Введение к работе
Актуальность проблеми. Повышенное парциальное давление кислорода является необычным и неблагоприятным фактора:.: дм живых существ. Однако в последние годы гппербарическая атмосфера получила широкое применение в практической деятельности человека. Особенно она широко применяется при проведении подводных л кессонных работ (НироНКИН И др. ,1965; ЬатЛогЪссп. 1966; Икронкин, 1972; Зальцман и др.,1979; Гуляр,Ильин,I9S7) и внедрении гипербарической оксигенации в клиническую практику (joerom-..., 1964; Леонов, 1971,1976,1985; Петровский,Щуті, 1976,1978,1935; Бурежов-ский,Бокерия,1974; Когп е.а., 1977; Ратнер,1979; Блага,1933). В связи с этим возникает настоятельная необходимость изучить. о&п.ебиологические возможности завиты организглоз от избыточного содержания кислорода и насколько эти сложившиеся механизмы эффективны в условиях повышения его напряжения в среде. Поэтому раскрытие механизмов действия гипороксии па организм человека и животных является одной из важных медико-биологических проблем.
В процессе эволюции Земли, когда в атмосфера появился свободный кислород, хшвце организмы начали вырабатывать ке только механизм! защиты от его токсического действия, но и стали использовать полезные свойства кислорода - его высокий окислительно-восстановительный потенциал. Исходная недостаточность или истощение эндогенных антиоксидантних механизмов приводило к общетоксическому действию кислорода. Поэтому для выяснения механизма действия гипероксии на организм представляется важным изучение обде-токсической формы кислородного отравления. Однако до настоящего времени большинство исследователей сосредоточивали свое лш.ание прсаде 'всего на легочной и нервіїой формах кислородного отравлении (Прикладовицкиі'1,1936; Stadia е.а., 1945; №u)K>.j.rd, 1946,1968; Dickens, 1946а; ГершеновичДричевская, 1954, I960; Войне—Яссноцкий, 1958; Кричевская.1963;'Сорокин,1964; Itoinson е.е.. 1967;
2иронкин,І972; Кричевская и др. ,1980). Это вызвано тем, что при кислородной интоксшсации у высших животных и человека на первый план выступают патологические проявления со стороны легких и ЦНС. Литературные сведения, посвященные изучению действия ГБО на другие ткани (общетокепческая форма кислородного отравления), мало-числошш. Следует отметить, что литературные данные о состоянии процессов обмена веществ тканей в постгипероксическом периоде такке очень ограничении. В то же время важное практическое значение имеют вопросы, связанные с остаточными явлениями метаболических нарушений после воздействия на организм кислорода под давлением.
"Це-пі-то рпботн явилось изучение наиболее общих биохимических мехаїшзмов общетоксического действия ГБО в острый и отдаленные периоды. Нами исследовано влияние ГБО на биохимические процессы, которые являются характерными для разных органов и тканей и определяют функциональную направленность их жизнедеятельности.
Основные задачи исследования.
-
Изучение процессов перекисного окисления липидов в тканях при гипероксии и в постгипероксическом периоде;
-
Исследование активности супероксиддисмутазы тканей белых крыс сразу после действия ГБО (судорожное и терминальное состояния) и в лостгипероксическом периоде;'
-
Изучение влияния гомогенного препарата СОД на содержание перекисей липидов в ткянях и их гомогенатах при действии ГБО;
-
Изучение активности протонной АТФазы митохондрий мозга, печени, миокарда и скелетных мышц при воздействии на животных различных режимов ГБО (I и 5 ати) и в постгипероксическом периоде;
-
Исследование активности протонной АТФазы митохондриаль-ных препаратов мозга, печени, миокарда и скелетных мышц при их экспозиции в кислородной среде под давлением І ати в течение
60 мин и 5 ати в течение 10 и 60 мяк;
-
Исследование активности АТФазы и её зависимости от присутствия ионов Са , Mg2+, fla+, Kf, тритона X-IOO и уабаина в миелине, обогащенных нейрональной, глиальной л субклеточных фракциях головного мозга в условиях ГЕО;
-
Исследование содержания аммиака, глутамина, глутаминовой, аопарагпновой кислот, аланипа, активности глутамина зн, аспартат-
и алашшаминотрансфераз, количества и фракционного состава белков, белковых сульфгидрильных групп, іштвнсивнооти протеолитичес-ких процессов в тканях при гипероксии и а постгипероксическом периоде, а также определение содержания ГАМК и активности ферментов, участвующих в её метаболизме - глутаматдекарбоксилазы и ГАЩ-амикотрансфераз нервной ткани. На защиту выносятся положения:
а) активация процессов пердкисного окисления липидов тканей
животных, являющихся инициирующим механизмом патогенеза расстройств
при действии кислорода под повышенным давлением;
б) нарушения азотистого обмена и активности ферментов груп
пы трансаминаз, пептид-гидролаз, А'ГФаз тканой и их клеточных л
субклеточных структур, усугубляющих течение патологических про
цессов при кислородной интоксикации и в постгипероксическом пе
риоде;
в) большая чувствительность биохимических систем нейрогли-
альшос клеток к действию гипероксии, что позволяет рассматривать
неИроглию И её метаболические системы как первичное место дейст
вий избыточных концентраций кислорода на нервную систему.
