Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 4
РАЗДЕЛ 1.1. Редокс-статус клетки определяется соотношением внутриклеточных про- и антиоксидантов. 4
1.1.1. Активные формы кислорода и их значение в жизни клетки . 4
1.1.2. Основные представители антиоксидантной системы клетки и их роль в поддержании редокс-статуса. 4
РАЗДЕЛ 1.2. Редокс-регуляция клеточной пролиферации. 4
1.2.1. Клеточный цикл и его регуляция . 4
1.2.2. Редокс-регуляция клеточного цикла. 4
РАЗДЕЛ 1.3. Современное состояние знаний о противоопухолевом эффекте короткоцепочечных пептидов. 4
1.3.1. Карнозин и его производные. Общая характеристика. 4
1.3.2. Антиоксидантные свойства карнозина и его производных. 4
1.3.3. Эффект карнозина и его производных на пролиферацию нормальных и опухолевых клеток. 4
1.3.4. Пинеалон. Общая характеристика и свойства. 4
Глава 2. Методы исследования. 4
2.1. Культуры клеток. 4
2.2. Исследуемые соединения . 4
2.3. Исследование клеточной пролиферации. 4
2.3.1. Время удвоения популяции. 4
2.3.2. Эффективность посева и доля выживших клеток. 4
2.4. Проточная цитометрия. 4
2.4.1. Измерение уровня АФК. 4
2.4.2. Определение доли мертвых клеток. 4
2.4.3. Анализ клеточного цикла. 4
2.4.4. Двухпараметрический анализ клеточного цикла. 4
2.5. Иммуноблоттинг. 4
2.6. Определение активности MnСОД. 4
2.7. Определение активности каталазы. 4
2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени. 4
2.9. Статистическая обработка результатов. 4
Глава 3. Результаты исследования. 4
РАЗДЕЛ 3.1. Изучение характера действия карнозина на пролиферацию клеток. 4
3.1.1. Карнозин снижает количество клеток РС-12 в культуре. 4
3.1.2. Карнозин снижает уровень АФК в клетках культуры РС-12 . 4
3.1.3. Карнозин и его производные индуцируют накопление клеток РС-12 в S и G2/М фазах клеточного цикла. 4
3.1.4. Изучение воздействия синтетического трипептида пинеалона на клеточный цикл. 4
РАЗДЕЛ 3.2. Изучение механизма регуляции клеточного цикла под действием карнозина. 4
3.2.1. Карнозин избирательно ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы. 4
3.2.2. Карнозин снижает уровень АФК и индуцирует экспрессию MnСОД. 4
3.2.3. Карнозин индуцирует G2 блок и усиливает экспрессию циклина В1. 4
РАЗДЕЛ 3.3. Изучение функциональной нагрузки структурных элементов в молекуле карнозина при антипролиферативном эффекте. 4
РАЗДЕЛ 3.4. Возможности применения карнозина в радиотерапии. 4
Глава 4. Обсуждение результатов 4
Выводы 4
Список литературы 4
- Активные формы кислорода и их значение в жизни клетки
- Клеточный цикл и его регуляция
- Исследуемые соединения
- Карнозин снижает уровень АФК в клетках культуры РС-12
Введение к работе
Актуальность исследования. Карнозин представляет собой природный дипептид, состоящий из двух аминокислот – -аланина и L-гистидина. В организме человека карнозин представлен во многих тканях, достигая наивысшей концентрации в мышцах (~ 20 мM) и головном мозге (~ 2.5 мM) (Margolis 1974, Mannion et al 1992). Карнозин синтезируется ферментом карнозин-синтетазой, которая катализирует образование пептидной связи между -аланином и L-гистидином, используя энергию АТФ и ионы Mg2+ (Horinishi et al 1978, Drozak et al 2010). Разрушение карнозина на составляющие его аминокислоты осуществляется главным образом сывороточной карнозиназой (CN1) (Hanson & Smith 1949, Teufel et al 2003). Карнозин демонстрирует многообразие функций, в том числе: протонный буфер в скелетных мышцах (Северин С. Е. 1953), хелатор двухвалентных металлов (Cu2+, Zn2+, Fe2+) (Boldyrev, 2012), антиоксидант (Dupin et al 1984, Kohen et al 1988, Chan et al 1994, Zhou & Decker 1999) и ингибитор пролиферации опухолевых клеток (Nagai and Suda 1986, Holliday and McFarland 1996, Renner et al 2010).
