Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Биомедицинские аспекты применения электрохимических методов анализа 9
1.2. Биосенсорика как новое направление электроаналитических методов 12
1.3. Методы электрохимического детектирования нуклеиновых кислот 19
1.3.1. Использование индикаторов и меток для детектирования ДНК 20
1.3.2. Электрохимические свойства нуклеиновых кислот 27
1.3.3. Детектирование структурных изменений в ДНК 32
1.4. Применение углеродных нанотрубок в электрохимических биосенсорах 35
1.5. Заключение по обзору литературы 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований
2.1. Реактивы и оборудование 41
2.2. Модификация электродов углеродными нанотрубками 43
2.3. Электрохимические измерения 43
2.4. Детектирование биомолекул на модифицированных электродах 44
2.5. Термическая обработка ДНК 45
2.6. Механическое разрушение ДНК 46
2.7. Обработка ДНК активными формами кислорода 46
2.8. Электрофорез ДНК и УНТ 46
2.9. Атомно-силовая микроскопия 47
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Разработка электродов, модифицированных углеродными нанотрубками 48
3.1.1. Структурные и электрохимические свойства электродов, модифицированных углеродными нанотрубками 48
3.1.2. Особенности электрохимических реакций на СУЭ-УНТ 58
3.2. Электрохимические свойства компонентов нуклеиновых кислот на СУЭ-УНТ 68
3.2.1. Вольтамперометрическое поведение пуриновых оснований и их производных на СУЭ-УНТ 69
3.2.2. Механизм электрохимического окисления гуанина и дГМФ на СУЭ-УНТ 75
3.3. Адсорбция и окисление дезоксирибонуклеиновых кислот на СУЭ-УНТ 93
3.3.1. Связывание ДНК с углеродными нанотрубками в растворе 93
3.3.2. Электрохимическое поведение нативной и денатурированной ДНК на СУЭ-УНТ 95
3.3.3. Влияние фрагментации ДНК на ее электрохимическое поведение на СУЭ-УНТ 100
3.3.4. Детектирование депуринизации ДНК с использованием СУЭ-УНТ 102
3.3.5. Влияние гидроксил-радикалов на электрохимическое окисление ДНК 104
3.3.6. Обсуждение результатов 107
Выводы 119
Литература 120
- Биомедицинские аспекты применения электрохимических методов анализа
- Применение углеродных нанотрубок в электрохимических биосенсорах
- Модификация электродов углеродными нанотрубками
- Структурные и электрохимические свойства электродов, модифицированных углеродными нанотрубками
Введение к работе
Актуальность проблемы
Нуклеиновые кислоты являются одними из немногих биополимеров, обладающих электрохимической активностью. Способность нуклеотидов окисляться или восстанавливаться на электродах позволяет проводить прямое детектирование нуклеиновых кислот, что актуально для разработки гибридизационных биосенсоров, не требующих использования меток или индикаторов. Сигналом в таких биосенсорах, как правило, служит ток окисления гуаниновых или адениновых нуклеотидов (Kerman et al., 2004).
Известно, что электрохимическая активность ДНК зависит от ее структуры. Структурные изменения в двунитевой ДНК, возникающие в результате действия повреждающих факторов, в том числе химических агентов, могут приводить к увеличению тока окисления пуриновых нуклеотидов. Биосенсоры, реализующие этот принцип детектирования, применяются для изучения взаимодействия ДНК с различными антибиотиками и выявления мутагенной активности ксенобиотиков (Rauf et al., 2005; Oliveira-Brett and Silva, 2002).
Однако разработка новых биосенсоров, основанных на электроактивных свойствах нуклеиновых кислот, сдерживается вследствие низкой чувствительности детектирования нуклеотидов, окисление которых наблюдается при высоких потенциалах и характеризуется низкой скоростью переноса электронов (Armistead and Thorp, 2000).
В настоящее время широкое применение в биосенсорике находят углеродные нанотрубки (УНТ) благодаря их уникальному строению, физико-химическим свойствам и совместимости с биологическими молекулами. Работы последних лет показывают, что модификация электродов УНТ облегчает электрохимические процессы с участием биомолекул и
способствует увеличению регистрируемого сигнала (Merkoci et al., 2005а). Эти свойства позволяют рассматривать УНТ как один из наиболее перспективных материалов для создания электрохимических биосенсоров, использующих электроактивные свойства нуклеиновых кислот.
