Содержание к диссертации
Оглавление 2
Список сокращений
Введение
Актуальность проблемы
Цель исследования
Задачи исследования
Научная новизна и теоретическая ценность диссертационной работы
Практическая значимость работы
Положения, выносимые на защиту
Апробация диссертационной работы
Структура и объём диссертации
Глава I. Ферменты, формирующие фонд свободных аминокислот
насекомых (литературный обзор)
Ферменты аминокислотного обмена насекомых
Ферменты биосинтеза глицина.
Ферменты биосинтеза серина
Ферменты биосинтеза аланина
Ферменты биосинтеза тирозина.
Протеолитические ферменты насекомых
Внутриклеточные сериновые протеиназы
Внутриклеточные цистеиновые протеиназы
Внутриклеточные аспартатные протеиназы и металлопротеиназы..
Белковые ингибиторы эндогенных протеиназ насекомых
Глава II. Материалы и методы
ИЛ. Материалы для изучения активности ферментов аминокислотного
обмена
И. 1.1. Приготовление препаратов исследуемых тканей коконопрядущих
насекомых
II. 1.2. Приготовление препаратов грены тутового шелкопряда
II. 1.3. Определение ферментативной активности растворимых белков тканей и грены шелкопряда методом энзим-электрофореза в
полиакриламидном геле
II. 1.3.1. Получение ферментных экстрактов тканей
II. 1.3.2. Выявление активности отдельных ферментов
II. 1.3.3.Количественная обработка энзимограмм
II. 1.4. Определение активности ферментов аминокислотного обмена с
помощью автоматического анализатора аминокислот
П.1.4.1. Получение ферментных экстрактов тканей.
II. 1.4.2. Выявление активности отдельных ферментов
II. 1.4.3. Количественное определение аминокислот с помощью
аминокислотного анализатора
И. 1.5. Определение ферментативной активности растворимых белков тканей и грены тутового шелкопряда колориметрическими и
спектрофотометрическими методами
И.2. Материалы и методы для изучения метаболизма С-меченых белков у
тутового шелкопряда
П.2.1. Биологический материал
И.2.2. Получение меченых белков тканей и органов тутового шелкопряда
и исследование их метаболизма
И.2.2.1. Введение радиоактивной аминокислоты в гемолимфу гусениц
тутового шелкопряда
И.2.2.2. Получение препарата меченых белков гемолимфы и введение его
гусеницам тутового шелкопряда.
И.2.2.3. Получение и очистка препаратов растворимых и нерастворимых
белков из тканей и органов тутового шелкопряда ПО
И.2.2.4. Выделение фиброина и серицина из оболочки кокона тутового
шелкопряда
Н.2.2.5. Фракционирование растворимых белков методом диск-
электрофореза в полиакриламидном геле
И.2.2.6. Определение количественного содержания белков на
электрофореграммах
И.2.2.7. Просчет радиоактивности белковых препаратов методом
отношения каналов
IL2.2.8. Просчет радиоактивности белков, фракционированных методом
электрофореза в полиакриламидном геле
П.2.3. Выделение свободных аминокислот и определение уровня радиоактивности предшественника в тканях и органах тутового
шелкопряда
Н.2.4. Определение аминокислотного состава белков гемолимфы, разделённых методом диск-электрофореза в полиакриламидном
геле
И.2.4.1. Разработка метода элюции белков гемолимфы с колонок
полиакрил амидного геля
II.2.4.2. Определение аминокислотного состава белков гемолимфы с
помощью автоматического анализатора аминокислот
И.З. Материалы и методы для изучения активности протеолитических
ферментов и их белковых ингибиторов у тутового шелкопряда
П.3.1. Материал
.3.2. Получение препаратов растворимых белков из грены тутового шелкопряда
.3.3. Выделение субклеточных фракций из грены шелкопряда
.3.4. Выделение ядер и хроматина из грены тутового шелкопряда
.3.5. Методы изучения протеолитических ферментов у тутового шелкопряда
И.З.5.1. Определение активности эндогенных пептидогидролаз в
белковых экстрактах тканей, органов и грены тутового
шелкопряда
И.З.5.2. Определение подклассовой принадлежности протеолитических
ферментов
.6. Определение активности эндогенных ингибиторов
протеолитических ферментов в гомогенатах и субклеточных фракциях грены тутового шелкопряда спектрофотометрическим
методом
П.3.7. Электрофоретическое фракционирование растворимых белков
грены тутового шелкопряда.
