Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Биомедицинские аспекты применения электрохимических методов анализа 9
1.2. Биосенсорика как новое направление электроаналитических методов 12
1.3. Методы электрохимического детектирования нуклеиновых кислот 19
1.3.1. Использование индикаторов и меток для детектирования ДНК 20
1.3.2. Электрохимические свойства нуклеиновых кислот 27
1.3.3. Детектирование структурных изменений в ДНК 32
1.4. Применение углеродных нанотрубок в электрохимических биосенсорах 35
1.5. Заключение по обзору литературы 40
2. Материалы и методы исследований
2.1. Реактивы и оборудование 41
2.2. Модификация электродов углеродными нанотрубками 43
2.3. Электрохимические измерения 43
2.4. Детектирование биомолекул на модифицированных электродах 44
2.5. Термическая обработка ДНК 45
2.6. Механическое разрушение ДНК 46
2.7. Обработка ДНК активными формами кислорода 46
2.8. Электрофорез ДНК и УНТ 46
2.9. Атомно-силовая микроскопия 47
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Разработка электродов, модифицированных углеродными нанотрубками 48
3.1.1. Структурные и электрохимические свойства электродов, модифицированных углеродными нанотрубками 48
3.1.2. Особенности электрохимических реакций на СУЭ-УНТ 58
3.2. Электрохимические свойства компонентов нуклеиновых кислот на СУЭ-УНТ 68
3.2.1. Вольтамперометрическое поведение пуриновых оснований и их производных на СУЭ-УНТ 69
3.2.2. Механизм электрохимического окисления гуанина и дГМФ на СУЭ-УНТ 75
3.3. Адсорбция и окисление дезоксирибонуклеиновых кислот на СУЭ-УНТ 93
3.3.1. Связывание ДНК с углеродными нанотрубками в растворе 93
3.3.2. Электрохимическое поведение нативной и денатурированной ДНК на СУЭ-УНТ 95
3.3.3. Влияние фрагментации ДНК на ее электрохимическое поведение на СУЭ-УНТ 100
3.3.4. Детектирование депуринизации ДНК с использованием СУЭ-УНТ 102
3.3.5. Влияние гидроксил-радикалов на электрохимическое окисление ДНК 104
3.3.6. Обсуждение результатов 107
Выводы 119
- Биосенсорика как новое направление электроаналитических методов
- Модификация электродов углеродными нанотрубками
- Электрохимические свойства компонентов нуклеиновых кислот на СУЭ-УНТ
- Влияние фрагментации ДНК на ее электрохимическое поведение на СУЭ-УНТ
Введение к работе
Актуальность проблемы
Нуклеиновые кислоты являются одними из немногих биополимеров, обладающих электрохимической активностью. Способность нуклеотидов окисляться или восстанавливаться на электродах позволяет проводить прямое детектирование нуклеиновых кислот, что актуально для разработки гибридизационных биосенсоров, не требующих использования меток или индикаторов. Сигналом в таких биосенсорах, как правило, служит ток окисления гуаниновых или адениновых нуклеотидов (Kerman et al., 2004).
Известно, что электрохимическая активность ДНК зависит от ее структуры. Структурные изменения в двунитевой ДНК, возникающие в результате действия повреждающих факторов, в том числе химических агентов, могут приводить к увеличению тока окисления пуриновых нуклеотидов. Биосенсоры, реализующие этот принцип детектирования, применяются для изучения взаимодействия ДНК с различными антибиотиками и выявления мутагенной активности ксенобиотиков (Rauf et al., 2005; Oliveira-Brett and Silva, 2002).
Однако разработка новых биосенсоров, основанных на электроактивных свойствах нуклеиновых кислот, сдерживается вследствие низкой чувствительности детектирования нуклеотидов, окисление которых наблюдается при высоких потенциалах и характеризуется низкой скоростью переноса электронов (Armistead and Thorp, 2000).
В настоящее время широкое применение в биосенсорике находят углеродные нанотрубки (УНТ) благодаря их уникальному строению, физико-химическим свойствам и совместимости с биологическими молекулами. Работы последних лет показывают, что модификация электродов УНТ облегчает электрохимические процессы с участием биомолекул и
способствует увеличению регистрируемого сигнала (Merkoci et al., 2005а). Эти свойства позволяют рассматривать УНТ как один из наиболее перспективных материалов для создания электрохимических биосенсоров, использующих электроактивные свойства нуклеиновых кислот.