Разработка таких биосенсоров предполагает выяснение особенностей электрохимического окисления полинуклеотидов. Эти процессы активно исследовались ранее на обычных углеродных электродах. Изучение поведения ДНК на электродах, модифицированных УНТ, представляет собой актуальную задачу, требующую своего решения.
Цель исследования: разработка электрохимических биосенсоров на основе электродов, модифицированных УНТ, для прямого детектирования дезоксирибонуклеиновых кислот и их характеристики.
Были поставлены следующие задачи:
модификация стеклоуглеродных электродов углеродными нанотрубками и тестирование полученных электродов;
изучение электрохимических свойств низкомолекулярных компонентов нуклеиновых кислот на модифицированных электродах;
выяснение особенностей поведения ДНК на разработанных электродах в зависимости от структуры биополимера;
разработка сенсоров на основе модифицированных электродов для детектирования повреждений ДНК.
Научная новизна
Предложен спектрофотометрический метод оценки концентрации УНТ в суспензиях, используемых для модификации электродов.
Выявлен механизм электрохимического окисления дезоксигуанозин-монофосфата на электродах, модифицированных УНТ.
Установлено, что нативная и денатурированная ДНК претерпевают интенсивное окисление на электродах, модифицированных УНТ.
Получены характеристики поведения нативной и денатурированной ДНК на электродах, модифицированных УНТ; оценен вклад адсорбции в электроокисление ДНК.
Электроды, модифицированные УНТ, применены для детектирования депуринизации ДНК и действия на ДНК активных форм кислорода.
Практическая значимость
Предложен способ конструирования электродов на основе УНТ, которые могут быть использованы в качестве нового типа электрохимических преобразователей, в том числе для чувствительного детектирования электрохимически активных биомолекул.
Разработанные электроды позволяют оценивать степень нативности и молекулярную массу ДНК, содержание гуаниновых нуклеотидов в ДНК, а также свободного гуанина, образующегося при депуринизации.
Полученные данные о поведении ДНК на разработанных электродах служат практической основой для создания электрохимических устройств и биосенсоров с использованием электродов, модифицированных УНТ, в качестве преобразователя и тока окисления гуаниновых нуклеотидов в качестве сигнала.
Положения, выносимые на защиту:
1. Способ изготовления электродов, модифицированных УНТ, для детектирования нуклеиновых кислот и их компонентов.
Результаты применения комплекса независимых методов исследования для характеристики поверхностной структуры электродов, модифицированных УНТ, и выявления адсорбции ДНК на углеродных нанотрубках.
Особенности поведения ДНК при окислении на электродах, модифицированных УНТ.
Сенсоры, разработанные на основе электродов, модифицированных УНТ, для оценки депуринизации ДНК и повреждения ДНК активными формами кислорода.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на международном симпозиуме "New trends in nucleic acid based biosensors" (Firenze, 2003), VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием "ЭМА-2004" (Уфа, 2004), V и VI Научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005-2006), IX международном конгрессе по биосенсорам "Biosensors 2006" (Toronto, 2006), международном конгрессе по аналитическим наукам "ICAS-2006" (Moscow, 2006).
По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Биомедицинские аспекты применения электрохимических методов анализа
Применение электрохимических методов для решения проблем биологии и медицины имеет богатую историю и многообещающие перспективы. Электрохимические методы характеризуются широкими аналитическими возможностями в детектировании ФАВ, низкой требовательностью к условиям проведения анализа, простотой и многофункциональностью детектирующих устройств и возможностью их миниатюризации.
Эти методы используют как для определения индивидуальных компонентов в биологических средах (Pinkerton and Lawson, 1982; Meyerhotf, 1990), так и для оценки некоторых интегральных показателей крови (Ziyatdinova et al., 2006).
Одним из первых электрохимических методов, примененных для рутинного анализа биологических жидкостей, была потенциометрия, принцип которой основан на измерении потенциала ячейки в условиях термодинамического равновесия. Регистрируемый потенциал является функцией активности (концентрации) определяемого вещества (аналита). Для достижения селективности анализа многокомпонентых жидкостей в потенциометрии используют ион-селективные электроды, избирательно проницаемые для детектируемого компонента (Pinkerton and Lawson, 1982; Meyerhotf, 1990).