Научная новизна. Основным теоретическим положением, развиваемым в работе, является постулирование наличия общих закономерностей изменения метаболлзш разных органов под влиянием гипероксии и в постгипероксический период. В работе систематизированы биохн- '
шчеокие механизмы общетоксического действия гипероксии. Важным моментом в этом плане является то, что основные показатели обмена веществ исследованы не только сразу после гиперокоии, но и в разные сроки постгипероксического периода. Оригинальность исследования обусловлена комплексним подходом, согласно которому учитывалось не только изменение отдельных компонентов, но и изучалась активность ферментов, регулирующих их метаболизм (СОД, глутамина-зы, аспартат- и аланинаминотрансфе^аз, ГАМК-аминотрансфераз, пептид-гадролаз, транспортных АТФаз).
На основании выполненных экспериментальных исследований впервые обоснованы:
-
Изменения метаболизма аммиака, глутамина, глутаминовой, аспарагиновой кислот, аланина, активности Аоп- и АлАТ, глутамина-зы, протонной АТФазы, белков и их сульфгидрильных групп в мозгу и других органах (печени, почках, миокарде, скелетных мышцах, селезёнке, крови) при гипероксии и в постгипероксическом периоде;
-
Сроки нормализации азотистого обмена и активности ферментов группы аминотрансфераз, пептид-гидролаз, транспортных АТФаз, которые наступают в основном через 25-40 оуток после действия ГБО;
-
Особенности нормализации лро- и антиоксидантних процессов в тканях в постгипероксическом периодеf
-
Эффекты внутривенновведенной СОД, а также с добавлением гомогенного препарата фермента на тканевые гомогенати, которые показывают, что в уоловиях ГБО лимитирующим звеном жизнедеятельности животных выступает повышение уровня перекисей липидов в нервной ткани; .
-
Влияние гипероксии на активность протонной АТФазы митохондрий тканей в зависимости от режимов ГБО и времени пребывания в кислородной среде;
-
Большая чувствительность биохимических систем нейроглиаль
них клеток к токсическому действию гипероксии;
V. Последовательность биохимических процессов в соотаге ответной реакции организма на гипероксию.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Исследование биохимии реактивности организма при дейотвии избыточных концентраций кислорода позволяет на фундаментальном уровне раскрыть патогенез кислородной интоксикации, в том чиоле применительно к респираторному стресс-синдрому и обосновать новые пути протекания и лечения кислородных отравлений.
В практическом отношении предотавляет интерес факт принципиальной возможности нормализации дане грубых изменений процесс в обмена веществ в тканях при кислородном отравлении. Этот процесо можно ускорить с применением различных препаратов, нормализующих нарушенные гипероксией процессы обмена веществ.
