- Влияние электрокожного раздражения на некоторые биомаркеры ОАС
- Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на изменение порога острой болевой чувствительности и потенциальные анальгезирующие эффекты в ответ на термическое раздражение
Молекулярные механизмы действия
Растительные адаптогены относятся к биологически-активным веществам (БАВ) – природным регуляторам метаболизма, повышающим способность организма адаптироваться к условиям окружающей среды и неблагоприятным ее изменениям. Основное и определяющее отличие адаптогенов от других БАВ связано с их неспецифическим эффектом, заключающимся в увеличении устойчивости к широкому кругу повреждающих факторов физической, химической и биологической природы. Адаптогены характеризуются проявлением широкого круга терапевтических эффектов, не вызывая отклонений (даже минимальных) нормального функционирования организма [56]. Термин адаптоген самым тесным образом связан с понятиями «стресс» и «фаза резистентности к стрессорному воздействию», а также понятием «состояние неспецифически повышенной сопротивляемости» (СНПС) организма [24]. Состояние стресса является одним из защитных приспособительных механизмов организма на любое сильное раздражение из вне, так называемым общим адаптационным синдромом (ОАС) [22, 112, 112]: изменением деятельности центральной нервной системы, эндокринных желез, метаболических процессов. Фаза резистентности при стрессе, которая и «является собственно адаптацией» при стрессорном воздействии, характеризуется активацией процессов, протекающих на тканевом и клеточном уровнях, обеспечивающих новый уровень гомеостазиса [29, 36]. Изменение гормонального фона осуществляется системой АКТГ-глюкокортикоиды, происходит мобилизация цАМФ, повышается синтез ряда структурных белков и ферментов, реагирует иммунная система, нарастает глюконеогенез. Однако при достаточно мощном по силе и длительности дисстрессорном воздействи не происходит перехода адаптивного процесса в стадию относительной резистентности с нормализацией признаков напряжения, а формируется стадия истощения, характеризующаяся серьезными нарушениями гормонального баланса и тканевого обмена веществ. В результате стрессовая реакция организма из неспецифического звена адаптации может превратиться в общее неспецифическое звено патогенеза, способствуя развитию целого ряда болезненных проявлений, и в предельном случае может привести даже к летальному исходу [9, 28, 29]. Состояние организма, позволяющее ему «избежать» стадии истощения вследствие повышенной устойчивости организма к различным неблагоприятным воздействиям было определено в конце пятидесятых годов прошлого века отечественным ученым Н.В. Лазаревым как «Состояние Неспецифически Повышенной Сопротивляемости» (СНПС) [24]. В современной отечественной научной литературе понятию СНПС обычно соответствуют термины «высокий (повышенный) уровень адаптационного потенциала» или «повышенная резистентность к неблагоприятным воздействиям различной природы». СНПС имеет определенное сходство со стадией резистентности однако, в отличие от неё СНПС оказывает регулирующее воздействие, оптимизирующее развитие ОАС [56, 112, 112], не являясь следствием (фазой) стресса. В СНПС, то есть в оптимальном для организма состоянии, существуют значительно большие возможности, чем в стадии резистентности ОАС, избежать избыточного напряжения и, как следствие, перехода в стадию истощения. Как было показано многочисленными работами советских исследователей в пятидесятых-шестидесятых годах прошлого века, достаточно быстрое достижение состояния СНПС может быть достигнуто путем поступления в организм целого ряда различных соединений растительного, животного или искусственного происхождения, которые и получили в отечественной научной литературе общее название адаптогенов. Физиологическая активность адаптогенов отвечает трем критериям: 1) адаптогены должны быть безвредны для организма, обладать широким спектром терапевтического действия, но при этом вызывать минимальные сдвиги в организме в норме; 2) неспецифическое действие адаптогенов определяется увеличением устойчивости организма к вредному действию широкого спектра факторов физической, химической и биологической природы; 3) адаптогенам свойственно нормализующее действие, которое не зависит от направленности предшествующих сдвигов [56]. Ключевыми при обсуждении фармакологических эффектов адаптогенов являются вопросы о том, чем адаптогены отличаются от хорошо известных стимуляторов (допингов) и какими механизмами определяется общий принцип их действия в качестве регуляторов метаболизма. Как отмечается в обзорной работе [103] различие между адаптогенами и стимуляторами было наглядно продемонстрировано в серии биохимических исследований в конце шестидесятых годов прошлого века. В этой же работе наглядно графически показано (рис.1.1), что если при использовании допинга за начальным повышением работоспособности наступает её резкий спад (относительно базового уровня), то при применении адаптогена работоспособность «после достижения максимума» не снижается до минимального уровня.