Впервые антипролиферативный эффект карнозина на опухолевые клетки описали Nagai и Suda в 1986 году. В их работе подкожные инъекции карнозина мышам линии ddY, с предварительно вживленными клетками саркомы, способствовали снижению интенсивности пролиферации опухолевых клеток и увеличению выживаемости животных. Позже в независимом исследовании Renner et al. (2010) на мышах с ксенографтами HER2/neu NIH3T3 фибробластов было показано, что ежедневные внутрибрюшинные инъекции карнозина существенно подавляют пролиферацию злокачественных клеток и опухолевый рост. Holliday и McFarland (1996) продемонстрировали избирательность действия карнозина на опухолевые клетки. Добавление карнозина к смеси клеток карциномы шейки матки (HeLa) и нормальных человеческих фибробластов (MRC-5) приводило к выборочному уничтожению опухолевых клеток и удлиняло продолжительность жизни фибробластов. Таким образом, на сегодняшний день накоплено достаточно экспериментальных данных об ингибирующем действии карнозина на пролиферацию опухолевых клеток, однако механизм противоопухолевого эффекта до сих пор остается не выясненным.
В настоящее время участие активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантов в регуляции клеточной пролиферации хорошо обосновано и изучено (Menon and Goswami 2007, Burhans and Heintz 2009). Показано, что быстро пролиферирующие опухолевые клетки часто характеризуются более высоким содержанием АФК и пониженной активностью антиоксидантной системы по сравнению с нормальными клетками, делящимися медленно или находящимися в состоянии покоя (Goswami et al 2000, Sarsour et al 2012). Добавление небольших концентраций пероксида водорода к опухолевым клеткам активировало пролиферативные процессы, а повышение экспрессии антиоксидантного фермента митохондриальной супероксиддисмутазы, наоборот, пролиферацию замедляло (Laurent et al 2005, Weydert et al 2006). Карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства, которые заключаются в его способности образовывать комплексы с двумя высоко реакционноспособными окислителями – гидроксильным радикалом и супероксидным анионом, снижая их реактивность и предотвращая дальнейшее распространение окислительного повреждения (Chan et al 1994, Klebanov et al 1997). Кроме того, в нескольких независимых исследованиях было продемонстрировано эффективное подавление накопления продуктов перекисного окисления липидов в присутствии карнозина, что снижало уровень окислительного повреждения макромолекул, способствуя сохранению их структуры и функций (Dupin et al 1984, Kohen et al 1988, Zhou and Decker 1999). Исходя из литературных данных, мы предположили, что ингибирующий эффект карнозина на пролиферацию опухолевых клеток может быть опосредован его антиоксидантными свойствами.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «НЦН» РАМН в рамках темы №146 «Исследование в условиях in vitro и in vivo проблем эффективности безопасности наноструктурных комплексов, обладающих нейропротекторным действием».
Цель исследования. Изучение механизма антипролиферативного действия карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения.
Задачи исследования:
1. Изучить характер воздействия карнозина на пролиферацию линий опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (РС-12), карциномы горла и рта (FaDu, Cal27), карциномы молочной железы (MB231) и глиобластомы человека (U-118-MG);
2. Выявить, сопровождаются ли индуцируемые карнозином изменения пролиферации опухолевых клеток колебаниями внутриклеточного уровня АФК и антиоксидантных ферментов;
3. Выяснить, являются ли индуцируемые карнозином изменения пролиферации опухолевых клеток результатом модификации прогрессии клеточного цикла;
4. Сравнить антипролиферативные свойства карнозина с действием его производных.
5. Оценить эффект совместного применения карнозина и ионизирующего излучения на гибель опухолевых клеток.