II.3.8. Методы выделения и очистки ферментов белкового обмена
тутового шелкопряда
П.3.8.1. Гель-фильтрация
И.3.8.2. Ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе
П.3.8.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография
П.3.8.4. Хроматография белков на оксиапатите
П.3.8.5. Изоэлектрофокусирование в градиенте плотности сахарозы
(рН4-6)
П.3.8.6. Препаративное изоэлектрофокусирование в слое
ультродекса
И.3.8.7. Аффинная хроматография
И.3.9. Методы изучения физико-химических характеристик ферментов
белкового обмена тутового шелкопряда
Н.3.9.1. Методы определения молекулярной массы ферментов белкового
обмена
П.3.9.1.1. Определение молекулярной массы ферментов белкового
обмена тутового шелкопряда методом гель-фильтрации
И.3.9.1.2. Определение молекулярной массы ферментов белкового
обмена методом электрофореза в полиакриламидном геле..
Н.3.9.2. Определение изоэлектрических точек ферментов белкового
обмена методом аналитического изоэлектрофокусирования в
тонком слое полиакриламидного геля
Н.3.9.3. Изучение субстратной специфичности ферментов белкового
обмена тутового шелкопряда
IL3.9.4. Определение констант Михаэлеса для субстратов прямой
реакции, катализируемой аланинаминотрансферазой
шёлкоотделительной железы тутового шелкопряда
ІІ.4. Статистическая обработка результатов эксперимента
Глава III. Ферменты синтеза глицина, аланина, серина и тирозина в
тканях и органах коконопрядущих насекомых...
Пути синтеза главных аминокислот шёлка в шёлкоотделительной
железе тутового шелкопряда
Ш.2. Взаимосвязь процессов биосинтеза главных аминокислот шёлка в
шёлкоотделительной железе с их обменом в других тканях тутового
шелкопряда
Ш.З. Сравнительная характеристика ферментов биосинтеза главных
аминокислот шёлка коконопрядущих насекомых (Bombyx mori L.,
Antheraeaperrtyi G.-M. и Actios artemnis В.)
III.4. Электрофоретическая гетерогенность некоторых ферментов
аминокислотного обмена в тканях и органах коконопрядущих
насекомых
Ш.5. Фазовая специфичность ферментов аминокислотного обмена насекомых. Ферменты аминокислотного обмена в эмбриогенезе
тутового шелкопряда.
Глава IV. Белковые компоненты тканей и органов тутового
шелкопряда как источники азотистого материала для
синтеза главных аминокислот шёлка
Взаимосвязь белкового обмена тканей и органов тутового
шелкопряда, выясненная на основании опытов по включению
2- С-глицина в суммарные белки
IV.2. Взаимосвязь белкового обмена тканей и органов тутового
шелкопряда, выясненная на основании опытов по включению в его
организм С-белков гемолимфы
IV.3. Изучение роли в процессах шелкообразования белковых фракций тканей и органов тутового шелкопряда, основанное на результатах
включения в их состав 2- С-глицина
Глава V. Исследование протеолитических ферментов и их белковых
ингибиторов у тутового шелкопряда
V.I. Исследование протеолитических ферментов в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного
развития
Динамика активности и характеристика пептидогидролаз в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его
личиночного развития
Активность эндогенного комплекса пептидогидролаз в тканях и органах тутового шелкопряда в связи с процессами
шелкообразования
V.2. Исследование протеолитических ферментов и их белковых
ингибиторов в эмбриогенезе тутового шелкопряда
V.2.I. Гетерогенность эндогенного протеолитического комплекса в грене
тутового шелкопряда
V.2.2. Гетерогенность комплекса белковых ингибиторов пептидогидролаз
в грене тутового шелкопряда
V.2.3. Динамика протеолитических ферментов и их белковых
ингибиторов в эмбриогенезе тутового шелкопряда
V.2.4. Субклеточная локализация протеолитических ферментов и их
белковых ингибиторов в яйцах тутового шелкопряда
V.2.5. Протеолитические ферменты хроматина грены тутового
шелкопряда
Глава VI. Ферменты белкового обмена как маркеры продуктивности и
явления гетерозиса у тутового шелкопряда
Закономерности биосинтеза главных аминокислот шёлка в тканях и органах контрастных по продуктивности пород тутового
шелкопряда
VI.2. Активность аспартат- и аланинаминотрансферазы в тканях и органах пород и гибридов тутового шелкопряда и связь их с явлением
гетерозиса
VI.3. Ферменты аминокислотного обмена как маркеры продуктивности и явления гетерозиса на эмбриональной стадии развития тутового
шелкопряда
VI.3.1. Активность ферментов аминокислотного обмена в грене
различных по продуктивности пород тутового шелкопряда
VI.3.2. Активность ферментов аминокислотного обмена в грене
родительских пород и гибридов тутового шелкопряда
VI.4. Протеолитические ферменты и белковые ингибиторы
пептидогидролаз как маркеры продуктивности и явления гетерозиса
в грене тутового шелкопряда
VI.4.1. Активность цистеиновых протеиназ и белковых ингибиторов папаина в грене различных по продуктивности пород тутового
шелкопряда
VI.4.2. Активность цистеиновых протеиназ в грене родительских пород и
гибридов тутового шелкопряда
Глава VII. Выделение и физико-химическая характеристика ряда ферментов белкового обмена из тканей и органов тутового
шелкопряда
Выделение и физико-химическая характеристика цитозольной аланинаминотрансферазы шёлкоотделительной железы тутового