Разработка таких биосенсоров предполагает выяснение особенностей электрохимического окисления полинуклеотидов. Эти процессы активно исследовались ранее на обычных углеродных электродах. Изучение поведения ДНК на электродах, модифицированных УНТ, представляет собой актуальную задачу, требующую своего решения.
Цель исследования: разработка электрохимических биосенсоров на основе электродов, модифицированных УНТ, для прямого детектирования дезоксирибонуклеиновых кислот и их характеристики.
Были поставлены следующие задачи:
модификация стеклоуглеродных электродов углеродными нанотрубками и тестирование полученных электродов;
изучение электрохимических свойств низкомолекулярных компонентов нуклеиновых кислот на модифицированных электродах;
выяснение особенностей поведения ДНК на разработанных электродах в зависимости от структуры биополимера;
разработка сенсоров на основе модифицированных электродов для детектирования повреждений ДНК.
Научная новизна
Предложен спектрофотометрический метод оценки концентрации УНТ в суспензиях, используемых для модификации электродов.
Выявлен механизм электрохимического окисления дезоксигуанозин-монофосфата на электродах, модифицированных УНТ.
Установлено, что нативная и денатурированная ДНК претерпевают интенсивное окисление на электродах, модифицированных УНТ.
Получены характеристики поведения нативной и денатурированной ДНК на электродах, модифицированных УНТ; оценен вклад адсорбции в электроокисление ДНК.
Электроды, модифицированные УНТ, применены для детектирования депуринизации ДНК и действия на ДНК активных форм кислорода.
Практическая значимость
Предложен способ конструирования электродов на основе УНТ, которые могут быть использованы в качестве нового типа электрохимических преобразователей, в том числе для чувствительного детектирования электрохимически активных биомолекул.
Разработанные электроды позволяют оценивать степень нативности и молекулярную массу ДНК, содержание гуаниновых нуклеотидов в ДНК, а также свободного гуанина, образующегося при депуринизации.
Полученные данные о поведении ДНК на разработанных электродах служат практической основой для создания электрохимических устройств и биосенсоров с использованием электродов, модифицированных УНТ, в качестве преобразователя и тока окисления гуаниновых нуклеотидов в качестве сигнала.
Положения, выносимые на защиту:
1. Способ изготовления электродов, модифицированных УНТ, для детектирования нуклеиновых кислот и их компонентов.
Результаты применения комплекса независимых методов исследования для характеристики поверхностной структуры электродов, модифицированных УНТ, и выявления адсорбции ДНК на углеродных нанотрубках.
Особенности поведения ДНК при окислении на электродах, модифицированных УНТ.
Сенсоры, разработанные на основе электродов, модифицированных УНТ, для оценки депуринизации ДНК и повреждения ДНК активными формами кислорода.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на международном симпозиуме "New trends in nucleic acid based biosensors" (Firenze, 2003), VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием "ЭМА-2004" (Уфа, 2004), V и VI Научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005-2006), IX международном конгрессе по биосенсорам "Biosensors 2006" (Toronto, 2006), международном конгрессе по аналитическим наукам "ICAS-2006" (Moscow, 2006).
По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Биосенсорика как новое направление электроаналитических методов
Согласно рекомендациям IUPAC, электрохимический биосенсор можно определить как независимое интегрированное устройство, способное давать специфическую количественную или полуколичественную аналитическую информацию, используя распознающий биологический компонент (биохимический рецептор), удерживаемый в пространственном контакте с электрохимическим преобразователем (Thevenot et al., 2001). Биологический компонент электрохимических сенсоров обычно представлен основными типами природных макромолекул - различными белками, преимущественно ферментами и антителами, а также нуклеиновыми кислотами. Реже в качестве биокомпонента используют низкомолекулярные вещества (например, коферменты), субклеточные структуры (рецепторные комплексы, органеллы), а также цельные клетки и ткани (Тернер и др., 1992). Применяемое к биокомпоненту понятие биохимический рецептор указывает на его главную функцию - биологическое распознавание, необходимое для избирательного связывания определяемого вещества в условиях равновесия или химического превращения. Специфичность рецепторной системы биосенсора в первую очередь зависит от природы биокомпонента. Например, биосенсоры, использующие ферменты или клетки, могут обладать относительно широкой специфичностью. Высокоспецифичные системы реализованы в так называемых иммунных или гибридизационных биосенсорах, основанных соответственно на принципах иммунохимических и комплементарных взаимодействий. Следует отметить, что на специфичность биосенсоров сильное влияние может оказывать способ иммобилизации биомолекул на поверхности преобразователя (Thevenot et al., 2001). Преобразующий элемент электрохимического биосенсора (электрод) выполняет функцию детектирования протекающих на его поверхности биохимических реакций. В электрохимических биосенсорах наиболее широкое применение находят вольтамперометрические преобразователи сигнала (Тернер и др., 1992). Общие принципы работы вольтамперометрических биосенсоров, а также их эволюцию удобно рассмотреть на примере ферментных электродов. Разрабатываемые ферментные электроды предназначены для определения различных субстратов, преимущественно биологических метаболитов, обнаружение которых представляет интерес в клинической медицине, экологическом мониторинге и пищевой индустрии.