На основе проведенного исследования в плане прикладного значения предлагаются следующие практические рекомендации:
-
Приводимая нами общая схема последовательных этапов развития кислородной интоксикации указывают на ключевые пункты нарушения метаболизма различных тканей. Она позволяет более целенаправленно осуществлять профилактические и лечебные мероприятия при острых формах интоксикации кислородом;
-
Результаты работы могут быть использованы при разработка режимов гипербарооксигенотерапии и повышении резистентности организма к гипероксии;
-
Полученные данные о длительности последейотвия гипероксии указывают на необходимость осторожного подхода к использованию метода гипербаричеокой оксигенации в медицинской практике;
-
Исследование сроков восстановления нарушенного метаболизма в постгипероксичеоком периоде может помочь при разработке соответствующих лечебно-профилактических мероприятий.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всесоюзной конференции "Использование и влияние кислорода под давлением на организм" (Ростов-на-Дону,І969г.), ХУІІ конференции физиологов Юга РСФСР (Ставрополь,1969 г.). Республиканской научной конференции молодых ученых Дагестана (Махачкала,1970 г.), 2-й и 3-й Северо-Кавказских биохимических конференциях (Махачкала, 1970 г., Ростов-на-Дону,1976 г.), секции биохимии нервной системы Московского отделения Всесоюзного биохимического общества АН СССР (Москва,1971 г.), Всесоюзной конференции "Применение кислорода под повышенны;.! давлением в медицине" (Москва,1971 г.). У*-й и УИ-й Всесоюзных конференциях по нейрохиши (Ленинград, 1972 г., Ростов-на-Дону,1976 г.), П-й и П1-й Всесоюзных конференциях по биохимии мышечной системы (Ленинград, 1972 г.,1978 г.). Ш-м Всесоюзном биохимическом съезде (Рига,1974 г.). заседании Дагес--танского отделения ВБО (Махачкала,1975 г.)і ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава Дагестанского госуниверситета имени В.И.Ленина (Махачкала,1969-1981 г.г.), заседании кафедры биохимии и биофизики Дагестанского госуниверси-те а имони В.И.Ленина (Махачкала,1976 г), 1-м Всесоюзном совещании "Механизмы адаптации живых организмов к влиянию факторов среды" (Ленинград,1978 г.), научной конференции Лаборатории ги-пербаричесой оксигенации Института сердечно-сосуЕистой хирургии имени Л.Н.Бакулева АМН СССР (Москва,1979 г.), научном семинаре Лаборатории фармакологической адаптации НИИ по биологическим испытаниям химических соединений АМН СССР (Москва,1979 г.), заседании совета биологического факультета Дагестанского госуниверситета имени В.И.Ленина (Махачкала,1981 г.), УП-м Международном конгрессе по гипербарической медицине (Москва,1981 г.), 1-м Всесоюзном си.-позиуме "Фармакологическая коррекция киолородзави-
зимых патологических процессов" (Мос.'скі,І984 г.), III-ы Всесоюзном зкмпозиуме по гипербарической окшігенацші (Москва,1985 г.), заседа-ога кафедры оощеооразователышх дисциплин Даггосупиверситота клеш; З.И.Леішна (Махачкала,1988 г.), заседании кафйдры кздішлескоіі Оио-симии и лабораторной диагностики'Военно-медпщшскои академии имени J.М.Кирова (Ленинград, 1988 г.), межсафедральком совещании кафедр ишнігческоіі биохимии и лабораторной диагностики, физиологии подвод-гого плавания, патологической физиологии Воеино-кедацшіскоіі акаде-ши имени С.М.Кирова (Ленинград,1989 г.), 1У-м симпозиуме "Новое в теории и практике ГБО" (Москва,1989 г.).
Объём работы. Работа изложена на 381 стр. машинописного текста, состоит из введения, двух глав обзора литературы, постановки экспериментов и методик исследований, 4-х разделоз собственных исследований и их обсуждения, основных зкводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 686 источников. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 19 рисунками.
Постановка экспериментов и методики доследование
Опыты поставлены на 1450 половозрелых белых крысах обоего пола массой 150-200 г. Животных in vivo в барокамере подвергали действию кислорода под давлением 4, 5, 6 ати и выдергивали до наступления судорожного и терминального состоявши. При действии I ати кислорода белых крыс экспонировали в барокамеро в течение 60 та. В сериях опытов для исследования последействия П!0 на мета-Золиэм организма животных оставляли в условиях вивария на I час, [, 3, 5, 10, 15, 25, '.0 и 60 суток. Для сравнения брали контрольна крыс, не подвергнутых никакому воздействию. '.
Для определения активности супероксиддисмутазы (супероксид: зупероксид-оксидоредуктаза, КФ І.І5.І.І) подопытных нивотных быстро декапитировали, извлекала мозг, печень, рочки, сердце, скелет-^ ше мышцы, собирали кровь. Ткани гомогенизировали на холоду в
0,01 М фосфатном буфере рН 7,4, центрифугировали при 15.10 г в течение 20 юш в рефрижераторной центрифуге К-24. В качестве источника фермента использовали надосадочную жидкость. Определение активности СОД проводили методом Jlishikirtio.a., (1972),
Определение перекисей липидов проводили в 0,'о% гомогенате тканей, приготовленных на растворе Кребс-Рингера в присутствии аскорбиновой киолоты, по Ю.А.Владимирову и А.И.Арчакову (1972).