шелкопряда
VII. 1.1. Разработка метода очистки аланинаминотрансферазы из
шёлкоотделительной железы тутового шелкопряда
VII. 1.2. Физико-химическая характеристика аланинаминотрансферазы.
VII. 1.3. Сравнительная характеристика аланинаминотрансферазы,
выделенной из насекомых и из других биологических
объектов
VII.2. Выделение и характеристика протеиназы с оптимумом рН 3,0 из
грены тутового шелкопряда
VII.2.1. Очистка протеиназы с оптимумом рН 3,0 из грены тутового
шелкопряда
VII.2.2. Физико-химическая характеристика пептидогидролазы с
оптимумом рН 3,0 из грены тутового шелкопряда
VII.3. Выделение и характеристика пептидогидролазы с оптимумом рН 3,4
из хроматина грены тутового шелкопряда
VII.3.1. Очистка пептидогидролазы с оптимумом рНЗ,4 из хроматина
грены тутового шелкопряда
VII.3.2. Характеристика пептидогидролазы с оптимумом рН 3,4 хроматина
грены тутового шелкопряда
Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Благодарности
Библиографический список.
Приложение
Введение к работе
Актуальность проблемы
Ферменты белкового обмена занимают ключевые позиции в метаболизме как по числу и разнообразию тех процессов, в которых они участвуют, так и по их физиологическому значению.
Ферменты белкового обмена участвуют в распаде и синтезе белков и аминокислот, образовании и детоксикации продуктов обмена (аминов, кетокислот, мочевины, аммиака), удалении аномально построенных белков и специальных превращениях аминокислот (аргинина, метионина, тирозина, триптофана, окси- и меркаптоаминокислот) (Майстер, 1961; Гауровитц, 1965; Бродский, 1966; Мосолов, 1971; Локшина, 1994; Степанов, 1996; Абрамова и др., 2002; Лузиков, 2002; Neurath, 1989; Han, Li, 2002). Контролируя концентрацию аминокислот, белков и биологически активных соединений, они обеспечивают интеграцию обмена веществ на уровне целого организма и воздействие на него нервных и гуморальных регуляторных механизмов (Старкова и др., 2000; Лузиков, 2002; Maurizi, 2002).
Ферменты белкового обмена вовлечены в осуществление многих физиологических процессов и клеточных функций (пищеварение, биогенез структур, адаптационные перестройки обмена, трансформация клеток). С нарушением деятельности многих из них связано возникновение патологических процессов и молекулярных болезней. Ферменты белкового обмена - точка приложения действия различных природных и синтетических агентов (метаболитов, антиметаболитов, лекарственных и токсических веществ). Поэтому изучение именно ферментов белкового обмена имеет принципиальное значение для расшифровки молекулярных механизмов таких сложнейших биологических явлений как дифференцировка, морфогенез, метаморфоз, изучении законов
наследственности, изменчивости, видовой специфичности, продуктивности и т.п., что и определяет неизменный интерес к их биохимии при решении многих задач науки и практики.
Уже более столетия в качестве удобного лабораторного объекта для изучения общебиологических закономерностей белкового обмена выступают коконопрядущие насекомые. Это объясняется исключительной интенсивностью, с которой осуществляются у них процессы азотистого обмена. На заключительном этапе личиночного развития белковый обмен у тутового шелкопряда, как впрочем и некоторых других коконопрядущих насекомых подчинён одной цели - синтезу огромных количеств белков шёлка. Подсчитано, что за короткий промежуток времени (7-12 дней) масса шелкоотделительной железы дубового шелкопряда увеличивается по отношению к исходной в 8271 раз (Ишмаев, 1937). Шелкоотделительная железа тутового шелкопряда вырабатывает около 140 мг фиброина в сутки, что не сопоставимо ни с одним изученным в этом аспекте биологическим объектом (Бродский, Нечаева, 1988).