Научная новизна. Настоящая работа представляет собой оригинальное экспериментальное исследование, в котором было впервые показано избирательное подавление пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина. Установлено, что замедление пролиферации глиобластомы сопровождается накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла и активацией экспрессии циклина B1. Продемонстрировано, что параллельно с изменениями в прогрессии клеточного цикла происходит повышение активности MnСОД и понижение внутриклеточного уровня АФК. Выявлено, что метилированное производное карнозина – анзерин – подавляет пролиферацию глиобластомы эффективнее, чем карнозин. Показано, что предварительная инкубация клеток с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты существенно расширяют представления о природе антипролиферативного действия карнозина на опухолевые клетки нейрального происхождения, что важно для понимания молекулярных механизмов действия карнозина в целом. Полученные в работе данные об эффекте совместного действия карнозина и ионизирующего излучения на выживаемость клеток глиобластомы открывают перспективу для применения карнозина в комбинированной терапии опухолей головного мозга.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Карнозин ингибирует пролиферацию опухолевых клеток нейрального происхождения, при этом наиболее выраженный эффект проявляется на клетках глиобластомы человека U-118-MG;
2. Ингибирование пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина сопровождается снижением уровня АФК и увеличением активности MnСОД;
3. Изменения в антиоксидантной системе клеток глиобластомы сопровождаются накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла и усилением экспрессии циклина В1;
4. Метилированное производное карнозина, анзерин, ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы эффективнее, чем карнозин;
5. Предварительная инкубация клеток с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.
Протокол диссертационного исследования «Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения» был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НЦН» РАМН. Протокол №12/13 от 11 декабря 2013 г.
Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании научных сотрудников ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН. Протокол № 11 от 18 октября 2013 г.
Материалы диссертационной работы были представлены на 2 международных конференциях: V Stromboli Conference on Cancer and Ageing: “The Primeval Life-Generating Molecules. Therapeutic and Aging-Reversing Properties” (Стромболи, Италия, 2010) и The 4th Quadrennial Meeting of the World Federation of Neuro-Oncology held in conjunction with the 2013 SNO Scientific Meeting and Education Day (Сан-Франциско, США, 2013)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, из них 1 публикация в изданиях, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ и 2 работы в зарубежных рецензируемых журналах.
Личный вклад автора. Автором лично выполнено культивирование клеточных линий и исследования клеточной пролиферации, проведено измерение уровня АФК, доли мертвых клеток, а также анализ клеточного цикла, определена активность и экспрессия антиоксидантных ферментов. Выполнена последующая аналитическая обработка и обобщение полученных результатов, сформулированы выводы и подготовлены публикации.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 120 стр. машинописного текста, 1 таблицу и 29 рисунков. Список литературы включает 271 источник (18 отечественных и 253 зарубежных).
Активные формы кислорода и их значение в жизни клетки
Наиболее распространенные и реакционноспособные прооксиданты в клетке – активные формы кислорода (АФК). АФК представляют собой продукты частичного восстановления кислорода, содержащие один или несколько неспаренных электронов, и относятся к классу свободных радикалов [31].
Главным источником АФК в клетке является дыхательная цепь митохондрий [32], где теряется порядка 2% супероксида. Помимо этого АФК образуются при работе некоторых ферментов (НАДФН-окcидаза [33], ксантиноксидаза [34], монооксигеназа, NO-синтаза [35] и др), метаболизме ксенобиотиков, активации дыхательного взрыва в лейкоцитах, под воздействием цитокинов, ионизирующего и УФ-излучения [36]. Образование АФК происходит в несколько стадий. Одноэлектронное восстановление кислорода приводит к формированию супероксидного аниона (или супероксида, О2-), который сам по себе не является окислителем, а наоборот, по свойствам напоминает слабое основание. Поэтому при физиологическом pH супероксид присутствует частично в протонированной форме (НО2, pKa = 4.8), которая является достаточно сильным окислителем [37]. НО2 представляет собой, по сути дела, пероксильный радикал (ROO) без радикала (R), и поэтому подобно ROO, легко инициирует перекисное окисление липидов (ПОЛ), приводя к образованию новых форм АФК: продуктов ПОЛ, пероксильных (ROO) и алкоксильных (RO) радикалов [38]. Супероксид