Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Запасные белки зерна пшеницы и их изменения при прорастании 8
2.1.1. Запасные белки пшеницы 8
2.1.1.1. Глиадин 9
2.1.1.2. Глютенин 12
2.1.1.3. Белковый комплекс клейковины 15
2.2. Изменения клейковины при прорастании . 17
2.3. Дезамидирование запасных белков при прорастании .. 20
2.4. Протеолитичеокие ферменты в зерне злаков . 25
2.4.1. Протеолитичеокие ферменты в покоящемся зерне... 25
2.4.2. Протеолитичеокие ферменты в прорастающем зерне. 29
2.4.3. Очистка протеаз злаков 35
2.4.4. Экзопептидазы 39
2.4.4.1. Карбоксипептидазы 39
2.4.4.2. Амино- и дипептидази 41
2.5. Распад запасных белков двудольных растений при прорастании 42
2.6. Сходство распада запасных белков в семенах двудольных и злаков 45
3. Материалы и методы исследования 48
3.1. Материалы 48
3.1.1. Растительный материал 48
3.1.2. Субстраты 49
3.1.3. Хроматографические материалы 50
3.2. Методы исследования 52
3.2.1. Определение протеолитической активности 52
3.2.2. Гидролиз белков клейковины 54
3.2.3. Определение амидного азота 55
3.2.4. Определение белка 56
3.2.5. Электрофорез 57
4. Результаты и их обсуждение 58
4.1. Протеиназа А прорастающего зерна пшеницы 58
4.1.1. Исследование возможностей очистки протеиназы А .. 58
4.1.2. Очистка протеиназы А 76
4.1.3. Некоторые свойства протеиназы А 82
4.1.3.1. Оптимум активности 82
4.1.3.2. Молекулярная масса 84
4.1.3.3. Действие некоторых эффекторов 86
4.1.4. Изменение активности протеиназы А при прорастании зерна пшеницы 88
4.1.5. Гидролиз клейковины пшеницы протеиназой А . 92
4.1.6. Итоги исследования протеиназы А пшеницы 99
4.2. Дезамидирование белков клейковины в прорастающем зерне пшеницы 103
4.2.1. Дезамидирование запасных белков пшеницы 103
4.2.2. Дезамидирование белков in vitro ферментными препаратами из прорастающих семян пшеницы... 107
4.2.3. О существовании фермента, дезамидирующего бежи. ИЗ
5. Выводы 115
6. Список литературы 116
- Дезамидирование запасных белков при прорастании
- Распад запасных белков двудольных растений при прорастании
- Исследование возможностей очистки протеиназы А
- Изменение активности протеиназы А при прорастании зерна пшеницы
Введение к работе
Начальные этапы роста, предшествующие переходу растения к автотрофному питанию, во многом определяют его последующее развитие. Из многих биохимических процессов, протекающих в этот период, одним из наиболее существенных является распад запасных веществ и, в частности, запасных белков семян, обеспечивающий питание проростка. Протеолиз запасных белков отличается от обычного внутриклеточного протеолиза тем, что происходит расщепление ограниченного числа белков, обладающих специфичной структурой, и тем, что механизм протеолиза включается лишь на определенной стадии развития растения в начале прорастания.
Особый интерес поэтому представляют способы регуляции распада запасных белков и возможная роль структуры последних в этом процессе.
Исследования последнего десятилетия, основанные на использовании собственных запасных белков в качестве субстратов, позволили показать существование протеиназ, инициирующих распад запасных белков (протеиназы А) и изучить их действие на запасные белки /53, 55, 143, 185, 193, 204/. Выявлена также физиологическая роль уже сравнительно давно известной модификации запасных белков при прорастании /5, 43, 192/. Эти результаты, однако, получены в основном при изучении семян бобовых.
В случае злаков также обнаружены протеиназы, сходные с протеиназами А, но очищена только соответствующая протеиназа зерна кукурузы /45/, а их действие на запасные белки не исследовано.