Определение молекулярно-массового распределения белково-пептидных фракций
Первым отечественным экдистероидсодержащим препаратом тонизирующего действия, стал лекарственный препарат «Экдистен», выделенный из корневищ рапонтикума сафлоровидного и разрешенный к медицинскому применению с 1987 г. Фармакологическая активность «Экдистена» определяется наличием в его составе 20-Е. Препарат находит применение в качестве тонизирующего средства; у спортсменов во время интенсивных тренировок в качестве средства, повышающего скоростно-силовые качества в период подготовки к соревнованиям, а также при дисфункциях сердечнососудистой системы особенно с выраженными признаками перенапряжения миокарда и усилением белкового катаболизма [23]. Кроме использования в спортивной медицине препарат может быть эффективно применен при лечении лямблиоза у больных с выраженными нарушениями иммунного статуса (больные туберкулезом и ВИЧ-инфицированные) [21]. Терапевтическая доза составляет 30 мг/сут [27]. Высокая эффективность и одновременно безвредность данного препарата при использовании в период подготовки высококвалифицированных спортсменов привели к разработке и регистрации в 2007 г. новых отечественных экдистероидсодержащих БАД к пище для спортивной медицины; в том числе обогащенных комплексом витаминов группы В, витаминами-антиоксидантами (витамины А, С и Е), комплексом витаминов - С, В1, Е, В2, В6, А, D3, фолиевая кислота, никотиновая кислот. Эти БАД к пище по мнению разработчиков могут быть использованы в питании людей, испытывающих большие физические и умственные нагрузки в повседневной жизни, как профилактическое средство и в спорте для ускоренного набора мышечной массы, увеличения мышечной силы, значительного ускорения восстановления после любого вида нагрузок, для увеличения скоростно-силовых показателей, во время интенсивных тренировок. В 2013 г. зарегистрирован еще один специализированный пищевой продукт для питания спортсменов, содержащий в своем составе экстракт корня рапонтикума сафлоровидного, экстракты винограда и яблока, растительные полифенолы, витамины В2, В6, В1. Следует отметить также многолетние экспериментальные исследования и разработки узбекскими учеными препаратов на основе экдистероидов, стимулирующих психическую и физиологическую активность [52].
Ими созданы лекарственные препараты, а также БАД к пище, содержащие экдистерон, туркестерон, циастерон и другие фитоэкдистероиды, выделенные из Рапонтикума Сафлоровидного и Живучки туркестанской (Ajuga turkestanica). При применении этих средств в клинических условиях у пациентов имело место улучшение психоэмоционального статуса, астенических синдромов, повышались умственная и физическая работоспособность, ускорялся процесс реабилитации после заболеваний. Установлена эффективность этих препаратов в практике спортивной медицины в плане ускорения процесса адаптации и восстановления после максимальных и субмаксимальных физических нагрузок [45]. Препарат на основе экстракта Живучки туркестанской также повышал адаптационные возможности организма женщин к стрессовым ситуациям [1]. В течение длительного времени основным источником 20-гидроксиэкдизона было лекарственное растение рапонтикум сафлоровидный (Rhaponticum carthamoides). Необходимость поиска новых растительных источников этого фитоэкдистероида диктовалась следующими тремя основными причинами. Во-первых, содержание 20Е в корневищах рапонтикума сафлоровидного относительно невелико – не более 0,2%. Во-вторых, использование в качестве сырья подземных органов растений не является оптимальным и с точки зрения истощения запасов рапонтикума сафлоровидного в природных популяциях, и с позиций необходимости возобновления плантаций каждые три года при его выращивании в культуре. В-третьих, с технологической точки зрения переработка корневищ более трудоемка, чем переработка надземной части растений (например, листьев). Получение в широких масштабах 20-Е из рапонтикума сафлоровидного тормозится также ограниченными запасами лекарственного сырья в природных популяциях (вид является эндемиком Горного Алтая и занесен в Красную книгу Российской Федерации [13]. В результате широкого скрининга, основанного на принципах хемосистематики, данных этноботанических исследований, и проведенных в нашей стране исследований специалистами лаборатории биохимии и биотехнологии ИБ Коми НЦ УрО РАН в качестве растительного источника 20-Е были предложены, растения рода Serratula L. (сем. Asteraceae), в частности серпуха венценосная Serratula coronata L. Установлено, что в надземной части растений, находящихся в фазе бутонизации и начала цветения, содержание 20Е составляет около 2% в расчете на сухую массу, что на порядок выше, чем в корневищах рапонтикума сафлоровидного. Была разработана схема получения экдистероидсодержащей субстанции из надземной части серпухи венценосной, состоящая из следующих стадий: 1) водная экстракция растительнонго сырья; 2) извлечение из сгущенного водного экстракта конечного продукта смесью этилацетат- метанол или хлороформ-метанол; 3) упаривание органических извлечений досуха; 4) хроматографическая очистка экдистероидов на оксиде алюминия в системе хлороформ-метанол или этилацетат- метанол возрастающей полярности; 5) перекристаллизация конечного продукта в системе этилацетат- метанол при соотношении 9:1. Авторы разработки считают возможным применение этого способа и для выделения экдистероидов из других видов растительного сырья [13].
