Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 7
1.1. Структура и свойства гликогенфосфорилазы Ь 7
1.2. Структура и свойства киназы фосфорилазы 14
1.3. Агрегация белков 20
1.4. Кристаллин: структура, свойства и шапероноподобная функция 26
1.5. Молекулярный краудинг и осмолиты 29
1.6. Постановка задачи 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
2.1. Материалы 36
2.1.1. Реактивы 36
2.1.2. Выделение гликогенфосфорилазы Ъ из скелетных мышц кролика 36
2.1.3. Выделение киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика 39
2.2. Методы 39
2.2.1. Электрофоретический анализ в ПААГ 39
22.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия 40
2.2.3. Измерение ферментативной активности 40
2.2.4. Динамическое светорассеяние 41
2.2.5. Изучение кинетики тепловой агрегации и ассоциации белков методом динамического светорассеяния 45
2.2.6. Аналитическое ультрацентрифугирование 46
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 48
3.1. Исследование тепловой агрегации гликогенфосфорилазы 48
3.1.1. Денатурация Phb 48
3.1.2. Сопоставление процессов денатурации и агрегации Phb 48
3.1.3. Изучение тепловой агрегации Phb при 48 С 50
3.1.4. Исследование тепловой агрегации Phb при 37 С 57
3.2. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию РЫ> 62
3.2.1. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию Phb 62
3.2.2. Влияние а-кристаллина на термоинактивацию и термостабильность Phb 68
3.3. Исследование самоассоциации киназы фосфорилазы 71
3.3.1. Исследование самоассоциации РпКпри низкой ионной силе... 71
3.3.2. Исследование ассоциации киназы фосфорилазы в условиях, близких к физиологическим (физиологические значения ионной силы, условия краудинга) 78
Заключение 87
Выводы 90
Список литературы 92
- Структура и свойства гликогенфосфорилазы
- Кристаллин: структура, свойства и шапероноподобная функция
- Выделение гликогенфосфорилазы Ъ из скелетных мышц кролика
- Исследование тепловой агрегации гликогенфосфорилазы
Введение к работе
При неблагоприятных условиях (тепловой, осмотический и окислительный стрессы, продукты вирусных генов и др.), а также при неправильном фолдинге образуются структурно-нефункциональные белковые агрегаты, с генерацией которых связан целый ряд так называемых «конформационных болезней» (катаракта и различного рода нейродегенеративные заболевания). Существующие на данный момент механизмы агрегации не могут в полной мере объяснить процесс агрегации. Так, например, широко используемый механизм «nucleation-dependent aggregation» (механизм, включающий стадию образования ядер агрегации и стадию роста агрегатов путем присоединения денатурированных мономеров к образовавшемуся ядру) предполагает образование в конечном счете агрегатов предельных размеров, тогда как при тепловой агрегации, согласно экспериментальным данным, не происходит формирования агрегатов ограниченного размера. Поэтому остается актуальным установление механизма процесса агрегации.
На данный момент известно, что в организме существует целый ряд соединений, способных подавлять процесс агрегации. Одним из таких соединений является а-кристаллин - белок, обладающий шапероноподобной активностью [Horvitz; 1992]. Однако до сих пор до конца не ясно, как именно происходит процесс блокирования агрегации. Поэтому актуальным представляется установление механизма подавления агрегации белков.
Помимо агрегации есть и другие процессы, в ходе которых образуются крупные мультимерные белковые частицы, что приводит к снижению активности фермента. Одним из таких процессов является самоассоциация. Так, одним из удивительных свойств киназы фосфорилазы, ключевого фермента гликогенолиза, является процесс самоассоциации белка в присутствии ионов Са2+ и Mg2+, приводящий к снижению удельной
ферментативной активности. Подобная способность киназы фосфорилазы к самоассоциации является неожиданной, так как именно эти ионы стимулируют ферментативный процесс. Достоверного механизма самоассоциации киназы фосфорилазы на данный момент не существует, поэтому его установление актуально.
Поскольку известно, что условия в живой клетке, содержащей высокие концентрации макромолекул (50-400 мг/мл; условия молекулярного краудинга), сильно отличаются от таковых для разбавленных растворов in vitro, представляется актуальным изучение процесса самоассоциации киназы в условиях, приближенных к физиологическим.