достаточно быстро дисмутирует с образованием пероксида водорода (Н2О2): О2- + 2HО2 а 2O2 + H2O2, (k=9,7x107 M-1s-1) [39]. Взаимодействие между супероксидом и пероксидом водорода (реакция Фентона) приводит к образованию гидроксильного радикала (HO): 2О2- + H2О2 + 2H+ а 2HO + 2HO- + O2. Сама по себе реакция идет очень медленно (k 0.1 M-1s-1), однако значительно ускоряется в присутствии ионов переходных металлов (Fe2+, Cu2+ и др.) [40]. HO является самым сильным окислителем в водных растворах, реагируя с огромной скоростью с любыми находящимися по близости молекулами (k 109 – 1010 M-1s-1 для соединений содержащих C, H, O, S, N) [37]. Описанные выше превращения можно обобщить в виде четырех простых реакций: О2 + 1е- + (H+) а О2- (НО2) НО2- + 1е- + H+ а Н2О2 Н2О2 + 1е- + Н+ а Н2О + НО НО + 1е- + H+ а Н2О В результате воздействия ионизирующего или УФ-излучения, некоторых химических соединений (ксенобиотики и др.), а также при старении и опухолевой трансформации происходит повышение внутриклеточного уровня АФК, что приводит к окислительному повреждению макромолекул (ДНК, белки, липиды), нарушению их структуры, функции и в итоге к гибели клетки. В то же время, на сегодняшний день накоплено множество данных о том, что в небольших количествах АФК играют важную роль в жизни клетки [41-44]. В независимых исследованиях было продемонстрировано участие АФК в регуляции пролиферативных процессов. Добавление O2- к среде культивирования нормальных фибробластов или лимфоцитов усиливало пролиферацию клеток [45, 46]. Laurent et al. показали, что небольшие концентрации Н2О2 (0,02 – 0,13 мкМ) индуцируют пролиферацию нормальных мышиных фибробластов NIH 3T3, а также опухолевых клеток линий СТ26 (карцинома прямой кишки мыши) и Нера 1-6 (гепатома мыши) [28]. Сравнительный анализ образования АФК в нормальных и опухолевых клетках выявил, что уровень АФК в опухолевых клетках значительно выше по сравнению с нормальными клетками того же вида [29]. Образование АФК в нормальных клетках происходит в главным образом за счет работы НАДФН-оксидаз, в то время как основным источником АФК в опухолевых клетках являются митохондрии [28].
Концентрация внутриклеточных прооксидантов регулируется антиоксидантной системой клетки, которая включает как низкомолекулярные вещества (витамин Е, С, -каротин, глутатион, НАДФН, пируват, тиоредоксин и др.), так и ферменты (супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, каталаза, тиоредоксин пероксидаза и др.). Таким образом, в норме в клетке постоянно поддерживается равновесие между скоростью образования прооксидантов и их устранением с помощью системы антиоксидантов. Это равновесие называется окислительно-восстановительным балансом или редокс-статусом [47]. Самым распространенным низкомолекулярным антиоксидантом клетки является цистеин-содержащий трипептид - глутатион (Gly-Cys-Glu, GSH), его концентрация в цитоплазме может достигать 11 мМ [48]. Благодаря наличию чувствительной к окислению -SH группы цистеина GSH способен улавливать малейшие изменения редокс-статуса и реагировать на них. Соотношение восстановленной формы глутатиона (GSH) и окисленной (GSSH) часто используется для оценки состояния внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса [47, 49].
Одним из основных антиоксидантных ферментов клетки является супероксиддисмутаза (СОД), катализирующая реакцию дисмутации супероксида: О2- + О2- а O2 + H2O2. Несмотря на то, что дисмутация О2- происходит быстро и сама по себе, СОД делает реакцию практически молниеносной (k=2х109 M-1s-1) [50]. Cуществует три изоформы СОД: митохондриальная (MnСОД) [50], цитоплазматическая (CuZnСОД) [51] и внеклеточная, на поверхности клеточных мембран, (ЕС(CuZn)СОД) [52]. Поскольку митохондрии являются главным источником АФК в клетке, митохондриальная MnСОД представляется первым барьером защищающим клетку от окислительного повреждения. Несколькими независимыми лабораториями было показано, что полное ингибирование MnСОД (Sod2-/-) у новорожденных мышей приводит к гибели животных в течение 1-18 дней после рождения и сопровождается дилатационной кардиомиопатией, усилением накопления липидов в печени и метаболическим ацитодозом [53, 54]. Ингибирование экспрессии других изоформ СОД, каталазы или глутатионпероксидазы было совместимо с жизнью. Частичное ингибирование активности MnСОД (Sod2+/-) приводило к нарушению функционирования митохондрий и усилению их окислительного повреждения, а также увеличению риска развития опухолей [55-57]. Окислительное повреждение митохондрий и нарушение их функции, видимо, и являются причиной усиления образования митохондриальных АФК в опухолевых клетках. Пероксид водорода, образующийся в результате дисмутации О2-, утилизируется в пероксисомах с помощью каталазы (H2O2 + H2O2 а H2O + O2) [58, 59] или в цитоплазме с помощью глутатионпероксидазы (GPx) (H2O2 + 2GSH а 2H2O + GSSG). Причем, GPx катализирует реакцию не только с H2O2, но и с ROOH приводя к образованию спиртов (ROH) [60, 61].