Не установлена также модификация запасных белков злаков при прорастании. Единственным указанием на возможность такой модификации является изменение физических свойств запасного белка пшеницы - клейковины при прорастании зерна /34, 35/.
Таким образом, в настоящее время нет достаточных данных для сопоставления механизма распада запасных белков злаков и бобовых растений.
В связи со сказанным в задачу настоящей работы входили: разработка методов получения высокоочищенного препарата про-теиназы А пшеницы, изучение ее действия на клейковину и изучение дезамидирования клейковины при прорастании, как одного из возможных путей ее модификации.
Научная новизна. С помощью ковалентной хроматографии на ртуть-сефарозе, гель-фильтрации и аффинной хроматографии на иммобилизованном гемоглобине получен очищенный в 1680 раз препарат протеиназы А пшеницы, содержащий более 50% активного фермента. Показано, что протеиназа А пшеницы способна к практически полному расщеплению клейковины до коротких (тет-ра-дипептиды) пептидов. Гидролиз протеиназой А протекает по "поодиночному" механизму.
При прорастании пшеницы происходит дезамидирование клейковины. За первые два дня прорастания содержание амидного азота в клейковине снижается на 14-18$.
Показано, что дезамидирование при прорастании - ферментативный процесс, который является, очевидно, причиной ослабления клейковины и повышения ее растворимости в воде и растворах солей.
На защиту выносятся следующие положения:
І. Ковалентная хроматография на ртуть-сефарозе в сочетании с гель-фильтрацией на сефадексе Г-100 и аффинной хромато-
графией на иммобилизованном гемоглобине позволяет получить высокоочищенше препараты протеиназы А пшеницы.
Протеиназа А гидролизует до 90$ белка клейковины пшеницы по "поодиночному" механизму с образованием коротких пептидов (тетра-дипептиды).
При прорастании пшеницы происходит частичное дезами-дирование клейковины, которое вызывает изменение ее реологических свойств.
Дезамидирование клейковины при прорастании является ферментативным процессом.
Настоящая работа выполнялась в лаборатории химии белка Кишиневского государственного университета им. В.И.Ленина в 1978-1983 гг. в связи с плановыми темами "Исследование растительных белков" (с 1978 по 1980 годы), номер госрегистрации 6807I76I и "Исследование белков семян культурных растений, разработка основ повышения их качества и методов получения белковых изолятов для пищевых целей" (с 1981 года, номер госрегистрации 8I0I2I94).
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Дезамидирование запасных белков при прорастании
В предыдущих разделах приведены литературные данные, свидетельствующие о роли водородных связей в структуре клей-ковинного белка и показано, что их разрыв может быть одной из основных причин ее быстрого ослабления в начале прорастания. Изучение аминокислотного состава клейковинных белков дает важные сведения об их структуре и способах межмолекулярного взаимодействия. Как известно, глутаминовая и аспарагиновая кислоты в виде их амидов составляют до 40$ всех аминокислот клейковинных белков /16, 63, 209/. Водородные связи в клейковине могут образовываться за счет взаимодействия многочисленных амидных групп остатков глутамина и аспарагина, а также за счет гидроксильных групп оксикислот серина и треонина. Холмс и Бриггс /120/ экспериментально показали, что высокое содержание амидных групп в клейковине пшеничной муки обуславливает образование водородных связей. При уменьшении числа амидных групп на 10$ от их общего количества происходит снижение количества водородных связей, ведущее к потере хлебопекарных свойств пшеничной муки. Авторы приходят к выводу, что дезамиди-рование вызывает солюбилизацию белков клейковины. Еще одно подтверждение ведущей роли амидных групп в ассоциации белков пшеничной муки водородными связями удалось получить Беквитсу и сотр. /58/. Они изучали эффект замещения в клейковине амидных групп на эфирные. Эфирные группы обладают меньшим дипольным моментом по сравнению с амидными и поэтому они практически не способны к образованию водородных связей. В результате замены амидных групп на эфирные количество водородных связей в клейковине уменьшается и соответственно изменяются ее реологические свойства. При постепенном дезамидировании клейковины происходит ухудшение и затем полная потеря ею реологических свойств /58/. В дальнейшем эти результаты были подтверждены работой By и сотр., показавших, что при снижении содержания амидного азота с 279 до 249 мМ/ЮО г белка, т.