Введение к работе
- 2 -
Актуальность проблемы. Исследование молекулярно-ге-нетических основ онтогенеза относится к разряду фундаментальных проблем как общей, так и физико-химической биологии .
В 1987 г. вышло две отечественные книги: "Теоретические и математические аспекты морфогенеза" и "Биологический морфогенез" Л.В.Белоусова. Общим для них является то, что основательно рассмотрены теоретические и экспериментальные проблемы эмбрионального формообразования у животных организмов. Определяя биологический морфогенез как процесс возникновения и усложнения форм и структур в течение онтогенетического развития организма, исследователи отчетливо понимают необходимость системного подхода при анализе закономерностей структуризации организма от субклеточного уровня до "макроскопического" целого [Белоусов, 1987]. Экспериментальный анализ молекулярных и субклеточных основ механизмов развития животного организма с точки зрения физико-химических событий формообразовательных процессов был впервые начат в 1936 г. Т.Морганом [см.Белоусов, 1987] и продолжен - на растительном объекте В.Г.Кона-ревым в 1958 г. [Нуклеиновые кислоты и онтогенез растительной клетки; Нуклеиновые кислоты и морфогенез растений; 1959]. Анализ этих проблем в лабораториях Дж.Боннера [1968], А.Мирского [см. Олфри и др., 1968], способствовал молекулярно-генетическому направлению как в биологии индивидуального развития, так и в биологии гена.
Молекулярная биология открыла "целый мир" взаимосвязанных внутриклеточных процессов, лежащих в основе цитос-келетно-мембранных преобразований (ЦСМП) клеток в морфогенезе [Исаева, Божкова, 1987]. Но понимание проблемы - на каких все-таки принципах основана формообразовательная самоорганизация живых систем - до сих пор остается дискуссионным. Особенно остро стоит вопрос о биологической организации индивидуального развития организма во взаимосвязи с механизмами генетических и эпигенетических процессов. Эпигенез определяется как изменение экспрессии генов в организме с дифференцированными клетками, наследуемыми митоти-чески [Robin, 1994]. С этой позиции важным в процессе понимания молекулярных движущих основ морфогенеза является интегрирование в одно функциональное целое: цитоскелет-но-мембранных преобразований (ЦСМП) совместно с надмолекулярной структурированностью всех компонентов клеточного ядра.
В отечественной литературе в последние годы появились две книги И.Б.Збарского: "Организация клеточного ядра" [1988] и "Скелетные структуры клеточного ядра [Збарс-
- З -кий, Кузьмина, 1991], в которых делается заключение о том, что ядерный матрикс, выполняя регулирующую роль в процессах репликации и транскрипции, "управляет кардинальными биологическими явлениями роста, развития и клеточной диф-ференцировки". Возможная регуляция морфогенетических процессов при вовлечении определенных последовательностей ДНК, во взаимосвязи с структурированностью ядра, обсуждается в работах К.Шерера [1984]. Общим для всех работ в области исследования индивидуального развития является то, что в них рассматривается биология развития отдельных генов эмбрионального морфогенеза главным образом животных организмов.Процессы ростового морфогенеза основанные на размножении и растяжении клеток практически не обсуждаются .
Таким образом, чтобы понять закономерности механизмов индивидуального развития молекупярно-генетических основ, в данном контексте - постэмбрионального онтогенеза (т.е. ростового морфогенеза у растений), не теряя целостности индивидуального развития организма, целесообразно представить биологическую организацию в иерархии системного подхода: полуляция-> организм-> орган-> клетка (субклеточные органеллы - клеточное ядро) -> надмолекулярные структуры клеточного ядра (нуклеоплазма, хроматин, ядерный матрикс).
Цель и задачи исследования. Основная цель - исследовать включение эндогенных внутриядерных механизмоа на уровне белковых компонентов, вовлеченных в регуляцию мор-фопроцессов, индуцированных влиянием тепловых свойств воды, прошедшей через эндосперм в покоящиеся зародыши пшеницы .
В связи с этим были поставлены следующие основные задачи:
-
Провести отбор относительно физиологически однородных покоящихся зародышей (О ч) и растущих проростков (24 ч -> 48 ч... через интервалы в 24 ч до остановки роста колеоптиля), используемых для выделения популяции клеточных ядер и их надмолекулярных (фракций) структур (нуклеоплазмы, хроматина, ядерного матрикса).
