Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важных задач экспериментальных биомедицинских исследований является то, в какой степени результаты, полученные на лабораторных животных можно экстраполировать на организм человека. К настоящему времени описано множество in vivo моделей. Однако в большинстве случаев вопрос об адекватности той или иной биомодели процессам, протекающим в организме человека, остается открытым, поэтому актуальность данной проблемы очевидна.
От того, насколько модель на лабораторных животных будет адекватна организму человека, зависит формирование представлений о механизмах физиологических процессов, ответственных за реализацию действия фармакологических препаратов, и стратегия выбора новых физических агентов и химических веществ с определенными физиологическими и фармакологическими свойствами. Оценка адекватности экспериментальных моделей представляет собой систему доказательств, показывающих в какой мере и с какой степенью вероятности результаты, полученные в эксперименте на животных, могут быть экстраполированы на человека.
В биомоделировании принцип подобия является основополагающим. При разработке in vivo моделей обычно используют следующие методические приемы: селекция по заданному фенотипическому признаку физиологического или патологического состояния; модификация генотипа, приводящая к изменению протекания физиологических процессов или развитию патологии (трансгенные и нокаутные животные); фармакологическая модуляция функционального состояния или инструментальные воздействия на организм, провоцирующие физиологические или патологические изменения в нем; изменения внешних условий среды обитания, приводящие к мобилизации физиологических механизмов адаптации вплоть до их истощения и патологии.
Фармакологическая коррекция нарушений сердечно-сосудистой системы является одной из важнейших проблем современной медицины. В связи с этим, разработка и оценка адекватности организму человека in vivo моделей для изучения сердечно-сосудистой системы является важной и актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования. Цель работы – разработка и оценка адекватности соответствующим процессам, протекающим в организме человека, in vivo моделей для исследования сердечно-сосудистой системы.
В соответствии с целью были определены следующие задачи:
1) провести комплексное изучение параметров сердечно-сосудистой системы у гипертензивных крыс SHR-SP (Spontaneous Hypertensive Rat Stroke Prone) в сравнении с нормотензивными крысами WKY с целью оценки адекватности перестройки регуляторных механизмов в условиях повышенного артериального давления (АД) у крыс процессам, развивающимся при артериальной гипертонии у человека;
2) исследовать аритмогенные свойства эндотелина при его внутривенном введении у бодрствующих мышей и крыс и изучить роль нервной системы в развитии нарушения ритма сердца, вызванного эндотелином в условиях блокады NO-синтазы;
3) создать адекватную модель глобальной ишемии головного мозга и провести морфо-функциональное исследование на бодрствующих крысах SHR-SP, моделируя у них глобальную ишемию головного мозга путем билатеральной окклюзии сонных артерий;
4) разработать модель для изучения транскапиллярного обмена жидкости на крысах и оценить ее адекватность;
5) провести сравнительный анализ гемодинамических эффектов у нормотензивных и гипертензивных крыс при воздействии физиологических (иммобилизационного стресса) и фармакологических (антидепрессантов) факторов, а также агентов парокринной системы клеток эндотелия кровеносных сосудов (эндотелина и оксида азота).
Научная новизна работы. Впервые проведен комплексный анализ функциональных характеристик сердечно-сосудистой системы у крыс SHR-SP, и показано, что крысы SHR-SP являются адекватной экспериментальной моделью артериальной гипертонии. Обнаружено, что нейрогенные механизмы играют ключевую роль в развитии нарушений ритма сердца у мышей и крыс, вызванных эндотелином, введенным внутривенно на фоне блокады синтеза оксида азота с помощью L-NAME. Впервые доказано, что адекватная модель глобальной ишемии головного мозга у бодрствующих крыс SHR-SP в отличие от нормотензивных крыс может быть создана путем билатеральной окклюзии сонных артерий. Разработана новая экспериментальная модель, позволяющая количественно изучать процессы фильтрации и реабсорбции жидкости в микроциркуляторном сосудистом русле у наркотизированных крыс путем измерения артериовенозной разности плотности крови при постуральных изменениях. Обнаружено, что у крыс SHR-SP в ответ на стрессорное воздействие вместо гипертензивной реакции, наблюдаемой у нормотензивных крыс, развивается гипотензия, что свидетельствует о нарушении механизмов адаптации при артериальной гипертонии. Антидепрессанты дезипрамин и тетриндол у крыс SHR-SP по-разному влияют на сердечно-сосудистую систему, хотя и вызывают одинаковые седативные эффекты. Установлено, что одной из причин патологически высокого АД у крыс SHR-SP являются изменения во взаимодействии эндотелина и оксида азота.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные углубляют и дополняют представления о методических подходах, которые следует использовать при разработке и оценке адекватности in vivo моделей для изучения сердечно-сосудистой системы. Разработанные и изученные на уровне целого организма экспериментальные модели перспективны для исследования физиологических механизмов развития артериальной гипертонии, нарушения ритма сердца, глобальной ишемии головного мозга, а также для их фармакологической коррекции. Разработана модель для количественной оценки процессов фильтрации и реабсорбции жидкости в микроциркуляторном сосудистом русле, приемлемая для изучения механизмов развития отеков и исследования новых противоотечных препаратов. Полученные данные об изменениях в механизмах взаимодействия эндотелина и оксида азота у гипертензивных крыс, позволяют рассматривать их как важные патогенетические факторы артериальной гипертонии и создают основу для направленного поиска новых фармакологических препаратов, а также дополняют знания о физиологии парокринной системы эндотелиальных клеток кровеносных сосудов.