Особенности морфологии шелкоотделительной железы шелкопряда обеспечивают широкие возможности для проведения сравнительных биохимических исследований. Шелкоотделительная железа состоит из двух отделов, в клетках стенок которых синтезируются резко противоположные по аминокислотному составу белки. В переднем (или серициновом) отделе образуется серицин, построенный в основном из серина, треонина, аспарапшовой кислоты и глутаминовой кислоты, в то время как в заднем (или фиброиновом) отделе синтезируется фиброин, 80-90% аминокислотных остатков которого представлено глицином, аланином, серином и тирозином (Kirimura, 1962). Основная масса шёлкового волокна (70-80%) состоит из фиброина, поэтому глицин, аланин, серии и тирозин принято называть главными аминокислотами шёлка.
Благодаря необычайно высокой скорости новообразования фиброина (38-1011 молекул в минуту) шелкоотделительная железа тутового
шелкопряда давно признана перспективной модельной системой для изучения механизма биосинтеза экскретируемых белков. Биологические системы, экскретирующие белки считаются удобными объектами биотехнологии (Баев, 1986; Егорова и др., 2003; Коничев, Севастьянова, 2003; Chen et al., 2003), что предполагает необходимость изучения механизмов их образования и функционирования.
История изучения биосинтеза белков шёлка насчитывает несколько десятилетий (Филиппович, 1964; Куллыев, 1965, 1977; Бирюкова, 1969; Караев, 1982; Михайлов, 1988; Филиппович и др., 1992; Akai, 1960, 1963; Jin, Kaplan, 2003). Накопленные к настоящему времени сведения о механизме образования фиброина укладываются в рамки общепринятой матричной схемы биосинтеза белка, однако, путь, пройденный при формировании этих представлений, полон противоречий. В 60-е годы прошлого столетия возникла концепция о существовании принципиальных различий в механизме биосинтеза глобулярных и фибриллярных белков (Gerber, Altman, 1961). Согласно этой концепции кристаллические и аморфные участки молекулы фиброина возникают отдельно (Антонов, 1964; Смирнов и др., 1964; Гумилевская и др., 1967), а окончательная сборка полипептидной цепи белка происходит вне рибосомы. Своеобразие механизма новообразования фибриллярного белка фиброина связывалось с уникальностью его первичной структуры - регулярностью расположения аминокислотных остатков по длине молекулы этого белка. Таким образом, механизму биосинтеза фиброина приписывали черты как матричной, так и пептидных схем (Антонов, 1964; Филиппович, 1964; Филиппович и др., 1992; Garel et al., 1974; Viswanathan et al., 1988).
Надёжные данные о закономерностях биосинтеза больших масс экскретируемых белков шёлка можно было получить различными путями и, как нам представлялось, один из них состоял в комплексном изучении важнейших ферментов, участвующих в формировании исходных структурных единиц для построения белков шёлка. Главные аминокислоты
шёлкового волокна происходят не только из аминокислот и белков корма, но синтезируются также de novo в теле насекомого (Филиппович и др., 1992; Horie et al., 1978; Osanai, Okudaira, 2001). Тщательный анализ литературных данных, проведённый к моменту начала данного исследования, показал, что пути ферментативного синтеза главных аминокислот шёлка в тканях и органах коконопрядущих насекомых были изучены крайне неравномерно. Наименее скудные сведения о ферментах аминокислотного обмена были присущи шёлкоотделительной железе насекомых. Мало разработанной оказалась количественная сторона аминокислотного обмена в тканях и органах шелкопряда, что не давало представлений о локализации и реальных масштабах синтеза аминокислот в них. Между тем, некоторые наблюдения свидетельствовали о том, что процессы аминокислотного обмена в тканях и органах этих насекомых протекают достаточно специфично. Об этом говорило, например, присутствие гликолатоксидазы в жировом теле (Muramatsu et al, 1966), а аминомалонатдекарбоксилазы -лишь в шёлкоотделительной железе (Shimure et al, 1956). Об этом же свидетельствовали данные о способности последней к избирательной сорбции свободных аминокислот из гемолимфы и ряд других особенностей (Клунова, 1970; Филиппович и др., 1992).