е. всего на 10-12$, при рН 7,5 растворяется около 92% клейковины /214/. Таким образом, дезамидирование клейковинных белков, вероятно, является по крайней мере одной из основных причин изменения физических свойств клейковины. Сходство процессов, происходящих при прорастании, и процессов, происходящих при дезамидировании in vitro , может служить доводом в пользу того, что и при прорастании семян происходит дезамидирование запасных белков. При прорастании семян ряда двудольных наблюдается увеличение отрицательного заряда запасных белков. Это установлено для многих растений: арахиса /86, 87/, фасоли /141/, сои /75/, вики /39, 40/, нута /106, 107/, гороха /53/, кормовых бобов /151/. Некоторые авторы /40, 53, 75, 86, 87, 106, 107, 185/ объясняли увеличение отрицательного заряда дезамидированием запасных белков. Впоследствии были получены и экспериментальные данные, указывающие на протекание этого процесса в прорастающих семенах двудольных растений. Доссан и сотр. /86/ отметили возрастание электрофоретичес-кой подвижности запасного белка арахиса -арахина при прорастании, вызванное увеличением отрицательного заряда молекулы. Параллельно происходило уменьшение содержания амидного азота в суммарном белке, которое в течение 14 дней прорастания уменьшалось примерно вдвое. Шутов и Вайнтрауб /39/ обнаружили, что в семенах вики после 7,5 суток прорастания содержание амидного азота в вицилине и легумине соответственно на ТЧ% и 26% ниже, чем в белках из покоящихся семян. Такое изменение содержания амидного азота соответствует дезамидированию 77 остатков аспарагина и глутамина в молекуле легумина и 49 остатков - в молекуле вицилина. Шутов /40/ показал, что процесс дезамидирования протекает независимо от протеолиза. Индийские ученые подтвердили вышеприведенные результаты, обнаружив снижение содержания амидного азота на 28% в запасных белках семян нута, прораставших в течение 6 дней /106, 107/. Ими было описано также увеличение отрицательного заряда и константы элюирования запасных белков из проросших семян при хроматографии на ДЭАЭ-целлшгозе. Расширение зон при электрофорезе и пиков при хроматографии является, по-видимому, следствием различной степени дезамидирования одного и того же белка, создающей некоторую гетерогенность.
При прорастании семян кормовых бобов методом DS-электро-фореза были выявлены изменения электрофоретической подвижности глобулинов, указывающие на их раннюю модификацию /151/. Авторы предполагают, что эта модификация связана с ограниченным протео-литическим расщеплением запасных белков. После 7 дней прорастания они обнаружили быстрое снижение содержания амидного азота /151/.
Процесс дезамидирования запасных белков, протекающий в семенах при прорастании, обнаружен пока только у бобовых растений. Однако дезамидирование может протекать не только в запасных, но и во многих других белках, что говорит об общебиологическом значении этого процесса. Дезамидирование является одним из видов посттрансляционной модификации белков, обуславливающим их микрогетерогенность /32/.
Распад запасных белков двудольных растений при прорастании
Распад запасных белков семян двудольных растений и ферменты, осуществляющие этот процесс, изучены глубже, чем у злаковых.
Во многих двудольных растениях содержание запасных белков значительно выше, чем в злаках. В отличие от последних основные запасные белки двудольных относятся к глобулинам. Они локализуются в семядолях в форме так называемых алейроновых зерен или белковых телец, равномерно распределенных в клетках запасающей ткани семени.
Для двудольных растений характерно наличие двух основных типов запасных белков - 11S и 7S -белков, названных так в соответствии с приближенными значениями их коэффициентов седиментации /85/ или, иначе, их называют легумино- и вицилинопо-добными белками /89/. Молекулярная масса 11S -белков составляет 300000-400000. Они диссоциируют по трехступенчатой схеме: 11S +2 х 7S -6 х х 3S - 12 х 2S /2, 7, 8, 89, 203/.