-
Определить компонентный состав (белок, ДНК, РНК, углеводы) надмолекулярных структур (фракций) клеточных ядер.
-
Определить динамику содержания эндогенного ауксина в надмолекулярных структурах (фракциях) клеточных ядер.
-
Определить активность сериновых протеиназ и их ингибиторов на фоне общей антиоксидантной активности перокси-дазной системы в надмолекулярных структурах (фракциях) клеточных ядер.
-
Выделить из надмолекулярных структур клеточных ядер ме-
тодом аффинной хроматографии трипсиноподобные протеина-эы (ТП-) и ингибиторы трипсина (ИТ-), определить их компонентный состав (белок, ДНК, РНК, углеводы, эндогенный ауксин).
-
Провести анализ молекулярных масс белков ТП- и ИТ-комплексов методом электрофореза.
-
Провести электронномикроскопический анализ ТП- и ИТ-комплексов
-
Определить аминокислотный состав гистонов и негистонов, фракционированных на колонках с амберлитом ИРЦ-50, провести их электрофоретический анализ и определить включение 32Р и 1'С в гистоновые и негистоновые фракции хроматина.
Научная новизна результатов исследования. Впервые проведено экспериментальное комплексное исследование с учетом закономерностей индукции прорастания: организм-»ор-ган->клеточное ядро, во взаимосвязи с индукцией включения внутриядерных механизмов закономерностей структуризации на уровне белковых компонентов нуклеоплазмы, хроматина, ядерного матрикса.
Примененный экспериментальный подход позволил рассмотреть один из главных механизмов процессинга ядерных белков (молекулярно-генетических основ онтогенеза) - активность ядерных протеиназ, вовлеченных в регуляцию экспрессии генов, на уровне биологической организации: организм -> орган -> клеточное ядро -> надмолекулярные структуры -> фермент.
Получены новые экспериментальные данные общей антиоксидантною активности пероксидазной системы, главным образом, функционирующей на уровне нуклеоплазмы и хроматина.
Получены новые экспериментальные данные о динамике содержания эндогенного ауксина в надмолекулярных структурах (фракциях) клеточных ядер, которая взаимосвязана с физиологическими особенностями онтогенетического роста и развития колеоптиля.
Получены новые экспериментальные данные о локализации в ядерном матриксе трилсиноподобных протеолитических и ингибитортрипсиновых комплексов, содержание которых также взаимосвязано с физиологическими особенностями роста органов проростков.
Предложена концепция, позволяющая объяснить включение внутриядерных механизмов структурной реорганизации клеточных ядер на уровне белковых компонентов нуклеоплазмы, хроматина, ядерного матрикса при индукции ростового морфогенеза у растений.
Научно^пракл_ичес_кая_^елно_схь_.о.аб^)льг^ Разработанный комплекс методов анализа эндогенных механизмов ростового морфогенеза был доложен в 1993 г. на 11-й Московской кон-
пленарного д.':'л:і.г'.а: "<">іггог^і .етнчеі'К"-і молені.. ;;л<=. оцеп;:к ог-:оііогичс_:хон '>-ооіт.-.'..'нести и мелсшилмиї Дє.-йотвіія іц-пмомио-мі;>. Х1-..ЧИ і-- >.:::. р- : 4;.я гс;.о:і і-.. от.\" . ? /viVH. ч-.'„ ...к .Ч-ртлци-о;і!і'.'к р.г-'-. -і-. ;if c.iL-.v. іііііК д^ *: ч.і.ілі-і.ч. .ч.-;"чул.;г,і,' іч-штД'И'-іс-ч'>а=л осго.- f ;-.: /оч.,г рас^ч-іі: it-. ;;^v'іч-:: S'---.w-o.i^i п цр. , 1оо7,13u;'j ,ч 1-л,.>е і-!і ч гріши сииіи;урел''Фуі;кц;)ОН;'ілкий« ак тионо'.ггі- :-.л..-т..-ч:-.-.:>: =.д-р" з Б;ч.:к.ирс*:о« ГУ. :\я\.р^отоны и зашии.е;;:.: аг-гj,-j.4;ic. сзімзє^єл-стіі?. ;::l .то со О:-.:: і-ш!':,лениа і^аСі'НТе.ЛЬНЬІК КНЄТоЧі-ІОХ Ядер, йДЄрИи>. пуопнназ..