Разработаны ион-селективные электроды для потенциометрического определения в биологических жидкостях ионов (К+, Са +, СГ, Na+, ЬҐ) и газов (Ог, СОг), являющихся важными диагностическими показателями, а также некоторых лекарственных средств. Эти электроды находят применение в биологических исследованиях и клинической практике (Pinkerton and Lawson, 1982; Meyerhotf, 1990).
Для анализа биометаболитов широкое распространение получили вольтамперометрические методы, характеризующиеся высокой чувствительностью и линейной зависимостью сигнала от концентрации аналита (Pinkerton and Lawson, 1982; Meyerhotf, 1990; Lawrence et al., 2002).
Принцип вольтамперометрических методов заключается в регистрации тока при окислении или восстановлении электрохимически активного вещества на электроде под действием приложенного напряжения. Эти процессы протекают при определенных значениях потенциала, что обуславливает селективность вольтамперометрического детектирования. Однако вещества, которые совместно присутствуют в биологических средах, могут иметь близкие редокс-потенциалы, что затрудняет их одновременное детектирование. В некоторых случаях эта проблема может быть решена посредством модификации электрода полимерными мембранами, обладающими сродством к определяемому веществу или уменьшающими мешающее влияние других компонентов раствора (Тернер и др., 1992; Lawrence et al., 2002).
В 1962 г. Кларк и Лайонс впервые осуществили пространственное сближение фермента глюкозооксидазы и электрода. Изготовленное ими устройство - биосенсор - был предназначен для определения концентрации глюкозы в крови (Clark et al., 1962). Применение ферментных электродов позволило существенно увеличить селективность вольтамперометрического анализа ФАВ благодаря высокой специфичности и каталитической активности ферментов. Детектирование аналитов с использованием ферментных электродов осуществляют по потреблению субстрата (в случае многосубстратной реакции) или накоплению продукта ферментативной реакции. К настоящему времени разработаны разнообразные по конструкции и операционным характеристикам ферментные электроды для определения важнейших низкомолекулярных биометаболитов, включая глюкозу, лактат, мочевину, креатинин и креатин, мочевую кислоту, аминокислоты и др. (Тернер и др., 1992; Cuietal., 2001).
Принцип пространственного объединения биологического компонента и электрода оказался продуктивным, получив активное развитие в новом направлении электроаналитических методов - биосенсорике. На сегодняшний день одной из главных задач электрохимических биосенсоров является разработка новых методов детектирования белков и нуклеиновых кислот. Эти методы, как и традиционные методы анализа биомакромолекул, основаны на принципах биологического распознавания, реализуемого в иммунных и комплементарных взаимодействиях.
Вместе с тем, электрохимические биосенсоры, как правило, используют новые принципы детектирования аффинных взаимодействий, которые позволяют увеличивать экспрессность и чувствительность анализа, а также миниатюризировать детектирующие устройства (Ghindilis et al., 1998; Warsinke et al., 2000; Pividori et al., 2000; Wang, 2000a).
Применение углеродных нанотрубок в электрохимических биосенсорах
Электроды из углеродных материалов широко применяются в электроаналитической химии и биосенсорах. Такие электроды характеризуются широким диапазоном поляризационных потенциалов, низкими фоновыми токами, хорошей воспроизводимостью сигнала и простотой регенерации рабочей поверхности (Wang, 2000b; Pividori et al., 2000).
С момента своего открытия (Iijima, 1991; Iijima and Ichihashi, 1993), углеродные нанотрубки (УНТ) активно исследуются в качестве нового электродного материала и компонента электрохимических биосенсоров.
Одностенная УНТ, как правило, представляет собой гексагональный графитовой слой, сложенный в цилиндрическую структуру диаметром от 0,4 до 2 нм. В зависимости от диаметра и степени хиральности ("закрученности"), одностенные УНТ могут обладать металлической проводимостью или полупроводниковыми свойствами. В отличие от одностенных УНТ, многостенные УНТ состоят из нескольких вложенных друг в друга нанотрубок общим диаметром до 100 нм и характеризуются только металлической проводимостью (Merkoci et al., 2005а; Gooding, 2005).
Предложены различные способы изготовления электродов на основе УНТ. Углеродные нанотрубки, также как и другие графитовые материалы, можно вводить в состав электродных паст (Valentini et al., 2003; Rubianes and Rivas, 2003) или твердых композиций (Wang and Musameh, 2003; Pumera et al., 2006). Преимуществом включения УНТ в состав твердых композиций, таких как эпоксидная смола (Pumera et al., 2006) или тефлон (Wang and Musameh, 2003), является возможность полирования электрода для обновления его поверхности.