Структура и свойства гликогенфосфорилазы
Гликогенфосфорилаза (1,4-ос-0-глюкан: ортофосфат oc-D глюкозилтрансфераза, КФ 2.4.1.1) является ключевым ферментом метаболизма гликогена в скелетных мышцах. Фосфорилаза катализирует первую реакцию на пути деградации гликогена: (а-1,4-глюкозил)„+і + Pj -» (а-1,4-глюкозил)„ + a-D-глюкозо-І-фосфат, где п - число глюкозильных остатков. Фосфоролитическое расщепление сс 1,4-глюкозидных связей происходит с нередуцирующих концов цепей гликогена, и фосфорилаза продолжает отщепление до четвертого остатка от места ветвления. Реакция, катализируемая фосфорилазой, обратима, однако в условиях in vivo фермент функционирует только в направлении фосфоролиза гликогена, так как концентрация неорганического фосфата в клетке существенно превышает концентрацию глюкозо-1-фосфата.
Физиологическая роль фосфорилазы в скелетных мышцах состоит в энергетическом обеспечении мышечного сокращения, при этом источником энергии является образующийся в ходе фосфорилазной реакции глюкозо-1-фосфат.
Фермент существует в покоящейся мышце в виде неактивной без AMP нефосфорилированной форме (форме Ъ). Фосфорилаза Ь в растворе без добавок существует в форме димера, фосфорилаза а легко ассоциирует с образованием тетрамера при высоких концентрациях фермента (рис. 1) [Cohen etal., 1971]. Рис. 1. Структура димера (слева) и тетрамера (справа) гликогенфосфорилазы b
Димер фосфорилазы состоит из двух симметрично расположенных идентичных субъединиц с Мх = 97,4 кДа, каждый из которых обладает полным набором центров: каталитический центр, центр «запасания гликогена», аллостерический активаторный и аллостерический ингабиторный центры, однако активную конформацию фермент приобретает только в форме димера. Недавно был открыт новый аллостерический ингабиторный центр, расположенный между субъединицами и удаленный на 15 А от аллостерического эффекторного сайта, 33 А от каталитического сайта и 37 А от ингибиторного сайта (рис. 2) [Oikonomakos et al., 2002]. Данный ингабиторный сайт в настоящее время используется в качестве мишени для антидиабетических препаратов [Oikonomakos et al., 2000].
Тетрамеры по одним данным совсем неактивны [Силонова и Курганов, 1970], по другим - проявляют 12-33% от активности димера [Huang and Graves, 1970]. Мономеры каталитической активностью не обладают [Feldmann et al., 1972]. Каждый мономер содержит одну полипептидную цепь, состоящую из 842 аминокислотных остатков, одну молекулу пиридоксаль-5 -фосфата (ПЛФ) и имеет молекулярную массу 97432 Да. Рис. 2. Схема димерной молекулы Phb (вид снизу). Красным цветом показан каталитический сайт, пурпурным - аллостерический сайт, связывающий AMP, оранжевым - новый аллостерический ингибиторный сайт.
Аминокислотная последовательность полипептидной цепи мономера впервые определена химическим методом [Titani et al., 1977] и впоследствии уточнена определением нуклеотидной последовательности соответствующей ДНК [Nakano et al., 1986]. Пространственная структура фосфорилазы подробно изучена методом рентгеноструктурного анализа в группе Л. Джонсон [Barford and Johnson, 1989, Barford and Johnson, 1992, Johnson et al., 1993, Oikonomakos et al. 1992]. Мономер hb представляет собой белок a,3-типа с полипептидной цепью, уложенной в компактную глобулу с радиусом 30 А, состоящую из двух доменов: N-концевого (регуляторного) и С-концевого (каталитического). Первый домен включает остатки с 10 по 484, второй домен - остатки с 485 по 842. Каталитический центр расположен в щели между доменами на расстоянии 12
Кристаллин: структура, свойства и шапероноподобная функция
В ответ на неблагоприятные воздействия, такие как тепловые, окислительные или токсические, в клетках прокариот и эукариот синтезируются белки теплового шока «heat shock proteins» (Hsps), выполняющие функции молекулярных шаперонов. Они участвуют в фолдинге и сборке белков, взаимодействуя с развернутыми полипептидными цепями и предотвращая их необратимую агрегацию, а также способствуют рефолдингу, таким образом предохраняя клетки от вызываемых стрессом повреждений [Hendrick and Haiti, 1993, Fink, 1999].
Белки теплового шока участвуют в контроле структуры белка, его функций, локализации и транспорте, а также в таких процессах, как секреция белка, ядерный транспорт, пути передачи сигнала через стероидные рецепторы и рецепторы Т-клеток, в мультимерной сборке комплексов гистосовместимости и бактериальной вирулентности [Kelley and Georgopoulos, 1992].
По структурным и функциональным характеристикам молекулярные шапероны классифицируют на шесть основных семейств: HsplOO, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 и малые белки теплового шока (sHsps). В клетках млекопитающих преобладают белки теплового шока Hsp60, Hsp70 и Hsp90 [Bukau and Horwich, 1998, Mayer and Bukau, 2005].