Важным этапом конструирования биосенсора является иммобилизация фермента на поверхности электрода. Удобным способом иммобилизации является включение фермента в состав проводящих полимерных матриц, наносимых на электрод. Фермент можно закрепить на поверхности предварительно модифицированного электрода посредством адсорбции или ковалентной пришивки (Luong et al., 1988; Cosnier et al., 1999). Выбор фермента обусловлен типом определяемого субстрата. Обычно для разработки ферментных электродов используют оксидазы или дегидрогеназы, катализирующие превращение субстрата с потреблением молекулярного кислорода и образованием пероксида водорода. Ниже в качестве примера приведена схема реакции окисления глюкозы молекулярным кислородом, катализируемой глюкозооксидазой (ГО): D-глюкоза + О2 D-глюконовая кислота + Н2О2 Подобные окислительно-восстановительные реакции можно контролировать, регистрируя в качестве сигнала ток восстановления молекулярного кислорода или окисления пероксида водорода при контролируемом потенциале. В условиях избытка фермента этот сигнал оказывается пропорционален содержанию определяемого субстрата в растворе. Удачное сочетание высокой специфичности ферментов и простоты электрохимического детектирования их активности способствовало развитию ферментных электродов. Рассмотренные выше биосенсоры, использующие природную каталитическую реакцию для генерирования электрохимического сигнала, относят к так называемому первому поколению ферментных электродов. При практическом применении этих биосенсоров могут возникать проблемы, связанные с мешающим влиянием низкомолекулярных компонентов биологических жидкостей на детектирование кислорода или пероксида водорода, а также зависимости ферментативной активности от концентрации растворенного кислорода (Тернер и др., 1992; Wang, 2000b). Для решения этих проблем были использованы медиаторы -низкомолекулярные соединения, осуществляющие перенос электронов между электродом и веществом.
В реакциях, катализируемых оксидазами, медиатор выступает в качестве акцептора электронов, конкурируя с молекулярным кислородом за связывание с активным центром фермента. Ниже представлена схема глюкозооксидазной реакции с участием медиатора: D-глюкоза + ГО(ФАД) ГО(ФАДН2) + 2М(0Х 2M(red) D-глюконовая кислота + ГО(ФАДН2) ГО(ФАД) + 2M(red) + 2Н+ 2М(0Х) + 2е_ В начале цикла медиатор окисляется на электроде. Далее окисленный медиатор регенерируется, принимая электроны от фермент-субстратного комплекса, и снова претерпевает окисление. Благодаря "работе" искусственных медиаторов ферментативная реакция становится нечувствительной к колебаниям кислорода в растворе. Кроме того, детектирование этой реакции проводят при более низких потенциалах (потенциалах медиаторной редокс-пары), что способствует уменьшению мешающего влияния электроактивных компонентов биологического образца. Биосенсоры, использующие медиаторы, относят ко второму поколению ферментных электродов. Эти биосенсоры по сравнению с ферментными электродами первого поколения отличаются улучшенными операционными характеристиками. Чтобы избежать необходимости введения медиатора в электролит, его можно предварительно иммобилизовать на электроде. При разработке ферментных биосенсоров наибольшую популярность получили такие медиаторы, как производные ферроцена, феррицианид и органические соли (тетратиафулвален, тетрацианохинодиметан и др.) (Тернер и др., 1992; Wang, 2000b). В описанном выше типе биосенсоров медиатор, растворенный в электролите или иммобилизованный на электроде, служит переносчиком электронов между ферментом и электродом. Теоретически возможно осуществить "прямой электрический контакт" между электродом и активным центром фермента без использования медиаторной реакции. Такой контакт (англ. enzyme-wiring) реализован в ферментных биосенсорах третьего поколения (Тернер и др., 1992; Wang, 2000b). В обычных условиях электрический контакт активного центра фермента с электродом затруднен вследствие изолирующего влияния апофермента. Кроме того, адсорбция белковых молекул на металлических и углеродных электродах часто приводит к их денатурации и полной или частичной потере биологической активности (Park et., 2001). Формирование подходящего микроокружения для иммобилизованного фермента позволяет преодолеть эту проблему. Как продемонстрировано в работах (Park et., 2001; Chen et al., 2000; Lu et al., 2005), включение фермента в состав липидных мембран или мембран на основе биополимеров, наносимых на поверхность электрода, позволяет сохранить нативные свойства фермента и создать условия для прямого переноса электронов. Наряду с биомембранами, большие перспективы в решении этой проблемы имеют наноструктурированные материалы, среди которых можно выделить проводящие полимеры (Killard, 1999; Kong et al., 2003), наночастицы металлов (Xu et al., 2003; Wang and Wang, 2004) и углеродные нанотрубки (Zhao et al., 2002; Zhao et al., 2005a).