УНТ используют в качестве модификатора обычных углеродных и металлических электродов. Модификацию электродов углеродными нанотрубками осуществляют путем формирования тонких покрытий УНТ (Azamian et al., 2002; Ни et al., 2004; Zhao et al., 2005) ИЛИ абразивного нанесения (Salimi et al., 2004; Salimi and Hallaj, 2005). Перспективным способом конструирования электродов на основе УНТ является получение вертикально-ориентированных монослоев в результате синтеза УНТ непосредственно на электродной поверхности или химической пришивки УНТ к электроду по концевым функциональным группам (Li et al., 2002;-Koehne et al., 2004a; Gooding, 2005).
К настоящему времени исследовано электрохимическое поведение многих редокс-активных соединений на электродах, модифицированных УНТ. Впервые Бритто и др. наблюдали идеально обратимое двухэлектронное окисление дофамина на электроде, покрытом диспергированными в бромоформе УНТ, тогда как на других углеродных электродах этот процесс протекает квазиобратимо (Britto et al., 1996).
Впоследствии было обнаружено, что УНТ обладают выраженной способностью катализировать медленные электродные реакции с участием различных биомолекул, таких как коферменты (Valentini et al., 2004; Musameh et al., 2005; Pumera et al., 2006), нейромедиаторы (Luo et al., 2001; Wang et al., 2002b; Salimi et al., 2004), тиол-содержащие молекулы (Zhao et al., 2003b; Salimi and Hallaj, 2005), гормоны (Sun et al., 2003; Terui et al., 2006). Электрокаталитическое действие УНТ предполагает возможность более чувствительного и в некоторых случаях более селективного детектирования биомолекул на электродах, модифицированных УНТ, по сравнению с обычными электродами, что актуально для разработки электрохимических биосенсоров.
Разными авторами показано, что применение УНТ в качестве модификатора электродов позволяет улучшить рабочие характеристики гибридизационных сенсоров, в которых сигнал генерируют с помощью редокс-индикатора или ферментной метки. Помимо значительного увеличения чувствительности детектирования индикаторной реакции, модификация электродов углеродными нанотрубками способствует увеличению воспроизводимости сигнала и стабильности биосенсора (Cai et al., 2003; Wang et al., 2004a; Li et al., 2005).
Как было рассмотрено выше, окислительно-восстановительные ферменты, а также нуклеиновые кислоты, как правило, характеризуются низкой редокс-активностью, что затрудняет их определение. Вместе с тем, прямое детектирование этих биомакромолекул представляет особый интерес для разработки электрохимических биосенсоров.
По свидетельствам многих исследователей, модификация электродов углеродными нанотрубками благоприятствует протеканию электрохимических реакций с участием труднодоступных редокс-центров оксидоредуктаз (Zhao et al., 2003а; Zhao et al., 2005a,b; Yin et al., 2005; Salimi et al., 2005). Это представляет интерес для разработки ферментных электродов третьего поколения, а также биосенсоров, основанных на биоэлектрокаталитическом генерировании сигнала.
Модификация электродов углеродными нанотрубками
Углеродные нанотрубки (УНТ) подвергали ультразвуковому диспергированию в смеси концентрированных серной и азотной кислот (3:1 по объему) и далее осаждали центрифугированием. Осадок УНТ суспендировали в небольшом объеме бидистиллированной воды. Концентрацию УНТ оценивали спектрофотометрически по поглощению при 260 нм и выражали в единицах оптической плотности (опт. ед.).
Стеклоуглеродные электроды (СУЭ) перед использованием полировали порошком оксида алюминия, промывали ацетоном и ополаскивали дистиллированной водой. Для модификации на рабочую поверхность СУЭ наносили 2 мкл суспензии УНТ с оптической плотностью 10-140 опт. ед. и медленно высушивали на воздухе.
В качестве фоновых электролитов использовали 0.01 М ацетатный или 0.01 М фосфатный буферные растворы с различными значениями рН, содержащие 0.1 М хлорид натрия. Трехэлектродная ячейка объемом 10 мл состояла из рабочего СУЭ (диаметр 1.5 мм) или СУЭ, модифицированного УНТ, хлоридсеребряного электрода сравнения (Ag AgCl); противо-электродом служила никелевая пластина. Вольтамперометрические измерения проводили в режиме линейного сканирования потенциала.