Клеточный цикл и его регуляция
Клеточный цикл представляет собой высокоорганизованную и строго регулируемую последовательность переходов от G1 фазы к S, к G2 и митозу (М). Переход от одной фазы к другой регулируется последовательной экспрессией белков циклинов и активацией циклин-зависимых киназ (cyclin dependent kinase, CDK). CDK представляют собой серин/треоининовые протеинкиназы, которые активируются при соединении с циклинами и запускают события клеточного цикла, путем фосфорилирования соответствующих остатков в белках-мишенях [79]. На Рис. 1.1. представлены основные циклин/CDK комплексы позвоночных, специфичные для той или иной фазы клеточного цикла. Уровень циклинов меняется по мере прогрессии клеточного цикла, приводя к колебаниям активности CDK (См. Рис. 1.1). Помимо циклинов активность CDK комплексов регулируется с помощью CDK-активирующей киназы (CDK-activating kinase, CAK), ингибиторов CDK (cyclin-dependent kinase inhibitor protein, CKI), а также протеолитическими процессами (убиквитинирование) [80, 81]. Для полной активации комплекса циклин/CDK необходимо фосфорилирование CDK по Thr161 (CDK1), Thr160 (CDK2) или Thr172/177 (CDK4/6), которое осуществляется в ядре с помощью CAK [83-85]. САК состоит из трех субъединиц: CDK7, циклин H и белка Mat1, который активирует комплекс циклин H/CDK7. Связывание с циклином приводит к конформационным изменениям в CDK, которые делают возможным фосфорилирование CDK с помощью CAK [86]. Активность CAK-киназы постоянна на протяжении всего клеточного цикла [87].
На сегодняшний день насчитывается два семейства CKI: INK4 и Cip/Kip. Семейство INK4 включает белки р15, р16, р18 и р19, которые специфически связываются с CDK4/6, препятствуя образованию комплекса с циклином D [88, 89]. Увеличение уровня белка р16 часто наблюдается в стареющих клетках и сопровождается снижением пролиферативных способностей [90]. Белки р21, р27 и р57, относящиеся к Cip/Kip семейству, связываются с CDK2 и контролируют прогрессию через S фазу [91]. Ингибирование CKI часто приводит к нарушению контроля пролиферации и опухолевой трансформации [92-94]. Важную роль в регуляции протеолитических процессов во время клеточного цикла играет Комплекс стимулирующий анафазу (Anaphase promoting complex, АРС), который представляет собой убиквитин-лигазу, фермент катализирующий реакцию присоединения множественных копий белка убиквитина к боковым цепям лизина в молекуле белка-мишени [95, 96]. Полиубиквитинированние часто является сигналом к деградации белка, которое происходит в 26S протеасоме [97]. АРС присутствует в клетке на протяжении всего цикла, однако активность комплекса варьирует. АРС активируется в середине митоза, а ингибирование АРС происходит в конце G1 фазы [98, 99]. Некоторые химические соединения, ионизирующее и УФ излучение, ингибиторы репликации ДНК, а также ошибки при репликации или репарации ДНК приводят к нарушению структуры ДНК и остановке клеточного цикла. Главную роль в этом процессе играют 2 серин/треониновые протеин киназы – АТМ (ataxia telangiectasia mutated) и ATR (ATM-Rad3-related protein). АТМ активируется в ответ на появление двуцепочечных разрывов ДНК, образующиеся под воздействием ионизирующего облучения. ATR активирует под действием УФ-облучения или при нарушениях репликации ДНК. ATM и ATR прикрепляются к сайту повреждения ДНК и фосфорилируют различные белки, в том числе Chk1 и Chk2, которые приводят к остановке клеточного цикла в G1 фазе, препятствуя удвоению ДНК, или в G2 фазе, блокируя вход в митоз [100-103]. Инициация пролиферации. Сигнальные