Модификация электродов углеродными нанотрубками
Углеродные нанотрубки (УНТ) подвергали ультразвуковому диспергированию в смеси концентрированных серной и азотной кислот (3:1 по объему) и далее осаждали центрифугированием. Осадок УНТ суспендировали в небольшом объеме бидистиллированной воды. Концентрацию УНТ оценивали спектрофотометрически по поглощению при 260 нм и выражали в единицах оптической плотности (опт. ед.). Стеклоуглеродные электроды (СУЭ) перед использованием полировали порошком оксида алюминия, промывали ацетоном и ополаскивали дистиллированной водой. Для модификации на рабочую поверхность СУЭ наносили 2 мкл суспензии УНТ с оптической плотностью 10-140 опт. ед. и медленно высушивали на воздухе. 2.3. Электрохимические измерения В качестве фоновых электролитов использовали 0.01 М ацетатный или 0.01 М фосфатный буферные растворы с различными значениями рН, содержащие 0.1 М хлорид натрия. Трехэлектродная ячейка объемом 10 мл состояла из рабочего СУЭ (диаметр 1.5 мм) или СУЭ, модифицированного УНТ, хлоридсеребряного электрода сравнения (Ag AgCl); противо-электродом служила никелевая пластина. Вольтамперометрические измерения проводили в режиме линейного сканирования потенциала. СУЭ, модифицированные УНТ (СУЭ-УНТ), отмывали в буферном растворе при перемешивании и далее записывали вольтамперограммы до получения воспроизводимых фоновых кривых. Емкость (С) и сопротивление (R) электродов регистрировали с помощью моста переменного тока при переменном напряжении амплитудой 10 мВ и частотой от 0.11 до 30 KHZ. Измерения проводили при установившемся значении электродного потенциала, полагая, что в этом случае электрод находится в квазиравновесных условиях. Значения С и R пересчитывали на параллельную схему замещения, включающую сопротивление электролита (Rco), емкость двойного слоя (СдС) и соединенный параллельно с ней электрохимический импеданс (Дамаскин, 1965). Величины Rco и Сдс, измеренные при 30 KHZ, использовали для характеристики чистых СУЭ и СУЭ-УНТ. 2.4. Детектирование биомолекул на модифицированных электродах Концентрацию азотистых оснований, нуклеотидов и ДНК вычисляли спектрофотометрически (Досон и др., 1991). Для денатурации ДНК раствор прогревали при 100С в течение 10-15 минут и быстро охлаждали на ледяной бане. Азотистые основания, нуклеотиды и ДНК аккумулировали на СУЭ-УНТ, помещая 5 мкл раствора вещества на поверхность электрода. Через несколько минут электроды отмывали в перемешиваемом буферном растворе и регистрировали линейные или циклические вольтамперограммы в отсутствии электроактивных компонентов в электролите. Для изучения электрохимического поведения полинуклеотидов на СУЭ-УНТ использовали растворы нативной и денатурированной ДНК из эритроцитов цыплят и тимуса теленка с концентрацией 1.0 мг/мл. ДНК наносили на СУЭ-УНТ посредством инкубации электрода в растворе ДНК (адсорбция) или высушивания 2 мкл раствора ДНК на электроде (иммобилизация), после чего СУЭ-УНТ промывали в буферном растворе при перемешивании. Регистрируемым сигналом служил ток окисления вещества на СУЭ-УНТ.