Из 12 полипептидных цепей в молекуле 11 s -белка 6 являются кислыми субъединицами с молекулярной массой 27000-40000, а 6 других - основными субъединицами с молекулярной массой 20000-24000 /7, 9, 89/. Нативные легуминоподобные белки являются гексамерами, состоящими из 6 пар субъединиц. Каждая из пар включает основную и кислую субъединицу, которые связаны ди-сульфидными мостиками/88/. -белки также встречаются во многих двудольных растениях. Молекулярная масса их составляет 140000-200000. Они состоят из трех субъединиц с молекулярным весом 40000-70000. Однако, во многих случаях эти субъединицы в результате посттрансляционных превращений в той или иной степени расщеплены на фрагменты /НО/.
Кроме легумино- и вицилиноподобных белков в семенах двудольных растений содержатся и другие запасные белки, но их содержание, как правило, невелико.
Таким образом, запасные белки двудольных значительно отличаются по своему составу и свойствам от запасных белков злаковых. Тем не менее в процессе их распада имеется много общего. Как и у злаковых, в покоящихся семенах двудольных растений отсутствуют протеазы, действующие на нативные запасные белки /53, III, 105, 143, 185, 190/ и распад последних начинается под действием одстеиновых протеиназ, синтезирующихся de novo в прорастающих семенах. Они были обнаружены в прорастающих семенах гороха /53, 215/, вики /143/, вигны /116/, клещевины /203/, фасоли /163, 185/, маша /55/, люпина /190/, арахиса /54/.
Инициация гидролиза запасных белков регулируется осевыми органами зародыша, в которых происходит синтез цитокинина и гиббереллина и последующий их перенос в запасающие ткани /33/. При удалении осевых органов зародыша у прорастающих семян маша замедляется накопление вицилинпептидгидролазы /163/, в семядолях гороха нарушается синтез белка, РНК и протеаз /215/. Действие осевых органов на протеолиз восстанавливается при помощи цитокинина и гиббереллина /175, 205/.
Это доказывает, что увеличение протеолитической активности в прорастающих семенах является результатом индуцированного растительными гормонами синтеза протеаз. Две из перечисленных выше протеаз (вицилинпептидгидролаза маша /55/ и протеаза А вики /193/0 были очищены и их свойства исследованы сравнительно подробно. На примере вицилинлептид-гидролазы фракционированием в градиенте плотности сахарозы /79, 55/ и методом флуоресцентной микроскопии /55/ была показана локализация фермента в алейроновых зернах. Криспиле с сотр. /79/ показали, что фермент синтезируется на гранулярном эндоплазматическом ретикулуме и переходит в состав цитоплазма-тических пузырьков (везикул), которые затем от него отделяются и, сливаясь с алейроновыми зернами, проникают в них.
В случае протеазы А вики наиболее подробно изучены специфичность фермента и его действие на запасные белки /5, 43, 143/. Молекулярная масса протеазы А вики составляет 20000-25000. Она разрывает связи, образованные карбоксильными группами кислых и ароматических аминокислот и, возможно, лейцина, аланина, глу-тамина.
Под действием протеазы А от легумина вики первоначально отщепляются ряд коротких пептидов, затем происходит расщепление кислых субъединиц на короткие фрагменты /43/. При исчерпывающем гидролизе легумин полностью расщепляется до коротких (в основном ди- и трипептиды) пептидов /5/. Шутов и Вайнтрауб обнаружили, что после ограниченного гидролиза протеазой А запасные белки вики становятся доступными действию протеаз, содержащихся в покоящихся семенах /192/ и локализованных совместно с запасными белками в алейроновых зернах /20, 156, 171/. Было установлено, что для этого достаточно отщепления всего 1-2 пептидов от каждой молекулы запасных белков. Таким образом, роль протеазы А не ограничивается прямым гидролизом запасных белков. Под ее воздействием происходит модификация послед 45 них и в процесс их распада включаются и другие протеазы, не действующие на нативные запасные белки. Помимо протеаз покоящихся семян, на модифицированные запасные белки действует также цистеиновая протеаза В, обнаруженная в прорастающих семенах вики.