Качественные сведения о закономерностях обмена аминокислот у тутового шелкопряда первоначально были получены при изучении свободных аминокислот в его тканях и органах. Анализ динамики содержания свободных аминокислот в тканях и органах тутового шелкопряда по мере его развития продемонстрировал резкое несоответствие в соотношении и динамике их в гемолимфе, фиброиновом и серициновом отделах шёлкоотделительной железы, стенке и содержимом фиброинового и серицинового отделов и аминокислотным составом синтезируемых белков шёлка (Клунова, 1970). Отсутствие корреляции между уровнем свободных аминокислот и аминокислотным составом указанных белков объясняется существованием динамического равновесия между распадающимися
метаболитами и синтезируемыми белками. В качестве таких метаболитов, использующихся для создания исходных соединений для синтеза фиброина и серицина шёлка, могут служить белки и пептиды иных тканей шелкопряда. Так, японские исследователи установили, что 30% белков шёлка происходят из белков крови и тканей в последние два дня V личиночного возраста и во время завивки кокона (Fukuda et al, 1959; Shigematsu, Takeshita, 1968; Hirayama, Nakamura, 2002), а около 70% глицина, присутствующего в оболочке кокона, поступает из тканей шелкопряда (Koide et al., 1956; Horie et al., 1978). Однако роль отдельных тканей и, особенно, значение конкретных белков в качестве поставщиков азотистого материала для синтеза белков шёлка оставались не охарактеризованы. Между тем, система взаимосвязи и транспорта азотсодержащих веществ в шёлкоотделительную железу из тканей и органов через посредство гемолимфы напоминает систему печень - кровь -белокэкскретирующие органы у млекопитающих и может быть использована для изучения механизмов регуляции биосинтеза экскретируемых белков посредством переключения метаболических потоков (Koga, 1978).
Крупномасштабные процессы перестройки белков сопровождают не только период шёлкообразования, но являются стержнем белкового обмена на всём протяжении онтогенетического развития коконопрядущих насекомых (Кузнецов, 1948; 1953; Филиппович, 1963; Тыщенко, 1976; 1977; Клунова, Ярыгин, 2001). Лизис личиночных тканей на кукол очной фазе развития и распад запасных белков в период эмбриогенеза формирует метаболический фонд исходных азотсодержащих соединений, обеспечивающих новообразование белковых тел в ходе построения тканей и органов бабочки и нового поколения личинок. Процессы деструкции белков у насекомых протекают исключительно интенсивно и достаточно специфично. Среди пептидогидролаз насекомых найдены единственные в своём роде энзимы, субстратами которых являются такие устойчивые к
биодеградации белки как кератины и белки шёлка (Kofatos, Williams, 1964; Ward, 1975). Концентрация продуктов распада белков - свободных аминокислот и пептидов - чрезвычайно высока и является таксономическим признаком (Филиппович, 1963; Никитина, 1974; Филиппович и др., 1992).
Активность пептидогидролаз, обеспечивающих деструкцию запасных белков, закономерно изменяется в зависимости от фазы и стадии развития насекомых (Клунова, Ярыгин, 2001), что представляется важным для изучения природных механизмов регуляции не только активности протеолитических ферментов, но и кругооборота белков. Наиболее универсальным механизмом контроля внутриклеточного протеолиза является регуляция активности пептидогидролаз при посредстве эндогенных высокоспецифических белковых ингибиторов (Мосолов, 1983; 1994; Мосолов, Валуева, 1993; Валуева, Мосолов, 1999). По сравнению с ингибиторами протеиназ позвоночных животных о белковых ингибиторах протеолитических ферментов у беспозвоночных, в том числе и насекомых, известно значительно меньше.
Наибольшее народнохозяйственное значение среди коконопрядущих насекомых имеет тутовый шелкопряд, в области генетики и селекции которого ведётся напряжённая работа в поисках новых путей повышения его продуктивности и хозяйственной ценности.
Натуральный шёлк, продуцируемый тутовым шелкопрядом, значительно превосходит по своим технологическим показателям (прочности, химической устойчивости, термической стойкости) и гигиеническим свойствам (гигроскопичности, антистатичности) известные в настоящее время синтетические волокна. Начиная с 1989 года, производство шёлка-сырца в основных странах-производителях характеризует устойчивая тенденция к его возрастанию (Головко, 1991; 1992). Уникальные свойства белков шёлка инициировали к жизни идеи об использовании генно-инженерных подходов к получению модульных волокон, близких по свойствам фиброину (Gopinathan, 1992; Hinman et al., 2000; Bini et al., 2004),
и стратегии применения белков шёлка в качестве новых носителей для иммобилизации ферментов и лекарственных препаратов (Zhu et al., 1999; Zhu, Xu, 2001).
В связи с этим комплексное исследование закономерностей и ферментов белкового обмена, непосредственно вовлечённых в формирование фонда исходных структурных единиц для синтеза белков шёлка, в тканях и органах различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда с целью выявления энзимов, сцепленных с теми или иными хозяйственно- полезными показателями, в том числе и на ранних стадиях онтогенеза насекомого, представляет несомненный практический интерес. В этом направлении осуществлено весьма ограничешюе число работ, сводящихся к анализу в породно-гибридном аспекте некоторых энзимов аминокислотного обмена (аспартатаминотрансферазы, глутаматдегидрогеназы,
тирозинаминотрансферазы) лишь в гемолимфе - ткани, не принимающей непосредственного участия в биосинтезе белков шёлка (Минина, 1973; Филиппович и др., 1977; 1979; Егорова, 1983; Егорова, Насириллаев, 1987).