Результаты диссертационного исследования используются в научно-исследовательской работе лаборатории биологических испытаний Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и включены в руководство по доклиническому изучению фармакологических веществ Росздравнадзора РФ.
На защиту выносятся следующие положения диссертации:
1. Повышенный симпатический тонус сердца и сосудов, пониженая чувствительность барорефлекса, участие Y-хромосомы и митохондриальной ДНК в наследуемости высокого уровня АД, возможность фармакологической коррекции АД с помощью моксонидина (гипотензивного препарата центрального действия) указывают на то, что крысы SHR-SP, имеющие АД диастолическое около 150 мм рт.ст. и систолическое около 200 мм рт.ст., являются адекватной экспериментальной моделью для изучения физиологических механизмов и поиска средств коррекции артериальной гипертонии.
2. Показано, что у крыс и мышей эндотелин, введенный внутривенно на фоне блокады синтеза оксида азота с помощью L-NAME, вызывает экстрасистолию и атриовентрикулярный блок. Ганглиоблокатор (гексаметоний), блокаторы парасимпатической (атропин) и симпатической (атенолол) нервной системы оказывают влияние на проявление аритмогенных свойств эндотелина, что свидетельствует о важной роли нервной системы в развитии этих нарушений ритма сердца.
3. Билатеральная окклюзия сонных артерий в течение 40-50 минут у бодрствующих крыс SHR-SP вызывает структурные нарушения митохондрий в дендритах пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа, сопровождается гипертензией и тахикардией, а также является причиной гибели животных, что свидетельствует об ишемии головного мозга и указывает на адекватность этой модели данному состоянию, в отличие от нормотензивных крыс, у которых для создания ишемии головного мозга требуется дополнительный отягощающий фактор - снижение АД до 50 мм рт.ст.
4. Доказано, что процессы фильтрации и реабсорбции жидкости в микроциркуляторном сосудистом русле у наркотизированных крыс можно оценивать путем измерения артериовенозной разности плотности крови при постуральных изменениях. Показано, что данная модель может быть применена для изучения механизмов развития отеков и действия противоотечных препаратов.
5. Гипотензивная реакция, обнаруженная у крыс SHR-SP при стрессе, позволяет рекомендовать эту модель для исследования нарушений механизмов адаптации сердечно-сосудистой системы на стрессорное воздействие.
6. Крысы SHR-SP как модель артериальной гипертонии могут быть использованы при исследовании антидепрессантов с целью выявления у них гемодинамических эффектов.
7. Показано, что эндотелин является важным регуляторным пептидом периферического и центрального действия, имеющий широкий спектр влияния на сердечно-сосудистую систему. Доказано, что важными патогенетическими факторами артериальной гипертонии у крыс SHR-SP являются изменения во взаимодействии эндотелина и оксида азота.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих конгрессов, симпозиумов и конференций: съезд Российского общества фармакологов, Москва, 1995; конференция “Современные аспекты артериальных гипертензий”, Санкт-Петербург, 1995; Российский конгресс по патофизиологии, Москва, 1996; Annual World Assembly “ American college of angiology”, Barcelona, 1996; Российский национальный конгресс “Человек и лекарство”, Москва, 1997, 1998, 1999, 2000; International Congress of Pathophysiology, Lahti, 1998; конференция “Механизмы функционирования висцеральных систем”, Санкт-Петербург, 1999, 2001; конференция «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2001; сonference “Laboratory animals in biomedical research”, Warsaw, 2001; конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 2001; конференция «Биология - наука 21-го века», Пущино, 2002; съезд токсикологов России, Москва, 2003; конференция «Клинические исследования лекарственных средств», Москва, 2003; отчетная конференция ФИБХ РАН, Пущино, 2004; конференция «Ломоносов-2004», Москва, 2004; конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 2006; OECD/Russia Federation workshop on “Biosecurity of microbial resources - complementing innovation”, Moscow, 2006; заседание секции «Биомедицина» Ученого совета ИТЭБ РАН, 2007.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 52 печатных работы, из них 28 статей в журналах, 2 статьи в коллективной монографии, 1 руководство и 21 работа в материалах конгрессов, симпозиумов и конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 61 рисунок. Она состоит из введения, описания методов исследования, 5 глав собственных исследований, выводов, библиографического списка, включающего 234 источника, из них 152 иностранных.