Так же, как и в злаках, в семенах двудольных обнаружены экзопептидазы, необходимые для завершения гидролиза запасных белков. Среди них сериновые карбоксипептидазы /147/, пептидазы и ариламидазы, гидролизующие ди- и трипептиды /91, 168/.
Шутовым и Поло /44/ была проведена 1600-кратная очистка одной из ариламидаз семян вики и показано, что она гидролизует смесь пептидов, полученную действием эндогенной протеазы А на легумин вики с образованием свободных аминокислот. ФПА-аза, как и другие ариламидазы, локализована в цитоплазме и, вероятно, завершающие этапы распада запасных белков происходят именно там.
Исследование возможностей очистки протеиназы А
Начальные этапы исследования нового протеолитического фермента в прорастающих семенах, включающие обнаружение активности и идентификацию, достаточны сложны в связи с необходимостью одновременной разработки оптимальных условий определения активности, сроков проращивания семян, способов извлечения из растительного материала и т.д. В случае протеиназы А прорастающего зерна пшеницы задача начального ее исследования в значительной мере облегчается наличием литературных данных об аналогичных ферментах в семенах бобовых и зерне злаков, в т.ч. пшеницы (см. раздел 2.4.2). На основе этих данных мы приняли начальные субоптимальные условия определения активности протеиназы А (рН 3,8-4,2; инкубация в течение 2-3 часов при 30; клейковина пшеницы и вицилин вики в качестве субстратов), которые далее были уточнены. Фермент извлекали водой, содержащей I мл/л 2-меркаптоэтанола, а в некоторых оговоренных случаях - 0,02 М раствором Na2S03.
В экстрактах из прорастающего зерна пшеницы мы обнаружили активность протеиназы, расщепляющей клейковину и вицилин (протеиназа А). Экспериментальное значение Ад о при определении активности протеиназы А в сырых экстрактах с помощью ТНБС составляло 0,1-0,2, что достаточно для исследования возможностей очистки фермента. В настоящем разделе активность протеиназы А мы выражали либо в экспериментальных значениях от обнаруживаемой в исходном экстракте, поскольку условия количественного определения еще не были разработаны. Активность протеиназы А определяли, главным образом, по расщеплению випиляна вики, периодически контролируя способность исследуемых ферментных препаратов гидролизовать клейковину пшеницы.
В качестве метода предварительной очистки протеиназы А вики успешно применялось изоэлектрическое осаждение балластных белков /41/. Мы попытались применить этот метод для начальной очистки протеиназы А пшеницы. К водному экстракту из ацетонового порошка при перемешивании добавляли 0,05 н НСІ до образования осадка (рН 4,5-4,8). Последний отделяли центрифугированием и перерастворяли при высокой ионной силе. Белок в осадке составлял 12$ от исходного и содержал лишь 6,5$ активности. Около 95$ активности обнаруживалось в надосадочной жидкости (табл. I). Таким образом, изоэлектрическое осаждение балластных белков практически не приводит к.очистке протеиназы А.
Для протеиназ А характерна склонность к образованию относительно устойчивых комплексов с другими белками в кислой среде при низких значениях ионной силы. Поскольку большая часть балластных белков водного экстракта не осаждается, естественно, что почти вся активность протеиназы А пшеницы остается в надосадочной жидкости.
В семенах бобовых, в отличие от злаков, вода экстрагирует значительную часть запасных белков, осаждающихся при под-кислении. При этом в результате взаимодействия с ЗБ осаждается и протеиназа А, а в надосадочной жидкости остаются многочисленные минорные балластные белки, удаление которых при последующих операциях очистки было бы затруднительным /21/. После перерастворения осадка, содержащего активность протеиназы А, последняя остается в надосадочной жидкости, если провести повторное осаждение при увеличенной ионной силе, что препятствует образованию комплекса /5/.