Различные виды коконопрядущих насекомых отличаются по объёму шелкопродукции, качеству шёлка, аминокислотному составу серицина и фиброина. Значительным пробелом в изучении закономерностей формирования экскретируемых белков у коконопрядущих насекомых является отсутствие данных об общих и межвидовых различиях параметров их белкового обмена. В связи с этим исследование параметров аминокислотного обмена в видовом аспекте в состоянии принести ценную информацию об организации ферментных систем синтеза главных аминокислот шёлковой нити, а также взаимосвязи биохимических процессов у коконопрядущих насекомых с их биологическими и экологическими особенностями, что безусловно представляется важным для установления общих и специфических закономерностей аминокислотного обмена в тканях группы коконопрядущих насекомых в целом.
В последние годы в области биохимии ферментов белкового обмена достигнут существенный прогресс. Определена доля белков, ответственных за биосинтез аминокислот у Е. coli (Nishida, 2001); установлена первичная структура более 150-ти пиридоксаль-зависимых энзимов (Mehta, 1993); разрабатываются прогрессивные подходы к классификации трансаминаз и пептидогидролаз (Степанов, 1996; Mehta, 1993). Основной объём работ, посвященный ферментам белкового обмена коконопрядущих насекомых, осуществлён главным образом на уровне гомогенатов отдельных их тканей или органов, в связи с чем сведения относительно свойств этих энзимов весьма немногочисленны. Поэтому получение гомогенных препаратов ферментов тутового шелкопряда и детальное исследование их физико-химических свойств представляет исключительный интерес как в сравнительно-видовом, так и в эволюционном аспекте. Кроме того, подробное физико-химическое исследование ферментов, наиболее тесно связанных с процессами шёлкообразования и продуктивностью коконопрядущего насекомого, может дать дополнительную информацию также относительно молекулярных механизмов продуктивности и гетерозиса тутового шелкопряда.
Цель исследования
Основной целью данной работы являлось изучение энзиматических систем, обеспечивающих формирование у представителей коконопрядущих насекомых фонда главных аминокислот шёлка (глицина, аланина, серина и тирозина); оценка тканевой, фазовой и групповой специфичности ферментов; расшифровка некоторых общебиологических закономерностей белкового обмена в связи с процессами синтеза и экскреции специфических белков и разработка на этой основе методов прогнозирования продуктивности и эффекта гетерозиса у тутового шелкопряда.
Задачи исследования
1. Изучить пути синтеза глицина, аланина, серина и тирозина в фиброиновом и серициновом отделах шёлкоотделительной железы и функционально связанных с ней тканях - гемолимфе и жировом теле трёх видов коконопрядущих насекомых - тутового шелкопряда (Bombyx тог і L.), дубового шелкопряда (Antheraea решу і G.-M.) и павлиноглазки Артемиды (Actias artemnis В.).
2. Установить на основании опытов по включению 2-14С-глицина функциональную роль в процессах шёлкообразования отдельных белков тканей и органов тутового шелкопряда на заключительном этапе личиночного развития насекомого и в период завивки кокона.
3. Исследовать эндогенный протеолэтический комплекс, проанализировать динамику активности пептидогидролаз в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития и сопоставить её с динамикой 14С-меченых белков тканей и органов в аналогичных стадиях развития насекомого.
4. Сравнить активность ферментов аминокислотного обмена и пептидогидролаз в тканях и органах личинки с аналогичными параметрами развивающегося зародыша тутового шелкопряда.
5. Изучить активность белковых ингибиторов пептидогидролаз в эмбриогенезе тутового шелкопряда, субклеточную локализацию протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в грене насекомого.
6. Исследовать взаимосвязь между активностью ферментов аминокислотного обмена, эндогенных протеиназ, белковых ингибиторов пептидогидролаз в тканях, органах и грене тутового шелкопряда и хозяйственно-полезными показателями ряда его пород и гибридов с целью прогнозирующей оценки по биохимическим тестам, в том числе, и
на ранних стадиях онтогенеза, основных хозяйственно-ценных признаков насекомого. 7. Осуществить выделение и очистку, исследовать физико-химические свойства ряда ферментов, активность которых в наибольшей мере коррелирует с процессами шёлкообразования и хозяйственно-полезными признаками тутового шелкопряда.