В соответствии с вышеописанным способом из надземной части серпухи венценосной была получена субстанция «Серпистен», представляющая смесь 20Е и 25S-инокостерона, в соотношении 8:1. Как уже отмечалось во введении, в растительном экстракте серпухи венценосной содержится два мажорных экдистероида: 20-Е и 25S-инокостерон, отличающийся от 20Е положением одной гидроксильной группы в боковой цепи. Оба этих экдистероида обладают очень низкой токсичностью: при внутрибрюшинном и пероральном ведении 20E в опытах на мышах LD50 составляла 6.4 и 9.0 г/кг соответственно, а при введении инокостерона – соответственно 7.8 и 9.0 г/кг. [99].
Влияние электрокожного раздражения на некоторые биомаркеры ОАС
Процесс апоптоза в этом эксперименте в силу технических причин в отличие от определений активности апоптоза в других экспериментах тестировали методом, представленным в разделе 2.7.7. позволившим охарактеризовать степень апоптоза лимфоцитов тимуса крыс. Результаты, полученные при исследовании апоптоза лимфоцитов крыс в тимусе, свидетельствуют об отсутствии статистически достоверных различий относительного содержания лимфоцитов тимуса без признаков апоптоза у крыс контрольной и опытной групп (98,66 ± 0,09% и 98,74±0,02% соответственно), равно как и мертвых клеток (0,15±0,03% и 0,16±0,03% соответственно). При этом следует отметить, что среди лимфоцитов тимуса крыс опытной группы обнаружено статистически достоверное снижение относительного числа клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза с сохранением целостности клеточной мембраны, по сравнению с данным показателем у крыс контрольной группы (рисунок 3.3.1). групп №2 и №3 ежесуточно в воду добавляли сухой экстракт из листьев серпухи венценосной из расчета 5 и 15 мг фитоэкдистероидов/ кг массы тела. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента воду. Продолжительность эксперимента составила 15 суток. Увеличение дозировки потребляемого крысами экстракта до 5 и 15 мг экдистероидов/кг массы тела также достоверно не изменяло прироста массы тела по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы. В отличие от эксперимента №4 нами было дополнительно определено содержание в плазме крови норадреналина. В табл. 3.3.4 представлены результаты определения средних значений содержания кортикостерона, норадреналина, бета-эндорфина и простагландина Е в плазме крови крыс контрольной и опытных групп по окончании эксперимента.