Примечание. Активность фермента выражается в экспериментальных значениях Ag Q, пересчитанных в соответствии с изменениями в объемах надосадочных жидкостей и растворов осадков в результате добавления 0,05 н HCI или NaOH. Субстрат - вицилин вики.
Этот принцип мы попытались использовать для очистки протеиназы А пшеницы, вводя в ферментный раствор белки, осаждающиеся в кислой среде при ионной силе 0-0,2. Такими белками могут быть, например, казеин или легумин вики. Перед использованием из препаратов казеина и легумина удаляли примеси, растворимые при ионной силе 0,2 в кислой среде. 2% раствор белка в . 0,2 М їїаСі доводили до рН 4,8 добавлением 0,05 н НСІ, осадок суспендировали в 0,2 М Ласі и растворяли добавлением 0,5 н NaOH. Осаадение повторяли несколько раз до практически полного исчезновения белка в надосадочной жидкости после очередного подкисления. Затем осадки суспендировали в воде и растворяли добавлением 0,1 н иаон.
Каждый из полученных таким образом 2$-ных растворов казеина и легумина добавляли к исходному ферментному препарату (I объем экзогенного белка к 10 объемам ферментного раствора). Смесь доводили до рН 4,8 добавлением 0,05 н HCI, выпавший осадок I отделяли центрифугированием, суспендировали в исходном объеме 0,2 М NaCi, растворяли доведением рН до 6,5 и повторно подкисляли до рН 4,8. Выпавший осадок П отделяли центрифугированием. Результаты определения активности в одном из опытов приведены в таблице I.
В результате проведенного двукратного изоэлектрического осаждения содержание белка в надосадочной жидкости при ионной силе 0,2 снизилось по сравнению с исходным экстрактом приблизительно в 30 раз, а активность протеиназы А - на 60$. Таким образом, при 40 -ном выходе была достигнута 12-кратная очистка фермента. При этом следует отметить, что исходная активность протеиназы А в экстракте может быть значительно завышенной из-за присутствия других протеолитических ферментов и, следовательно, выход активности - заниженным.
Увеличение абсолютной активности в конечной надосадочной жидкости по сравнению с осадком I обусловлено систематической ошибкой ее определения в осадке, обусловленной присутствием в инкубационной смеси значительного количества казеина и легумина, гидролиз которых не может быть учтен в холостом определении /41/.
Изменение активности протеиназы А при прорастании зерна пшеницы
В подавляющем большинстве работ при изучении динамики протеолитических ферментов в прорастающих семенах определяют активность в неочищенных экстрактах из семян на разных стадиях прорастания. В некоторых случаях при применении специфических субстратов, гидролизуемых только одной из многочисленных протеаз в покоящихся и прорастающих семенах, это оправдано. Такими субстратами являются, например, синтетические производные аминокислот ( її,сІ-бензоил-Д, L-аргинин-/г-нитроанилид; L -фенилаланин-п-нитроанилид и др.). Однако число субстратов, обладающих достаточно четко выраженной специфичностью (т.е., гидролизуемых только одним ферментом) невелико. Так, классический субстрат карбоксипептидаз Z-Phe-Aia гидролизуется и некоторыми эндопептидазами /207/. Возможно, этим и объясняется наблюдаемое увеличение активности карбоксипептидаз в семенах некоторых растений, в том числе пшеницы /181/.
Нативные легумин и вивдлин (или легумино- и вицилино-подобные белки) являются специфическими субстратами для протеиназ, инициирующих их распад в прорастающих семенах бобовых.