Научная новизна и теоретическая ценность диссертационной работы
Разработана система биохимических методов для детального изучения в фиброиновом и серициновом отделах шёлкоотделительнои железы и функционально связанных с ними тканях (гемолимфе и жировом теле) путей синтеза глицина, аланина, серина и тирозина. Впервые в шёлкоотделительнои железе и жировом теле тутового шелкопряда обнаружены НАД+-зависимая гидроксималонатдегидрогеназа, серин-гидроксиметилтрансфераза, треонинальдолаза, фенилаланингидроксилаза и окончательно подтверждено существование в них аспартат-4-декарбоксилазы. Охарактеризован путь новообразования глицина через производные малоновой кислоты, вероятный механизм образования глицина из серина и треонина, а также тирозина из фенилаланина. Осуществлена оценка реального вклада каждого из 10-ти энзиматических путей в биосинтез той или иной главной аминокислоты белков шёлка в исследуемых тканях шелкопряда.
На основании комплексного сравнительно-биохимического анализа ферментов биосинтеза глицина, аланина, серина и тирозина у трёх видов насекомых (тутового шелкопряда, дубового шелкопряда и павлиноглазки Артемиды) впервые сформулировано обобщённое теоретическое представление об универсальности и специфичности организации ферментов биосинтеза главных аминокислот шёлка у коконопрядущих насекомых.
Впервые показана целесообразность исследования в видовом, тканевом и онтогенетическом аспектах ферментов синтеза главных аминокислот шёлка для выявления перечня энзимов-маркеров при оценке функциональной связи между интенсивностью белкового обмена (объёмом шёлкопродукции) и его направленностью (аминокислотным составом белков шёлка) в тканях и органах коконопрядущих насекомых и, в том числе, в шёлкоотделителыюй железе тутового шелкопряда как удобной модели для изучения закономерностей биосинтеза в ней экскретируемых белков.
Впервые выявлены закономерности белкового обмена в тканях тутового шелкопряда на уровне отдельных 14С-белковых фракций при биосинтезе экскретируемых белков, на основании чего получена однозначная информация о месте и времени образования, особенностях обмена и закономерностях мобилизации белков в каждой ткани, в частности об участии конкретных белков гемолимфы в качестве поставщиков азотистого материала для новообразования в шёлкоотделительной железе главных аминокислот шёлка.
Охарактеризован комплекс протеолитических ферментов, участвующих во внутриклеточной деградации белков и, в том числе, обеспечивающих создание фонда свободных аминокислот в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития и в яйцах насекомого в процессе эмбриогенеза. Сопоставлена динамика активности пептидогидролаз с характером исчерпания запасных белков, благодаря чему установлена роль отдельных энзимов протеолитического комплекса в процессах деструкции резервных белков. Впервые выявлена тканевая специфичность в процессах мобилизации белков тканей при участии конкретных пептидогидролаз в ходе построения белков шёлка.
Впервые расшифрован комплекс белковых ингибиторов сериновых, цистеиновых и аспартильных протеиназ, обеспечивающих направленность процессов гидролиза белковых субстратов в грене тутового шелкопряда. Впервые исследована динамика активности протеолитического комплекса в
единстве с изменениями активности комплекса белковых ингибиторов на протяжении эмбрионального развития тутового шелкопряда. Выявлена дополнительность и взаимообусловленность характера динамики белковых ингибиторов и конкретных протеаз.
Установлена субклеточная локализация протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда. Анализ динамики и субклеточной локализации пептидогидролаз и их белковых ингибиторов позволил конкретизировать функции белковых ингибиторов при осуществлении различных процессов в ходе регуляции активности эндогенных протеиназ.
Впервые из представителя класса насекомых выделены в виде высокоочищенных белков важнейшие ферменты белкового обмена -аланинаминотрансфераза шёлкоотделительной железы, катепсин L-подобная протеиназа из грены, цистеиновая протеиназа с оптимумом рН 3,6 из хроматина грены тутового шелкопряда и охарактеризованы их физико-химические свойства.
Практическая значимость работы
Осуществлено комплексное изучение ферментов белкового обмена в тканях различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда. Установлена положительная статистически достоверная корреляция высокого порядка между уровнем активности ряда энзимов белкового обмена и хозяйственно-полезными характеристиками исследованных пород и гибридов насекомого, что позволило разработать и предложить надёжные тесты для прогнозирования в процессе выведения пород их потенциальной продуктивности и оценки эффекта гетерозиса в потомстве у гибридов тутового шелкопряда.