Субклеточное фракционирование мозга проводили в градиенте концентрации 0,32 М сахарози в рефрижераторных центрифугах К-24 и vao_60I по Wnittaicor (1965). Для определения перекисей липидов субклеточные фракции ре суспендировали в растворе Кребс-Ринге-ра.
Для исследования влияния гомогенного препарата СОД на содер-жшше перекисей липидов животным в яремную вену вводили 10 М препарата фермента, приготовленного на физрастворе. Контрольным животным вводили I мл физраствора. Через 20 мин после инъекции контрольного и подопытного ливотіінх подвергали дейотвию 5 ати кислорода. После наступления сильного судорожного приступа проводили декомпрессию, животных декапитировали и определяли содержание перекисей липидов в тканях.
Для определения перекисей липидов в опытах in vitro Ч*омоге-наты тканей с добавлением СОД (10" М) и физраствора экспонировали в барокамере под давлением 5 ати кислорода в течение 60 мин. Контрольные пробы за такой же период времени выдерживали в условиях нормального атмосферного давления на воздухе. По истечении времени экспозиции контрольные и опытные пробы инкубировали на качающей водшюй бане в течение 60 мин при 37 без предварительной аэрации кислородом. Инкубацию чаоти проб, экспонированных в условиях повышенного давления кислорода без СОД, проводили также
после добавления последней '.
Определение активности протонной АТОазы (ATw-фосфогидролаза, КФ 3.6.1.3) проводили в митохондриях мозга, печени, миокарда и скелетішх мышц белых крыо. Митохондриалькую фракцию печени, миокарда и скелетных мьшц выделяли с помощью дифференциального центрифугирования в 0,25 М сахарозе согласно прописи, данной в работе А.Д.Виноградова и др.(1977). После выделения митохондрий поверхность осадка ополаскивали 0,25 М сахарозой. Осадок суспендировали в 0,25 М сахарозе и растирали до гомогенного состояния. К суспензии митохондрий скелетных мышц добавляли раствор альбумина до конечной концентрации 0,1$. Полученные таким образом суспензии митохондрий хранили на льду и использовали для определения активности протонной АТФазы. Её активность определяли в инкубационной среде, содержащей 12,5 мкмолей трио-HCI буфера (рН 7,4), 2 моль динатриевой соли А.ТФ, 7,5 мкмоль Mgso^.S-IO-4 моль 2,4-ди-нитрофенола. Реакцию начинали, добавляя 0,2 мл суспензии митохондрий, содержащей 1-2 мг белка. Объём инкубационной смеси 2 мл. Инкубацию проводили в течение 15 мин при 3?С. Реакцию останавливали добавлением I мл 5$ ТХУ.
Для изучения влияния ГБО на активность протонной АТФазы ми-тохондриальных препаратов мозга, печени, сердца и скелетных мышц инкубационную смесь экспонировали в барокамере под давлением I атя в течение I часа и 5 ати в течение 10 и ВО мин. Контрольные пробы за такое лее время выдерживали в воздушной среде. По истечении времени экспозиции пробы инкубировали в термостате при 37С в течение 15 мия. Об активности ^-АТФазы судили по накоплению
' Исследование содержания перекисей липидов, активности СОД и влияния экзогенной СОД на уровень липидных перекисей при гиперок-оии проведено в 1977 г. в Институте биохимии АН Арм. ССР
неорганического фосфора в инкубационной среде в присутствии 2,4-динитрофенола совместно с J.ig2+ и при наличии только Mg2+. Определение неорганического фосфора проводили методом Н.А.Верж-бинской (1282). Активность 1Г*"-АТФазы выражали в мкмолях неорганического фосфора на мг белка за I мин.
Исследование активности Са +-, суммарной Mg2+,Na+, К*"- и уабаинчувствительной г»"а+,К+-АТйаз проводили в миелине, нейрональ-ной, глиальной обогащениях и субклеточных фракциях мозга белых крыс в норме и в судородном состоянии действия ГБО (4 ати). Для определения АТФазной активности субклеточное фракционирование нервной ткани проводили в рефрижераторной центрифуге "mistral 4L" и ультрагентрифуге kse -75. Выделение миелина, нейрональной и глиальной фракций проводили методом С.Роуза (Rose, 1965,1967; Siiiha, Rose, 1972). Об АТЯазной активности судили по нарастанию неорганического фосфора в инкубационной среде. Определение неорганического
фосфора ПРОВОДИЛИ В ДаННОМ Случае МеТОДОМ Mai-tin и Doty (I949)2'.