Гі.і:ок.'.іі;ія >о^і'.іс:^;«чі :ія .їлиту: І-І-ЗііЛ-чилекул-ірга-о структу
ры "кїьуто~ЇПНЇГ1*їїгїГ~ї^^ ~уксин, динамика кото
рого зависит ст физиологии роста прорс соков. З.Трппопиоподо-
Снь>е прілелноіЗп np»iC/TO'i-ey.VT з структура;-: ядер, и>: активность
н содержаний зда.-;с>л' от физиологии рост.:* проростись. '.Ядер
ные надмолекулярное структуры проявляют общую антиоксидантную
актняьосг;.., которая зі.шисиг от Физиологии лр-jix-ctkob.
Аиі.-._у>дц::я i>a'.)Oi-„j- Материалы диссертации доложены на ЗсиСо.ч/ЗП-м 3..^>;. ікичееко.ч ссье:^данн 'Тйсуи^ол^-ч^е белки и их биооинго'-" (МслкіК:, . 1975 ' : Третьей Уральской к .'Нфоренцин генетиков и селекционеров "Генетики и селекционеры Урала -Кґірсцнзе.у ко-з-ійству" (Свирдловск, 1SC-1); Яторс-к Есоеоюзном .'икло^ну^Я: "'i<.'.<-.-.:-.:i.-.-u i/eivs -й я;:ал;'ац:'):" (І-ІарадйГ, 1985:; ВСЄСОЮ.-НОЙ конфоронпки "Молекулярна*- биология генов в.ісі;і!Х p.. ..:.;. -v..;;'" -.У.'- :-:_<.j , 1 ? r"-7', : г.ч--осл'>;-:.-;! цауч;-*.»;.- :-:он-феу<г-.ц;-.,: '"!':-.-:':еіі,е vi'-гчч :ч.>іс^і-:х. растении" (Гліші'.к^ "о, 19c'.9 ) ; X Всесоюзним симпозиуме "Структура и Функции клегочного яд-ра" (Гродно. 1J:S0); 20-tl. Meeting of the "cur't-dt i^u of Su-ropcan Biochemical Societies CB.ioV-pesl., 19S0); Втором СЬ-е-^Де Все л'К...'І-.00О 'C'lA-TTBi! '.'.ІГІИСЛуі'ОЕ paCTtrH-'W (Мі--НЄК.
IfipC'. ; 7;-о:і-є:-і "оссоігл :о.ч сі:;-;і;о-..,гіу>;є "Клотаи.ї.-і;* мєншіИ-і-Чілі ;.ъуч.. Лї-іИ.;" ;:-!-.-і- > ;'cl>. ".Пі'*.'; 35-'h Іг'.,аг:і.-.1.-І.-. і.лі Соп^і-''^;-of Зіосле.яі.?.try (Israel, 1SS1); Third International Congress of Plant Molecular Biology (Tucson, Arisona, USA, 1991); Третьем съезде Общества физиологов растении (С-Пе-терОург, ІЗсіЗ); Одиннадцатом Всероссийском симпозиуме "Структура п функции клеточного ядра" (С~ПетерСург, 1933); Второй конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 19'"СЗ) ; 1-ом сьезде Завидовского общества генетиков и селекционеров С Саратов, 193-1); International Plant Protection Congress (Hague, 1B95); всероссийском симпозиуме "Биология клетки в культуре" (С-Петербург, 1995); всероссийском симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1S9S); 10-th FESFP Congress "From molecular mechanises to the plant: an integrated approach" (Italy, 1S3S); 8-th International Congress of Mycology Division (Israel, 1SS6); XII Всероссийский симпозиум "Структура и Функция клеточного ядра" (С-Петербург, 1S96).
Пу^лик-чпнп. Материалы диссертации опубликованы в ви-
де 40 работ в отечественных и зарубежных изданиях.
Объем и структура работы. Работа изложена на 427 страницах, состоит из введения, общего обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 99 рисунком и 22 таблицами и схемами. Список цитируемой литературы содержит 584 работы, из них 357 на русском и 227 на иностранных языках.
