Введение к работе
Актуальность проблемы. Протеазы, расщепляющие
иммуноглобулины А1 (IgAl) человека, представляют собой высокоспецифичные ферменты, действующие на строго определенные пептидные связи в шарнирном регионе субстрата. Продукция IgAl-протеаз характерна для таких удаленных в систематическом отношении бактериальных патогенов человека, как Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, S. sanguis, которые вызывают у человека ряд опасных заболеваний: менингит, синусит, отит, бронхит, пневмонию, венерические заболевания и др. Ряд косвенных данных позволяет рассматривать эти ферменты в качестве одного из факторов патогенности микроорганизмов (Mistry et. al., 2006). Общепринятой является точка зрения, что их роль сводится к расщеплению секреторных IgAl, которые в больших количествах присутствуют на слизистых оболочках и обеспечивают первую линию защиты от бактериальных патогенов. Деградация антител IgAl-протеазами, таким образом, ослабляет иммунитет слизистых, что приводит к адгезии бактерий на стенках эпителия и колонизации ими слизистых. Однако активность IgAl-протеаз была экспериментально выявлена в таких биологических средах, как кровь, цереброспинальная жидкость и др., взятых от пациентов с соответствующими заболеваниями, что не позволяет рассматривать расщепление секреторных антител в качестве единственной функции этих ферментов (Vitovski et. al, 2002).
Работа по исследованию IgAl-протеаз осложнена, в первую очередь, отсутствием эффективных подходов, позволяющих получать функционально активный фермент в необходимом количестве. В результате до настоящего времени не установлена пространственная структура ферментов данного типа. Выделение IgAl-протеаз из природных источников связано с рядом трудностей: работа с патогенными микроорганизмами, подбор сред сложного состава для их культивирования, низкий уровень продукции фермента. Таким образом, для изучения функций IgAl-протеаз в патогенезе, особенностей фермент-субстратных взаимодействий и разработки эффективных ингибиторов требуется создание рекомбинантных продуцентов, позволяющих получать достаточные количества фермента и его мутантных производных. Однако эта техническая проблема до настоящего времени остается нерешенной.
Важной предпосылкой настоящей работы является впервые высказанная нами гипотеза о мультидоменной организации сериновых IgAl-протеаз (ЕС 3.4.21.72) по аналогии с другими известными протеазами с большой молекулярной массой: энтеропептидазой и бутулиническим токсином. Было предположено, что в структуре IgAl-протеазы наряду с каталитическим присутствует некаталитический субстрат-связывающий домен, ответственный за специфичное распознавание и связывание
субстрата. Эта гипотеза имеет теоретическую значимость, позволяя планировать эксперименты в области изучения ферментативной кинетики и субстратной специфичности IgAl-протеаз. Она важна и с точки зрения разработки ингибитора этих ферментов, который традиционно рассматривается в качестве перспективного агента для терапии перечисленных бактериальных инфекций. Наконец, расчленение IgAl-протеазы на изолированные домены могло бы оказаться удобным средством для создания рекомбинантных продуцентов фермента в условиях, когда продукция полноразмерного фермента в существующих системах экспрессии затруднена.
Цель и задачи исследования. В качестве цели работы рассматривалась экспериментальная проверка впервые выдвинутой нами гипотезы о двухдоменной организации сериновых IgAl-протеаз на примере фермента из N. meningitidis, что обусловливает наличие в их структуре двух центров взаимодействия с субстратом: каталитического и некаталитического субстрат-связывающего.
В экспериментальные задачи работы входило:
Определение границ предполагаемых каталитического и некаталитического субстрат-связывающего доменов путем сопоставления аминокислотных последовательностей различных сериновых протеаз и IgAl-протеазы менингококка; клонирование выбранных фрагментов генов, соответствующих доменам, с помощью ПЦР и разработка систем экспрессии рекомбинантных белков в Е. coli.
Разработка систем очистки и ренатурации полученных белков-доменов.
Изучение субстратной специфичности изолированного каталитического домена и сопоставление показанной активности с активностью нативного фермента из культуральной жидкости менингококка.
Разработка критериев оценки выхода нативного продукта при ренатурации изолированного некаталитического субстрат-связывающего домена.
Изучение специфичности и аффинности распознавания белков-лигандов изолированным некаталитическим субстрат-связывающим доменом.
Научная новизна и практическая значимость работы1. В рамках данной работы впервые выдвинуто предположение о существовании у IgAl-
Список сокращений: а.о. - аминокислотный остаток; БСА - бычий сывороточный альбумин; ДСН - додецилсульфат натрия; ДТТ - дитиотрейтол; КТД - каталитический домен; НСД - некаталитический субстрат-связывающий домен; ПААГ - полиакриламидный гель; п.н. -пара нуклеотидов; тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ; ТХУ - трихлоруксусная кислота; Ig - иммуноглобулин; NCA - Na-карбонатный буфер; PBS - фосфатно-солевой буфер; PBSTw - фосфатно-солевой буфер с Твин-20; S-IgA - секреторный иммуноглобулин А
протеазы N. meningitidis как минимум двух доменов, выполняющих различные функции. N-концевая часть полипептидной цепи, включающая в себя типичный для сериновых протеаз каталитический сайт (VLGDSGSPLF), отвечает за протеолитическую активность фермента, формируя каталитический домен. Другая же, большая С-концевая часть молекулы ответственна за специфичное распознавание и связывание субстрата (в виде IgA человека) - некаталитический субстрат-связывающий домен. В ходе работы нам удалось осуществить раздельную экспрессию белков, моделирующих каждый из двух предполагаемых доменов, и исследовать их функциональную активность in vitro. Каталитический домен сохранил способность расщеплять IgAl человека - единственный природный субстрат полноразмерного фермента, обладающий высокой устойчивостью к протеолизу неспецифическими протеазами. Также была подтверждена способность С-концевого домена связывать IgA человека. Нам впервые удалось показать, что полученный белок образует комплексы как с сывороточными, так и секреторными IgA, причем аффинность в отношении IgA2 оказалась несколько выше, чем в отношении IgAl. Обнаруженные свойства данного белка-домена позволят создать на его основе сорбенты для препаративного выделения IgA из природных источников, а также разработать высокоспецифичные иммунореагенты для детекции IgA в различных вариантах иммуноферментного анализа. Полученные данные о функциональных особенностях IgAl-протеазы в дальнейшем могут быть использованы при уточнении роли этого фермента в развитии менингококковой инфекции.
Положения, выносимые на защиту:
IgAl-протеаза N. meningitidis содержит два функциональных домена: каталитический и некаталитический субстрат-связывающий.
Каталитический домен сохраняет способность к расщеплению IgAl человека - природного субстрата полноразмерного фермента.
Изолированный некаталитический субстрат-связывающий домен обладает способностью к избирательному высокоаффинному связыванию сывороточных IgAl и IgA2 человека, а также секреторных IgA человека.
Апробаиия работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Biocatalysis - 2005: fundamentals and applications» (St.Petersburg, 2005); Юбилейных Научных Чтениях, посвященных 110-летию со дня рождения проф. Н.А.Преображенского (Москва, 2006) и 17-ом Европейском конгрессе «Clinical Microbiology and Infectious Diseases ICC», (Germany, Munich, 2007).
Публикации. По теме работы опубликовано 5 печатных работ (статей в рецензируемых журналах - 2, тезисов конференций - 3).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 151 страницах машинописного текста и включает 25 рисунков и 4 таблицы. Работа состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 183 ссылки.