молекулы, стимулирующие деление клетки, называются митогенами. К наиболее распространенным митогенам относятся факторы роста (ФР; эпидермальный ФР (EGF), ФР фибробластов (FGF), ФР тромбоцитов (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и др.). Факторы роста связываются со специфическими рецепторами на поверхности клетки, приводя к их активации. Активированные рецепторы индуцируют внутриклеточные сигнальные каскады митоген-активируемых протеинкиназ (mitogen-activated protein kinases, МАРК). Существует 4 вида МАРК: ERK1/2, JNK, p38 и ERK5. Каскад ERK1/2 активируется в ответ на пролиферативные стимулы, например взаимодействие ФР с рецептором на поверхности мембраны. Каскады JNK, p38 и ERK5 активируются в основном при стрессе. ERK1/2 представляют собой консервативные серин/треониновые протеинкиназы, способные фосфорилировать различные белки-мишени в цитопламе, мембранах и ядре, и, таким образом, регулировать большое разнообразие внутриклеточных процессов [104, 105]. Показано, что активация ERK1/2 необходима для пролиферации клеток. Активированные ERK1/2 киназы принимают участие в синтезе пиримидинов, ремоделировании хроматина, синтезе новых рибосом, активации факторов трансляции и транскрипции, а также в регуляции G1/S и G2/M переходов между фазами клеточного цикла. Ингибирование ERK1/2 приводило к остановке пролиферации и накоплению клеток в одной из фаз клеточного цикла. Финальным шагом ERK1/2 киназ является активация факторов транскрипции (Myc, Elk-1, Sap-1, TIF-IA, и др.), которые индуцируют экспрессию генов, запускающих события клеточного цикла [106-109]. G1 фаза. В G1 фазе происходит активный рост новообразованной дочерней клетки, проверяется целостность и равномерность распределения хромосом после митоза. Первым под действием митотического сигнала активируется экспрессия циклинов D (в частности D1), которые образуют комплексы с CDK 4 или CDK 6 [110]. Главная роль комплекса циклин D1/CDK4/6 заключается в фосфорилировании белка ретинобластомы (retinoblastoma tumor suppressor protein, рRb) и активация фактора транскрипции E2F.
Исследуемые соединения
Карнозин (чистота 99%) был любезно предоставлен «Hamari Chem., Ltd», Осака, Япония. Гомокарнозин (чистота 99%) и анзерин (чистота 99%) были приобретены, соответственно, в «Hamari Chem., Ltd» и «Yaizu Suisankagaku Industry Co.,Ltd.» (чистота 99%). N-ацетилкарнозин был синтезирован рутинным путем в Лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБУ «НЦН» РАМН (чистота 98,7%, определена с помощью HPLC). L-гистидин--аланин был синтезирован рутинным путем в Исследовательском Институте Химического Разнообразия (чистота 98%, определена с помощью HPLC). Пинеалон был предоставлен Научно-производственным центром ревитализации и здоровья.
Время удвоения популяции (Тd) – это период времени, за который происходит увеличение количества клеток в два раза. Для вычисления Тd клетки высаживали в чашки Петри в небольших разведениях. Каждые два дня клетки снимали с помощью трипсина (Gibco, США), считали их количество с помощью Z1 Coulter Counter (Beckman Coulter, США) и строили кривые роста (Рис. 2.1). Время удвоения популяции (Тd) рассчитывали на экспоненциальном участке роста по формуле: Тd=0.693t/ln(Nt/N0), где t – время (дни), N0 – начальное количество клеток, Nt – количество клеток ко дню t. Nt вычисляли по уравнению экспоненциальной линии тренда (Рис. 2.1). Рисунок 2.1. Пример кривой роста с экспоненциальной линией тренда и уравнением линии тренда для вычисления времени удвоения популяции. x – время (д), y – количество клеток ко дню х.