СУЭ, модифицированные УНТ (СУЭ-УНТ), отмывали в буферном растворе при перемешивании и далее записывали вольтамперограммы до получения воспроизводимых фоновых кривых.
Емкость (С) и сопротивление (R) электродов регистрировали с помощью моста переменного тока при переменном напряжении амплитудой 10 мВ и частотой от 0.11 до 30 KHZ. Измерения проводили при установившемся значении электродного потенциала, полагая, что в этом случае электрод находится в квазиравновесных условиях. Значения С и R пересчитывали на параллельную схему замещения, включающую сопротивление электролита (Rco), емкость двойного слоя (СдС) и соединенный параллельно с ней электрохимический импеданс (Дамаскин, 1965). Величины Rco и Сдс, измеренные при 30 KHZ, использовали для характеристики чистых СУЭ и СУЭ-УНТ.
Концентрацию азотистых оснований, нуклеотидов и ДНК вычисляли спектрофотометрически (Досон и др., 1991). Для денатурации ДНК раствор прогревали при 100С в течение 10-15 минут и быстро охлаждали на ледяной бане.
Азотистые основания, нуклеотиды и ДНК аккумулировали на СУЭ-УНТ, помещая 5 мкл раствора вещества на поверхность электрода. Через несколько минут электроды отмывали в перемешиваемом буферном растворе и регистрировали линейные или циклические вольтамперограммы в отсутствии электроактивных компонентов в электролите.
Для изучения электрохимического поведения полинуклеотидов на СУЭ-УНТ использовали растворы нативной и денатурированной ДНК из эритроцитов цыплят и тимуса теленка с концентрацией 1.0 мг/мл.
ДНК наносили на СУЭ-УНТ посредством инкубации электрода в растворе ДНК (адсорбция) или высушивания 2 мкл раствора ДНК на электроде (иммобилизация), после чего СУЭ-УНТ промывали в буферном растворе при перемешивании.
Регистрируемым сигналом служил ток окисления вещества на СУЭ-УНТ. Для статистического представления результатов использовали среднее арифметическое значение и стандартное отклонение. Достоверность различий между выборочными группами оценивали с помощью -критерия Стьюдента (Лакин, 1990).
ДНК растворяли в дистиллированной воде, 0.01 М ацетате натрия (рН 4.5), 0.01 М трис-HCl (рН 7.5) или 0.01 М дигидрофосфате натрия + 0.1 М хлориде натрия (рН 7.5). Растворы ДНК инкубировали на кипящей бане 5, 15 или 30 мин. и далее быстро охлаждали на ледяной бане или медленно при комнатной температуре. Продукты термической обработки ДНК адсорбировали на СУЭ-УНТ и детектировали вольтамперометрически. Диализ растворов ДНК проводили против бидистиллированной воды при 4С в течение ночи.
Структурные и электрохимические свойства электродов, модифицированных углеродными нанотрубками
Для разрушения ДНК использовали механические способы, такие как пипетирование шприцем и ультразвуковая (УЗ) обработка. Величины пика окисления гуаниновых нуклеотидов нДНК и дДНК на СУЭ-УНТ до и после разрушения биополимеров приведены на рис.25. Степень фрагментации биополимеров оценивали электрофоретически в агарозном геле (рис.26).
Влияние используемых способов разрушения ДНК на ток ее окисления было различным. Пипетирование раствора ДНК не приводило к изменению сигнала как для нДНК, так и для дДНК (рис.25).
Электрофоретические эксперименты показали (рис.26), что подобная обработка не сопровождается существенным уменьшением молекулярной массы ДНК. В частности, в результате пипетирования нДНК наблюдалось уменьшение количества высокомолекулярной ДНК, задерживающейся в лунках, наряду с некоторым увеличением подвижности основной фракции ДНК (рис.26, дорожка 3). Пипетирование дДНК не приводило к заметному уменьшению ее молекулярной массы (дорожка 6) по сравнению с контрольной пробой (дорожка 5).
Пробы нДНК и дДНК, подвергнутые действию УЗ, мигрируют на значительное расстояние от старта, что свидетельствует о существенном уменьшении длины биополимеров (рис.26, дорожки 4 и 7 соответственно). При этом наблюдалось заметное увеличение тока окисления обработанных образцов нДНК и дДНК на СУЭ-УНТ по сравнению с контрольными пробами (рис.25).