Инструкции по применению разработанных биохимических тестов рекомендованы Среднеазиатскому НИИ шелководства (г.Ташкент) и
Республиканской НИИ станции шелководства (пос.Иноземцево Ставропольского края) (сборник "Биохимические методы прогнозирования продуктивности, гетерозиса и оценки физиологического состояния полезных и вредных насекомых", МГПИ им. Ленина, 1975 с.24-38). Результаты проведённого исследования используются для ранней оценки родительских пород тутового шелкопряда при планировании программ скрещивания с целью получения эффекта гетерозиса в потомстве.
Вычленение из сложного комплекса ферментов белкового обмена тканей и органов личинки и грены тутового шелкопряда наиболее перспективных энзимов, сцепленных с продуктивностью, физико-химическая характеристика некоторых из них, установление их эндогенных субстратов представляет существенно новую информацию о молекулярных основах высокой продуктивности и эффекта гетерозиса у коконопрядущего насекомого.
На основании проведённых исследований разработаны методические прописи, предназначенные для постановки спецпрактикума по биохимии белков (сборник "Методы анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах насекомых" - М. МГПИ им. Ленина, 1980 ч. I с.24-38). Результаты исследований используются при чтении курса биологической химии, а также включены в семинарские и практические занятия со студентами Н-Ш курсов биолого-химического и географо-биологического факультетов Московского педагогического государственного университета.
Положения, выносимые на защиту
1. Ферментные системы синтеза главных аминокислот шёлка в тканях и органах коконопрядущих насекомых на заключительном этапе личиночного развития организованы однотипно, что является результатом узкой направленности процессов аминокислотного обмена у них на биосинтез специфически построенных белков шёлка.
2. Высокая скорость экскреции белков у тутового шелкопряда v поддерживается крупномасштабными процессами мобилизации
белковых ресурсов тканей насекомого. Определённые белки гемолимфы,
# активно синтезирующиеся в жировом теле и накапливающиеся в период активного питания в каркасе и стенке кишечника, являются поставщиками азотистого материала для синтеза в шёлкоотделительной железе главных аминокислот шёлка.
3. Процессы деградации запасных белков у тутового шелкопряда обеспечиваются преимущественно цистеиновыми протеиназами и характеризуются фазовой и тканевой специфичностью.
4. Совместная субклеточная локализация и альтернативный характер ф зависимости между величиной активности конкретных протеолитических
ферментов и соответствующих белковых ингибиторов обеспечивает четкую упорядоченность процессов протеолиза индивидуальных белков в ходе эмбриогенеза тутового шелкопряда.
5. Высокое сродство к эндогенным субстратам, являющееся характерным свойством ряда энзимов тутового шелкопряда (аланинаминотрансферазы шёлкоотделительной железы, катепсин L-подобной протеиназы грены и цистеиновой протеиназы с рН-оптимумом 3,6 хроматина грены) отражает узкую специализацию обмена и высокую скорость кругооборота белков у
• коконопрядущего насекомого.
6. Активность ряда ферментов белкового обмена может быть рекомендована для использования в качестве перспективного биохимического теста для прогнозирования в процессе выведения пород их потенциальной продуктивности и оценки эффекта гетерозиса в потомстве у гибридов тутового шелкопряда.
4 Апробация диссертационной работы
Основные положения и результаты диссертации были представлены на VII International Congress of Biochemistry, Токіо, 1967; XIII International Congress of Entomology, Moscow, 1968; III Всесоюзном биохимическом съезде, Рига, 1974; VI съезде, Воронеж, 1970 и VII съезде, Ленинград, 1974 Всесоюзного энтомологического общества; X International Congress of Biochemistry, Hamburg, 1976; VIII Всесоюзном энтомологическом съезде, Вильнюс, 1979; 2-ом Всесоюзном семинаре-совещании по генетике и селекции тутового шелкопряда и шелковицы, Ташкент, 1979; координационных совещаниях по шелководству, Ташкент, 1976, 1978, 1979, 1983; IX Всесоюзном симпозиуме "Структуры и функции клеточного ядра", Черноголовка, 1987; Международном симпозиуме "Актуальные проблемы мирового шелководства", Мерефа, 1991; координационном совещании шелководов стран СНГ, Мерефа, 1993; 5h European Congress of Entomology University of York UK, 1994; XX International Congress of Entomology, Firenze, Italy, 1996; Ленинских чтениях в МПТИ им. В.И.Ленина, 1974; научных сессиях по итогам научно-исследовательской работы Mill У, 1992, 1995, 1997,1999-2005 г.г.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 462 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов с их обсуждением, заключения, основных выводов и практических рекомендаций. Список цитируемой литературы, содержит 637 источников (192 отечественных и 445 зарубежных). Текст диссертации иллюстрирован 10-ю схемами, 51-ой таблицей, 60-ыо рисунками и приложением (20 таблиц и 10 рисунков).