Выживаемость клеток определяли по их способности формировать колонии. Клетки рассеивали в низких разведениях в 60 мм чашки Петри, по истечении 10 дней клетки фиксировали 2-4 мин в 70% этаноле, разведенном на фосфатном буфере, окрашивали 10 мин с помощью раствора содержащего 0.05% бриллиантового синего G-250, 50% метанола, 5% уксусной кислоты, 45% воды. Далее подсчитывали количество колоний состоящих из 50 и более клеток и вычисляли процент клеток образовавших колонии, эффективность посева (ЭП), по формуле: ЭП = (количество колоний/количество посаженных клеток) х 100.
Выживаемость рассчитывали как процентное соотношение ЭП в клетках, обработанных карнозином или подвергнутых действию ионизирующего излучения, к ЭП клеток в контроле.
данной работе все измерения проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD, США), оснащенном ионным аргоновым лазером с длинной волны 488 нм и двумя светофильтрами: 585/42 нм для красной флуоресценции (PI) и 530/30 нм для зеленой флуоресценции (ФИТЦ, DCF). 2.4.1. Измерение уровня АФК Уровень внутриклеточных АФК измеряли с помощью флуоресцентного красителя 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетата (DCFН2-DA) (Рис. 2.2).
DCFН2-DA представляет собой липофильное соединение, легко проникающее через мембрану живых клеток. Внутриклеточные эстеразы отщепляют ацетильные группы от DCFН2-DA, превращая его в 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин (DCFН2), для которого мембрана живой клетки уже непроницаема. Под действием внутриклеточных АФК (в основном Н2О2) происходит окисление DCFН2 с образованием флуоресцирующего продукта 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF, ex=504 нм, em=529) [250]. Для измерения уровня АФК клетки инкубировали с 100 мкМ DCFН2-DA (Biotium, США) в течение 30 мин в темноте (37оС) и затем анализировали на проточном цитометре. Данные обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD, США) и рассчитывали среднее значение интенсивности флуоресценции.
Карнозин снижает уровень АФК в клетках культуры РС-12
Быстро пролиферирующие клетки часто характеризуются повышенным содержанием АФК. Понижение уровня АФК в этих клетках с помощью антиоксидантов приводит к снижению скорости пролиферации [26, 66, 149]. Принимая во внимание способность карнозина взаимодействовать с некоторыми видами АФК и снижать их реакционную способность [15-19] можно предположить, что замедление клеточной пролиферации под действием карнозина является результатом его антиоксидантного эффекта. Для того чтобы выяснить, сопровождается ли снижение количества клеток РС-12 под действием карнозина изменениями уровня АФК, клетки РС-12 обрабатывали карнозином (50 мМ) в течение 0,5 - 48 ч. Уровень АФК измеряли на проточном цитометре по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH2-DA, результаты измерения представлены на Рис. 3.1.2. Как следует из Рис. 3.1.2, уже через 30 мин инкубации уровень АФК в пробах с карнозином снижался на 50% по сравнению с контролем. Пониженный уровень АФК поддерживался на протяжении 24 ч и возвращался к контрольному уровню через 48 ч. Поскольку снижение уровня АФК по времени предшествовало снижению количества клеток , можно предположить, что индуцированное карнозином замедление пролиферации клеток РС-12 является результатом его антиоксидантного эффекта.