а-Кристаллин является представителем семейства малых белков теплового шока. Общим свойством большей части sHsps, включая а-кристаллин, является их способность к образованию растворимых комплексов с денатурированными белками и предотвращение преципитации белков. Это свойство названо шапероноподобной активностью (chaperone-like activity). Hsps временно связываются с развернутыми белками, стабилизируют их и осуществляют передачу АТР-зависимым шаперонам Hsp70/Hsp40, которые обеспечивают рефолдинг [Horwitz, 1992, Smith et al., 1998]. а-Кристаллин впервые был обнаружен в хрусталике глаза, в котором основной его функцией является предотвращение агрегации Р- и у-кристаллинов (структурных белков, не обладающих шапероноподобной активностью) [Boyle and Takemoto, 1994]
а-Кристаллин состоит из двух типов субъединиц, аА и аВ, с молекулярной массой 20 кДа, содержащих 170-180 гомологичных аминокислотных остатков, что составляет почти 60%-ную гомологию [Van Montford et al., 2002]. При определении диаметра а-кристаллина (100-190 мг/мл) с помощью динамического светорассеяния было обнаружено, что диаметр молекулы белка равен примерно 35 нм [Mach et al., 1990]. При более низких концентрациях а-кристаллина значение диаметра приближается к 16 нм [Кривандин и др., 2004]. Обнаружены также частицы с размером -9,5 нм, [Koretz and Augusteyn, 1988].
Третичная и четвертичная структура а-кристаллина не изучена, поскольку полидисперстность белка затрудняет его кристаллизацию. На основании структурных исследований для олигомерной структуры а-кристаллина было предложено несколько моделей: трехслойная, додекамерная, мицеллярная модели и модель, отражающая тетрамерную организацию субъединиц [Augusteyn and Stevens, 1998].
В 1985 г. Томсоном была предложена мицеллярная модель структуры кристаллина, позднее развитая Аустейном и др. (Рис. 12) [Thomson, 1985, Augusteyn et al., 1989].
Кристаллин, связываясь с денатурированными белками, образует растворимые комплексы и, благодаря шапероноподобной активности, предотвращает агрегацию и преципитацию этих белков [Horwitz, Hendrick and Hartl, 1993].
Шапероноподобная активность а-кристаллина проявляется в широком диапазоне температур [Horwitz, 1992]. Показано, что нагревание а-кристаллина с белком-субстратом при 60 С в течение 20 минут приводит к
Возможная мицеллярная модель структуры а-кристаллина [Thomson, 1985, Augusteyn et al., 1989]. Субъединицы состоят из двух доменов и собраны в большие агрегаты посредством взаимодействия между гидрофобным N-концевыми доменами (темно-серый), которые расположены в центре агрегата. Гидрофильный С-концевой домен (светло-серый) локализуется на поверхности структуры. образованию устойчивых комплексов между а-кристаллином и белком. Нековалентный комплекс а-кристаллина с карбоангидразой был устойчив при комнатной температуре и при 4 С в течение 18 часов. Из этих результатов следует также, что а-кристаллин связывает белок на ранней стадии денатурации. В некоторых случаях комплекс а-кристаллина с белком включает одну или две молекулы субстрата. Однако подавление агрегации более эффективно при образовании мицеллоподобной структуры комплекса а-кристаллина-денатурированный белок или в результате включения в комплекс дополнительных молекул а-кристаллина. Образование устойчивых комплексов между ферментами и а-кристаллином может лежать в основе защиты ферментов при тепловой инактивации [Rao et al., 1993].