АТїазную активность выражали в мюлолях неорганического фосфора на мг белка. Белок определяли по Lowry и сотр. (1951).
Определение аммиака проводили в С-ззбелковых трихлоруксусных экстрактах тканей замороженных целиком животных сочетанием фенол-гипохлорктного метода (Rose е.а., 1957) с микродиффузионным (SQiigson.Seiigoon, 1951). Глутамин определяли по азоту его амид-ной группы, отщепившееся после 10-минутного гидролиза він H2so. на кипящей водяной бане (Силакова и др.,1962). Разделение глутами-новой, аспарагиновой кислот, аланина, ГАМК осуществляли методом
о \
; Определение АТФазной активности миелина, обогащенных нейрональной,. глиальной и субклеточных фракций мозга выполнено в период научной стаж- ровки в Англии в Лаборатории биохимии головного мозга (рук. - проф.С.Роуз) Открытого университета в 1974-75 г.г.
распределительной хроматографии на бумаге (Пасхина,1959). Количественное определение аминокислот проводили методом образогания медных производных аминокислот с нингидрішом.
Об активности гдутаминазы (ь-глутамин-ашідогидролаза, К<*> 3.5.1.2) тканей судили по нарастанию уровня аммиака в инкубационной пробе по сравнению с контролем.
Активность глутаминсинтетазы (і—глутаі.ют:вммиак-ллгаза, КО
6.3.1.2) М03Га ОПределШШ ПО Elliott (1948) в модификации Speck
(1949) и Pry (1955).
Активнооть глутаматдекарбоксилази (Ь-глутаматгкзрбокси-лиа-за, КФ 4.I.I.I5) мозга определили по накоплению ГАЫК в инкубационной пробе (Robei'to.Fronkel, 1950; Чикваидзе,І963). ГАМК в данном случае определяли электрофорезом на бумаге (Done, 1957).
Активность ГАЖ-аминотрансферазы (4-амиіюбутират:2-оксоглу-тараі-яиинотрансфераза, Кф 2.6.1.19) определили методом sisicun е.а. (1961). Об активности ГАМК-пируват-, ГАМК-ШК- и ГЛМК-ot-кетоглутаратаминотрансферяэ судили по приросту соответственно аланина, аспортата, глутамата в инкубационной ореде. Количественное определение аминокислот проводили методом хроматографии на бумаге (Насхина,1959).
Аспартат- (ь-аопартат:2-оксоглутарат-амкнотраисфераза, Км 2.6.1.1) и аланинаминотрансферазную (L-алспин:2-оксоглутарат-амлпотрансфераза, КФ 2.6.1.2) активность тканей определяли методом Heit:n'-.n и Frnnl'.el (1957).
Активность протеиназ (КО 3.4) определяли в экстрактах, полученных из ацетоновых порошков тканей. В качестве субстрата использовали лиофилизиропанный яичннй альбумин. В олучзе автолиза субстратом ткяневих протеиназ служили собствешше белки тканей. Активность кислой протеиназы определяли пря рН 4,3, нейтральной -при рН 7,4; интенсивность автолиза исследовали при нейтральном рН.
Об активности протеолиза и автолиза судили по приросту небелкового тирозина в опите по сравнению с контролем, которого определяли методом Lowry е.а. (1951). Актіг.чость протаминрасщепляющей пептид-гидролазы тканей определяли по А.В.Иалладину и Я.В.Велику (Pulledin.BGlik, 1970).
Фракичої ірование белков вели методом диск-электрофореза на полиакриламид юм геле по Мауреру (1971) в системе геля У* І. Фрак-' ционмровашію подвергали белки тканей, извлекаемые 0,9% HaCL.
Опроделсіше sh -групп водорастворимых белков тканей проводили методом ампериметрического титрования (Benesch.BenGsch, 1950; Кедрова,1962). Для освобождения зн -групп' от блокирования ионами тяжёлых металлов при гомогенизировании тканей добавляли 0,5 мл 0,001 н натриевой соли ЭДТА. Конечная концентрация ЭДТА в титру-емом объёме составляла 2,5-10" н. Для удаления низкомоле'кулярных SJi -соединений белковые растворы предварительно подвергали диализу против фосфатного буфера рН 7,2 при +4С в течение 3 часов. Для ампериметрического титрования зн -групп использовали 0,001 М Jigiro^.
Полученные даішнє обработаны вариационно-статистическим методом (Плохинский,1970). Для определения достоверности различий результатов исследований использовали критерий Стыодента.