Относительное увеличение сигнала после обработки ДНК ультразвуком в случае нДНК было почти в 2 раза больше, чем для дДНК (рис.25). Вероятно, это связано с частичной денатурацией биополимера под действием УЗ. Полученные результаты подтверждают, что пространственная протяженность молекул ДНК оказывает влияние на ее электрохимическое поведение на СУЭ-УНТ.
Появление на анодных вольтамперограммах ДНК пика гуанина (рис.22) указывает на то, что исследуемые препараты ДНК содержат примесь этого азотистого основания в мономерной форме. После диализа растворов ДНК пик окисления гуанина (пик I) исчезал на вольтамперограмме при почти неизменном пике ДНК (пик II). Это подтверждает, что пик I соответствует свободному гуанину, не связанному с сахарофосфатным остовом ДНК.
Обнаружено, что содержание гуанина в растворе ДНК увеличивается после термической денатурации биополимера (рис.22Б). Это означает, что термическая обработка ДНК сопровождается ее депуринизацией.
Выяснено, что при инкубации СУЭ-УНТ в растворах с различным содержанием гуанина величина пика I линейно возрастает с увеличением концентрации вещества в интервале приблизительно от 1.9x10" до 3.6x10"5 М; уравнение линейной зависимости имеет вид: Y (Ю-6 А) = (0.63 ± 0.12) + (0.33 ± 0.02) X (10"6М) г = 0.9938
Линейная зависимость тока окисления гуанина, адсорбируемого на СУЭ-УНТ, от концентрации вещества, а также установленный выше конкурентный характер адсорбции низкомолекулярных компонентов ДНК на СУЭ-УНТ ( 3.2.1), допускают возможность применения разработанных электродов для количественного детектирования гуанина, высвобождаемого при депуринизации, в присутствии ДНК.
Для проверки этой возможности исследовано влияние различных условий на депуринизацию ДНК при повышенных температурах (табл.2). Для этих целей использовали ДНК(тт), поскольку прогретые растворы этого 103 биополимера содержали большее количество гуанина, чем растворы денатурированной ДНК(эц) (рис.22).
Пробы ДНК инкубировали при 100С установленное время в растворах различного состава. После инкубации все растворы, кроме пробы 5, подвергали быстрому охлаждению (денатурации) на ледяной бане; пробу 5 охлаждали при комнатной температуре (без денатурации). Продукты инкубации адсорбировали на СУЭ-УНТ и регистрировали пики гуанина (пик I) и гуаниновых нуклеотидов (пик II) (табл.2).
Прогревание раствора ДНК в дистиллированной воде сопровождалось значительным увеличением регистрируемых пиков (табл.2, пробы 2-5) по сравнению с контрольным раствором ДНК, не подвергнутым термической обработке (проба 1).
Пик I увеличивался пропорционально времени инкубации в интервале 5-30 мин. (табл.2, пробы 2-4), что подтверждает зависимость депуринизации ДНК от температуры. По сравнению с пиком I, величина пика II в меньшей степени зависела от времени прогревания. К 30 мин. инкубации регистрируемые пики становятся почти равными по величине (проба 4).
Пробы ДНК, инкубируемые в буферных растворах, характеризовались различным содержанием гуанина (табл.2, пробы 6-8). Для раствора ДНК в 0.01 М натрий-ацетатном буфере (рН 4.5) величина пика I была существенно выше, чем для остальных проб, что свидетельствует о высокой скорости депуринизации в этих условиях (проба 6).
Содержание свободного гуанина уменьшалось при использовании 0.01 М трис-НС1-буфера, рН 7.5 (табл.2, проба 7) и достигало минимального значения в пробе с 0.1 М хлоридом натрия (проба 8). В пробе 8 количество гуанина в мономерной форме было соизмеримо с его уровнем в растворе нативной ДНК (проба 1).
Результаты вольтамперометрического изучения депуринизации ДНК на СУЭ-УНТ согласуются с литературными данными о кислотном механизме гидролиза iV-гликозидной связи и замедлении этого процесса с увеличением ионной силы раствора (Greer and Zamenhof, 1962; Lindahl and Nyberg, 1972; Lindahl, 1993). Это подтверждает, что разработанные электроды можно применять для количественного детектирования депуринизации ДНК.