Выделение гликогенфосфорилазы Ъ из скелетных мышц кролика
Гликогенфосфорилазу Ъ из скелетных мышц кролика выделяли по методу Фишера и Кребса [Fischer and Krebs, 1958, 1962] с некоторыми модификациями. На первой стадии выделения из скелетных мышц кролика (350-500 г), пропущенных через мясорубку и хранившихся в замороженном состоянии при -20С, проводили двухкратную экстракцию. При этом во время первой экстракции рН раствора поддерживали около 7,0-7,5, а температуру - 30-32 С. Затем мышцы гомогенизировали на ножевом гомогенизаторе и отжимали через двойной слой марли, помещая экстракт в ледяную баню при +4 С. Из отжатых мышц проводили повторную экстракцию при комнатной температуре. Экстракты объединяли и доводили рН раствора до 5,35-5,40. Выпавшие в этих условиях балластные белки удаляли центрифугированием в течение 15 мин при 3000-3500 об/мин. Осадок отбрасывали, а супернатант пропускали через капроновую ткань, после чего быстро доводили рН раствора до нейтральных значений (рН 6,8-7,2). Очищенный экстракт пропускали через мезгу из фильтровальной бумаги на воронке Бюхнера. К полученному прозрачному фильтрату добавляли насыщенный и нейтрализованный раствор сульфата аммония из расчета 700 мл на 1000 мл фильтрата. По прошествии 16-18 ч надосадочную жидкость сифонировали и отделяли сульфатный осадок от надосадочной жидкости центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. После этого осадок ресуспендировали в небольшом количестве маточного раствора и вновь центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин. Плотный осадок растворяли в небольшом объеме (-10 мл) 0,001 М буфера трис-НС1, рН 7,0-7,2 и получившийся мутный раствор переносили в диализный мешок. Проводили диализ против 0,001 М буфера трис-HCl, рН 7,0-7,2, меняя его несколько раз. Общий объем буфера составлял 3 л. Содержимое диализного мешка по окончании диализа центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин и помещали в переохлажденную ледяную баню (t от 0 до -4 С). К охлажденному супернатанту добавляли растворы AMP, ацетата магния и дитиотреитола (вместо L-цистеина той же концентрации, как описано в работе Фишера и Кребса) до конечных концентраций: AMP - 10 М, Mg(CH3COO)2 - Ю М, дитиотреитол - 3-Ю М. При перемешивании через 30-40 мин выпадают шелковистые кристаллы фосфорилазы Ь. Выпавшие кристаллы оставляли на ночь в холодильнике при +4 С. Кристаллы отделяли центрифугированием и растворяли в 3-Ю М растворе дитиотреитола (рН 7,0). Нерастворившийся осадок удаляли центрифугированием в течение 20 мин при 14000 об/мин, и затем повторяли процедуру кристаллизации по описанной выше методике. Всего проводили 4 кристаллизации, уменьшая каждый раз объем раствора на 30 %, однако при последней перекристаллизации AMP в смесь не добавляли, а вместо дитиотреитола использовали Р-меркаптоэтанол также в концентрации 3-Ю М. Препарат фермента хранили не в виде кристаллов, как описано в работе Фишера и Кребса, а в виде раствора в 0,04 М (З-глицерофосфат-NaOH буфере с Р-меркаптоэтанолом (3-Ю- М), рН 6,8, содержащем 50% глицерина, при температуре -20 С. Перед тем, как поместить фосфорилазу b на хранение, освобождали раствор фермента от содержащейся в нем AMP. Для этого кристаллы, полученные при последней перекристаллизации, растворяли в буфере указанного состава, не содержащем глицерин, до конечной концентрации фермента -40 мг/мл и пропускали через колонку ДЭАЭ целлюлоза - активированный уголь в соотношении 1:1. Критерием очистки препаратов фосфорилазы Ъ от AMP являлась величина отношения оптических плотностей при 260 и 280 нм ( 2б(/ 28о)? которая обычно равнялась 0,53-0,55. Эти препараты были практически неактивны в отсутствие AMP.
После освобождения препарата фосфорилазы Ь от AMP его помещали на диализ против Р-глицерофосфатного буфера (0,04 М) с Р-меркаптоэтанолом (3-Ю"2 М), рН 6,8, содержащего 50% глицерина при +4 С. По мере прохождения диализа происходит концентрирование раствора фермента с одновременным уменьшением его объема. По окончании диализа объем раствора фермента обычно составлял 2-3 мл при концентрации фосфорилазы Ь 80-100 мг/мл. В таком виде фермент хорошо хранится при -20 С и сохраняет основные кинетические и термодинамические свойства в течение 2 недели.
Концентрацию фосфорилазы Ь определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции, равный 13,2 для 1%-ного раствора фермента при Х= 280 нм [Kastenschmidt et al., 1968]. 2.1.3. Выделение киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика
Для выделения PhK брали скелетные мышцы кролика (около 300 г). Мыщцы быстро срезали и охлаждали в 2 л ледяного трис-(3-глицерофосфатного буфераР0,2 М трис-НС1, 10 мМ р-глицерофосфат, 4 мМ V ЭДТА, 0,5 мМ фенилметилсульфонил фторид, рН 8,2. Конечное значение рН гомогената состаляло 6,5-6,7. Дальнейшие операции проводили при температуре 2-3 С, как это описано у Коэна [Cohen, 1973]. Для достижения большего выхода фермента кислотное осаждение КФ проводили при рН 5,7.