Как и в предыдущем эксперименте с потреблением меньшей дозировки фитоэкдистероидов содержание кортикостерона, бета-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови крыс не различалось для контрольной и обеих опытных групп. Однако при определении норадреналина достоверно более низкие значения концентраций этого катехоламина по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы были обнаружены в плазме крови животных, получавших 5мг и 15мг фитоэкдистероидов/кг массы. При этом самое низкое содержание норадреналина отмечено у крыс, потреблявших наибольшую дозу экдистероидов. Дозозависимое снижение содержания норадреналина в крови обусловило повышение соотношения бета-эндорфин/норадреналин, достоверно выявляемое для обеих доз фитоэкдистероидов, как это показано на рисунке 3.3.2. достоверность различий (Р 0,05) от показателя контрольной группы согласно критерию Стъюдента и непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни достоверность различий (Р 0,05) от показателя опытной группы №1 согласно критерию Стъюдента и непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни К- контрольная группа№1, интактные крысы О1- опытная группа№2, получавшая 5мг фитоэкдистероидов/кг массы тела О2 - опытная группа№3, получавшая 15мг фитоэкдистероидов/кг массы тела Рисунок 3.3.2 - Влияние экстракта из листьев серпухи венценосной на соотношение концентрация бета-эндорфина/концентрация норадреналина в плазме крови, M±m (эксперимет №6) О чем может свидетельствовать выявленный феномен? Как уже ранее отмечалось нами, 20-гидроксиэкдизон и 25S – инокостерон - это полигидроксилированные стерины, химическая структура, которых близка структуре кортикостерона - основного и наиболее активного глюкокортикостероида у крысы, классифицируемого как биомаркер АОС.
Их поступление в составе экстракта в дозировках 5 и 15 мг фитоэкдистероидов /кг массы тела в организм животного (всасывание как таковых или в форме метаболитов), по-видимому, может влиять на баланс активаторов стресса, к которым относится норадреналин, и соединений стресс-лимитирующих систем, в частности бета-эндорфина. Таким образом, увеличение соотношения бета-эндорфин/норадреналин, характеризующее выраженность метаболических изменений в ответ на стрессорное воздействие, может свидетельствовать об относительном усилении функционирования стресс-лимитирующих систем при потреблении животными фитоэкдистероидсодержащего экстракта в условиях нормы.
В этом же эксперименте потребление в течение 15 суток 20-гидроксиэкдизона (20Е) и 25S-инокостерона в составе экстракта серпухи венценосной животными опытных групп не оказывало неблагоприятного влияния на тимус и не повышало активность апоптоза в клетках тимуса по сравнению с животными контрольной группы, как это следует из данных, представленных на рисунке 3.3.3. Отсутствие достоверных различий в ростовых показателях, а также в степени фрагментации ДНК и индексе апоптоза у крыс, получавших фитоэкдистероидсодержащий экстракт Serratula coronata, по сравнению с животными контрольной группы является одним из экспериментально полученных свидетельств в пользу безопасности его использования в питании.
Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на изменение порога острой болевой чувствительности и потенциальные анальгезирующие эффекты в ответ на термическое раздражение
Предположения о потенциальном адаптогенном действии фитоэкдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной получили свое подтверждение в опытах in vivo по оценке влияния экстракта на некоторые биомаркеры ОАС у крыс в условиях моделируемого стресса. При проведении относительно продолжительного эксперимента (30 суток) прирост массы тела крыс, получавших экстракт в суточной дозировке 2 мг фитоэкдистероидов/кг массы тела, соответствовал уровню прироста, характерному для животных данного вида и возраста. После электрокожного раздражения, проведенного в конце эксперимента, было определено содержание в крови кортикостерона, бета-эндорфина, норадреналина и простагландина Е2, у животных контрольной группы и животных, получавших экстракт. Не было выявлено достоверных различий средних значений биохимических маркеров центральной стресс-системы и стресс-лимитирующих систем у стрессированных животных, как получавших экстракт, так и не получавших его
Однако даже при использованной низкой дозировке фитоэкдистероидов средние значения абсолютной и относительной массы тимуса стрессированных животных сравниваемых групп отличались статистически достоверно. Снижение массы тимуса, как уже отмечалось нами, является общепризнанным показателем стресса достаточной интенсивности. В проведенном эксперименте снижение массы тимуса у стрессированных крыс, получавших экстракт, сочеталось со снижением в тимусе активности апоптоза, характеризуемой уровнем ДНК-повреждений и количеством апоптических клеток. Средние значения абсолютной и относительной массы тимуса животных опытной и контрольной групп отличались статистически достоверно и составили 0,46±0,03 г, 0,163±0,012% и 0,56±0,030г, 0,193±0,010% соответственно. Выявлено достоверное снижение в тимусе активности апоптоза у стрессированных крыс, а именно ДНК-повреждений (7,61±0,14 %ДНК) и количества апоптических клеток (1,08±0,10 %), по сравнению с контрольной группой (8,14±0,16 %ДНК и 1,34±0,07 % соответственно).