Пролиферация - это процесс увеличения количества клеток путем деления. Период времени от образования новой клетки до ее деления на две называется клеточным циклом. Клеточный цикл представляет собой совокупность последовательных строго организованных переходов от G1 фазы к S, к G2 и М (митоз). Нарушение прогрессии клеточного цикла ведет к его остановке (блоку) и препятствует дальнейшей пролиферации [81]. Для того чтобы выяснить, связано ли индуцируемое карнозином снижение количества клеток РС-12 с изменениями в прогрессии клеточного цикла, клетки РС-12 обрабатывали карнозином (10 - 50 мМ) в течение 48 ч. По истечении периода инкубации клетки фиксировали, окрашивали PI и с помощью проточного цитометра измеряли количество клеток в G0/G1, S и G2/М фазах по интенсивности флуоресценции PI. На Рис. 3.1.3.А. представлен пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с 50 мМ карнозина. Результаты анализа процентного распределения клеток по фазам клеточного цикла представлены на Рис. 3.1.3.Б. Рисунок 3.1.3. Карнозин индуцирует накопление клеток РС-12 в S и G2/М-фазах клеточного цикла. Клетки инкубировали с карнозином (5 - 50 мМ) в течение 48 ч. Содержание ДНК измеряли на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. (А) Пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с 50 мМ карнозина. (Б) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после обработки карнозином. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p 0.05. Как следует из Рис. 3.1.3.Б, карнозин дозо-зависимо увеличивал количество клеток в S и G2/M фазах клеточного цикла. Параллельно происходило снижение количества клеток в G0/G1 фазе. Достоверно отличимый от контроля результат был получен при концентрациях 25 - 50 мМ карнозина. В пробах, обработанных 50 мМ карнозина, число S и G2/M клеток возрастало, соответственно, до 15% и 22%, по сравнению с 12% и 17% в контроле. Количество G0/G1 клеток при этом снижалось до 62% по сравнению с 71% в контроле. Важно отметить, что увеличения количества апоптотических клеток под действием карнозина выявлено не было (отсутствует sub-G1 пик, Рис. 3.1.3.А). Это еще раз подтверждает способность карнозина воздействовать на процессы клеточной пролиферации, а не гибели. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что снижение количества клеток РС-12 под действием карнозина происходит в результате замедления прогрессии клеточного цикла и накопления клеток в S и G2/М фазах клеточного цикла.
У карнозина есть несколько природных производных, среди которых наиболее изученными являются ацетил-карнозин (N-ацетил--аланил-L-гистидин) и анзерин (у-амино-бутирил-L-гистидин). Изучение структурно-функциональных взаимосвязей между карнозином и его производными в отношении изменения прогрессии клеточного цикла клеток РС-12 может помочь оценить степень вовлеченности отдельных частей молекулы в исследуемый эффект карнозина. Для того чтобы сравнить, изменения в прогрессии клеточного цикла под действием карнозина и его производных, клетки обрабатывали 50 мМ карнозина, анзерина или ацетил-карнозина в течение 48 ч и анализировали распределение клеток по фазам клеточного цикла согласно содержанию ДНК (Рис. 3.1.4). Как видно из Рис. 3.1.4.А, все исследованные вещества индуцировали накопление клеток в S и G2/М фазах, однако наиболее выраженный эффект демонстрировал анзерин. В пробах обработанных анзерином количество S и G2/М клеток возрастало, соответственно, на 79% и 65%. А количество G0/G1 клеток уменьшалось на 21%. Наименее выраженный эффект демонстрировал ацетил-карнозин. Основываясь на полученных данных, было сделано заключение о том, что метилирование карнозина способствует усилению ингибирующего эффекта на прогрессию клеточного цикла, в то время как ацетилирование карнозина этот эффект ослабляет. Рисунок 3.1.4. Анзерин и L-гистидин--аланин замедляют прогрессию клеточного цикла эффективнее, чем карнозин. Клетки РС-12 инкубировали с карнозином и его производными в течение 48 ч. Содержание ДНК измеряли на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с 50 мМ карнозина, анзерина, ацетил-карнозина (А) или 1 - 10 мМ L-гистидин--аланина (Б). Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p 0.05. Синтетическое производное карнозина L-гистидин--аланин, представляющий собой последовательность аминокислот карнозина в обратном порядке (т.н. «Карнозин наоборот») эффективнее, чем карнозин индуцировал накопление клеток в S и G2/М фазах клеточного цикла (Рис. 3.1.4.Б). Клетки обрабатывали L-гистидин--аланином в концентрации 1 - 10 мМ в течении 48 ч, затем с помощью проточного цитометра изучали распределение клеток по фазам клеточного цикла согласно содержанию ДНК. Достоверно отличимый от контроля результат наблюдали при концентрации 5 – 10 мМ, то есть в 5 раз ниже, чем для карнозина. Причем, под действием 10 мМ L-гистидин--аланина количество S и G2/М клеток возрастало на 80% и 60% соответственно, что превышало значения, полученные под действием 50 мМ карнозина. В концентрации выше 10 мМ L-гистидин--аланин проявлял токсическое действие, поскольку приводил к гибели более 90% клеток. Таким образом, L-гистидин--аланин замедлял прогрессию клеточного цикла эффективнее, чем карнозин, однако обладал сильным цитотоксическим эффектом.