Так, вивдлинпептидгидролаза маша и протеаза А вики являются единственными протеиназами в прорастающих семенах, способными гидролизовать нативные запасные белки, по крайней мере в кислой среде. В семенах бобовых обнаружена металлопротеиназа, действующая на нативный lis белок при рН 8 /70/. Тем не менее, исследование динамики протеиназ с использованием неочищенных ферментных препаратов даже при определении их активности по нативным ЗБ дает искаженные результаты, главным образом, из-за присутствия ряда ферментов, не действующих на нативные ЗБ, но гидроли-зующих либо ЗБ после их модификации ограниченным протеолизом /43/, либо пептидные продукты частичного распада ЗБ под действием исследуемой протеиназы /124, 162, 183/. Ферментами, гидро-лизующими пептидные продукты распада ЗБ в семенах пшеницы, являются преимущественно карбоксипептидазы.
Таким образом, очевидна необходимость частичной очистки исходных ферментных препаратов перед определением активности протеиназы А для изучения ее динамики при прорастании зерна пшеницы. Мы проводили такую очистку с помощью ковалентной хроматографии на Hg-сефарозе. При этом, помимо удаления карбокси-пептидаз, являющихся сериновыми протеазами, не связывающимися с Hg-сефарозой (вероятно, частично удаляются и другие протеази), отделяется большая часть балластных белков, присутствие которых вносит ошибку в определение активности /40/ и, что не менее существенно, происходит концентрирование ферментного раствора, повышающее чувствительность определения. Последнее важно для обнаружения активности на ранних стадиях прорастания зерна.
Следует оговорить, что при хроматографии на Hg-сефарозе происходит значительная потеря активности протеиназы А. Поэтому полученные абсолютные значения активности в расчете на I семя более или менее условны, так как мы условно принимали, что выход фермента при хроматографии на Hg -сефарозе одинаков для препаратов, полученных из зерна на разных стадиях прорастания.
Результаты исследования динамики протеиназы А в прорастающем зерне пшеницы приведены на рис. 13. Активность по отношению к винилину и клейковине быстро увеличивается в период наибольшей скорости распада суммарного белка, достигает максимума на 4-й день и затем убывает.
Отношение активностей по расщеплению вицилина и клейковины в интервале 1-8 дней постоянно и составляет 2,63+0,10. Из этого постоянства следует, что оба субстрата, вероятно, гидролизу-ются одним и тем же ферментом (протеиназой А). Это позволило нам в процессе очистки протеиназы А использовать в качестве субстрата вицилин, более удобный, чем клейковина, благодаря своей хорошей растворимости.
Небольшая активность по отношению к випилину и клейковине была обнаружена и в покоящемся зерне. При этом отношение этих активностей составило 0,42. Резкое изменение отношения активностей по расщеплению вицилина и клейковины в первый же день прорастания свидетельствует о присутствии в покоящихся семенах другого фермента, обладающего активностью по отношению к препарату клейковины, использованному в настоящей работе.
Активность этого фермента исчезает или, по крайней мере, резко снижается уже в течение первых суток прорастания, о чем свидетельствует постоянство отношения скоростей гидролиза вицилина и клейковины после 1-го дня прорастания.
Следует отметить, что мы не смогли обнаружить активность фермента, гидролизующего клейковину, в неочищенных экстрактах из покоящегося зерна, что находится в соответствии с результатами Бакара и сотр. /4/. Даже после г 15-кратного концентрирования хроматографией на Hg -сефарозе величина активности по хорошо очищенному запасному белку - вицилину - лишь незначительно превышала ошибку определения. Активность по клейковине выше, однако, в этом случае, возможно, гидролизуются примеси неклейковинных белков. Таким образом, вопрос о наличии в покоящихся зерновках фермента, гидролизующего собственные ЗБ, остается открытым. Исследование характера и глубины гидролиза белков протеи-назами предъявляет следующие требования к ферментным препаратам: 1. Ферментный препарат не должен содержать примесей других протеолитических ферментов, действие которых на исходный субстрат или продукты частичного его гидролиза может исказить полученные результаты. 2. В ферментном препарате должны практически отсутствовать примеси балластных белков, поскольку их гидролиз также может исказить результаты определения степени гидролиза. 3. Для достижения исчерпывающего гидролиза белкового субстрата необходимо располагать высокоактивным концентрированным препаратом протеиназы.