По-видимому, при низком потреблении фитоэкдистероидсодержащего экстракта тестирование показателей, характеризующих апоптоз в клетках тимуса, является более информативным по сравнению с определением уровня биохимических маркеров ОАС в крови стрессированного животного. При другой дозировке и продолжительности потребления фитоэкдистероидов, а также другом возрасте животных (и соответственно другой массы тела) ситуация может существенно измениться. Об этом свидетельствуют результаты менее продолжительного эксперимента в 15 суток, в котором животные потребляли ежесуточно более высокую дозу фитоэкдистероидов в 5 мг/кг массы тела. Исходная масса тела использованных в этом эксперименте крыс также заметно отличалась по сравнению с животными предыдущего эксперимента. В этом исследовании было показано значительное достоверное снижение экскреции с мочой кортикостерона и норадреналина (47,6±6,8 и 968±176 нг/сутки соответственно) по сравнению с аналогичными показателями у стрессированных животных контрольной группы (17,9±4,2 нг/мл и 523±82 нг/сутки соответственно). В методическом плане сравнение результатов, полученных в этих двух экспериментах, указывает на то, что для получения достоверной информации об адаптогенных свойствах фитоэкдистероидов в составе растительных экстрактов необходима комплексная оценка их влияния на биомаркеры ОАС у стрессированных крыс, включающая (в первую очередь) определение экскреции с мочой кортикостерона и норадреналина, а также показатели, характеризующие процесс апоптоза в клетках тимуса.
В рамках проведенного исследования не ставилась задача расшифровать механизмы, посредством которых фитоэкдистероды и, в первую очередь, 20-гидроксиэкдизон в составе экстракта серпухи венценосной влияют на биомаркеры ОАС. Тем не менее для возможного гипотетического объяснения на молекулярно-клеточном уровне выявленного в нашей работе снижения активности апоптоза в тимусе стрессированнных крыс, получавших экстракт, может быть привлечена представленная в обзоре научной литературы схема (рис.2.1.5). Эта схема отражает имеющиеся экспериментально полученные данные об участии 20-гидроэкдизона (или его метаболитов) в PI3K пути активации белков семейства серин-треониновой протеинкиназы-РКВ - сигнальной макромолекулы, играющей ключевую роль в регуляции клеточной активности (росте клеток и их выживаемости [?].
Различают несколько независимых механизмов, активируемых через РКВ и способных привести к ингибированию апоптоза. Так установлено, что медиаторами РКВ являются протеазы семейства каспаз, активируемые в процессе апоптоза. РКВ подавляет активность этих протеаз, что может лежать в основе его антиапоптического эффекта [85].
К другим возможным эффекторам РКВ относят р70 Бб-киназу (семейство рибосомальных S6 киназ весом 70 Ша), которая обладает выраженным антиапоптическим действием, и активность которой возрастает при прямом фосфорилировании РКВ [57, 66]. Выявлена важная роль в индукции программированной клеточной гибели фермента киназы-3 гликогенсинтетазы (GSK 3), одним из путей регуляции которого является его прямое фосфорилирование РКВ, что вызывает резкое снижение активности данного фермента [69, 72]. Следует отметить, что РКВ фосфорилирует особые мишени, многие из которых играют ключевую роль в активации пролиферации, роста клетки и подавления апоптоза, в том числе mTOR (мишень рапамицина у млекопитающих).
Результаты, свидетельствующие о наличии у фитоэкдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной адаптогенных свойств, обусловили проведение эксперимента по оценке возможного анальгетического эффекта экстракта для этих животных. В эксперименте in vivo длительностью 30 суток установлено достоверное увеличение времени до возникновения болевого оборонительного рефлекса в тесте «Горячая пластина» у крыс, ежедневно потреблявших экстракт серпухи венценосной в дозе 5 мг/кг массы тела, по сравнению с контрольной группой. Показано достоверное увеличение времени до возникновения первого болевого рефлекса (облизывание передних лап) и числа вертикальных стоек у животных, потреблявших экстракт (16,7±2,0сек и 10,3±2,0 соответственно), по сравнению с аналогичными показателями у контрольных животных (8,8±0,7сек и 18,9±3,8 соответственно).