Высокоочищенный препарат КФ, элюированный с колонки ДЭАЭ-тойоперл линейным градиентом концентрации NaCl в буфере А (50 мМ р-глицерофосфат натрия, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Р-меркаптоэтанол, рН 7.0; 150:150 мл ± 0,4 М NaCl). Концентрировали диализом против 50%-ного раствора глицерина в буфере А и хранили без видимого изменения активности и регуляторных свойств при -20 С в течение 1,5-2-х недель. Методика доработана Морозовым [Морозов и др., 1989].
Исследование тепловой агрегации гликогенфосфорилазы
В ходе анализа данных, полученных методом ДСК, была построена зависимость QIQt0&\ (Q- теплопоглощение при достижении определенной температуры и Qtota\ - общая теплота денатурации Phb) от температуры (рис. 16Б). Величина Q/Qtata характеризует долю денатурированного белка. На рис. 16В представлена зависимость интенсивности светорассеяния от величины Q/Qtotbh Эта зависимость характеризует соотношение между денатурацией и агрегацией Phb при нагревании фермента (при концентрации 1 мг/мл) с постоянной скоростью 1 С/мин. В интервале значений Q/Qiota.\ от 0,2 до 0,8 зависимость интенсивности светорассеяния от Q/Qtotai является линейной, что позволяет путем экстраполяции найти значение интенсивности светорассеяния при Q/Qt0ta\ = 1, то есть в условиях полной денатурации Phb. Эта величина интенсивности светорассеяния обозначена нами как 1цт. Величина /jim характеризует расчетное значение интенсивности светорассеяния в условиях полной денатурации фермента при отсутствии преципитации образовавшихся агрегатов. Уровень интенсивности светорассеяния, соответствующий /цт, обозначен на рис. 16 А горизонтальной пунктирной линией.
В. Изучение тепловой агрегации Phb при 48 С
Методом аналитического ультрацентрифугирования было изучено олигомерное состояние Phb при инкубации фермента при повышенных температурах, а именно 48 С. На рис. 22 показано седиментационное поведение Phb при инкубации фермента при 48 С в течение 2 ч 40 мин при достаточно низкой концентрации фермента (0,2 мг/мл). Был обнаружен единственный пик со значением коэффициента седиментации o.w = 5,1 ± 0,1 S, соответствующий мономерной форме Phb. Полученные данные указывают на то, что при 48 С происходит полная диссоциация димера фермента на мономеры в данных условиях. 0,4
Диссоциация Phb в ходе тепловой денатурации. c(s, flfo) распределение для Phb (0,2 мг/мл) при 48 С, приведенное к стандартным условиям (20 С, вода). Время инкубации при 48 С 2 ч 40 мин.
Тепловую агрегацию Phb изучали методом динамического светорассеяния при 48 С. Этот метод позволяет измерять гидродинамический радиус (Rh) частиц, образующихся в ходе агрегации. Например, на рис. 23 показано распределение частиц по размерам для различных значений времени инкубации Phb (концентрация 1 мг/мл). Функции распределения регистрировали с интервалом 1,5 мин. При t = 3,0 и t = 4,5 мин наблюдался только один пик с R = 6 нм, соответствующий нативной форме Phb (например, на рис. 23А показано распределение частиц по размерам для t = 3,0 мин). При t = 6 мин (рис. 23Б) появляется дополнительный пик с i?h= 40,7 нм, что свидетельствует об образовании белковых агрегатов. Начиная с момента времени t = 7,5 мин, обнаруживался только один пик, который соответствовал агрегатам, причем гидродинамический радиус агрегатов увеличивался во времени. Так, при t = 15 мин i?h составил 270 нм (рис. 23В).
Рост агрегатов сопровождался увеличением интенсивности светорассеяния (Г) во времени. Анализ зависимостей I от t для различных концентраций Ph6 (рис. 24) показал, что эти зависимости могут быть описаны уравнением: /=/нт{1-ехр[- (/-/0)]}, (7) где /цт - предельное значение интенсивности светорассеяния при / -» СО, to-длительность лаг-периода на кривых зависимости / от t и к\ - константа скорости первого порядка. Произведение hmk\ соответствует тангенсу угла наклона зависимости / от времени при / = /0- Данный угол наклона обозначен как (dl/dt) . Физический смысл этой величины- мера скорости агрегации
белка [Курганов, 2002].
Анализ зависимостей i?h от времени согласно уравнению (8) с использованием параметра t0, определенного из уравнения (7), позволил определить величины Rhfi и t2R (таблица 2). Средний гидродинамический радиус стартовых агрегатов составил 16,7 ± 1,0 нм. При увеличении концентрации hb происходило падение значения t2R, т.е. происходило ускорение агрегации.