Для статистического представления результатов использовали среднее арифметическое значение и стандартное отклонение. Достоверность различий между выборочными группами оценивали с помощью -критерия Стьюдента (Лакин, 1990). 2.5. Термическая обработка ДНК ДНК растворяли в дистиллированной воде, 0.01 М ацетате натрия (рН 4.5), 0.01 М трис-HCl (рН 7.5) или 0.01 М дигидрофосфате натрия + 0.1 М хлориде натрия (рН 7.5). Растворы ДНК инкубировали на кипящей бане 5, 15 или 30 мин. и далее быстро охлаждали на ледяной бане или медленно при комнатной температуре. Продукты термической обработки ДНК адсорбировали на СУЭ-УНТ и детектировали вольтамперометрически. Диализ растворов ДНК проводили против бидистиллированной воды при 4С в течение ночи. Для фрагментации нативной и денатурированной ДНК из тимуса теленка использовали механические способы. Мягкое разрушение осуществляли многократным пипетированием раствора ДНК шприцем с тонкой иглой. Для генерации значительных разрушений в ДНК ее раствор подвергали действию ультразвука частотой 22 kHz на ледяной бане. 2.7. Обработка ДНК активными формами кислорода Активные формы кислорода (АФК) генерировали в 0.01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН 6.5), содержащем сульфат железа (II), ЭДТА и пероксид водорода до конечных концентраций 20 мкМ, 40 мкМ и 100 мкМ соответственно (концентрации компонентов подобраны экспериментально). Реактив предварительно выдерживали 15 мин. при комнатной температуре. ДНК-сенсоры готовили, высушивая 2 мкл раствора нативной ДНК на рабочей поверхности СУЭ-УНТ, с последующей промывкой электродов в перемешиваемом буферном растворе. ДНК-сенсор инкубировали с 10 мкл раствора АФК в течение 10 мин., ополаскивали водой и далее регистрировали анодные вольтамперограммы. В двух контрольных экспериментах СУЭ-УНТ выдерживали с раствором АФК в отсутствии ДНК или инкубировали ДНК-сенсор с реактивом, не содержащем пероксид водорода. 2.8. Электрофорез ДНК и УНТ Электрофорез проводили в горизонтальной камере в 0.7 % агарозном геле (Маниатис и др., 1984). В качестве электролита использовали трисборатный буферный раствор (ТБЭ), содержащий 0.1 М трис, 0.1 М борную кислоту и 0.002 М ЭДТА (рН 8.0-8.2). Нативную или денатурированную ДНК эритроцитов цыплят (100 мкг/мл) инкубировали с УНТ при комнатной температуре 30 мин. в 0.02 М фосфатном (рН 7.5) или 0.02 М ацетатном (рН 5.0) буферных растворах. В лунки геля вносили по 10 мкл исследуемых растворов с добавлением лидирующего красителя бромфенолового синего (0.25 % в 50 % растворе глицерина). Разделение проб осуществляли при напряжении 5-10 В / см (геля) в течение 60-120 мин. Для окрашивания ДНК гель выдерживали в растворе бромида этидия (20 мкг/мл) 10 мин., промывали в дистиллированной воде и далее регистрировали флуоресценцию красителя в УФ свете. УНТ были видны в геле при дневном свете без дополнительного окрашивания. 2.9. Атомно-силовая микроскопия Топографию модифицирующих слоев УНТ и полированного стеклоуглерода исследовали в полуконтактном режиме на воздухе при комнатной температуре, используя сканер 50 мкм и стандартные кремниевые кантилеверы. Разрешение полученных изображений составляло 1024x1024 точек.
Электрохимические свойства компонентов нуклеиновых кислот на СУЭ-УНТ
Электрохимическое поведение азотистых оснований и их производных служит моделью, предсказывающей поведение ДНК на электроде. В связи с этим представляло интерес исследовать электрохимические реакции с участием низкомолекулярных компонентов нуклеиновых кислот на разработанных электродах. Электрохимическое поведение ДНК на СУЭ-УНТ было оценено в анодной области потенциалов по реакциям пуриновых оснований и их производных, выбранных в качестве наиболее легко окисляющихся компонентов нуклеиновых кислот. Структурные формулы исследуемых соединений изображены на рис.11. Анодные вольтамперограммы гуанина и дезоксигуанозинмонофосфата (дГМФ) на СУЭ-УНТ содержат четко выраженные пики окисления, обозначенные как Gi и dG (рис. 12А). Потенциалы пиков Gi и dGi при рН 5.0 составляют соответственно +800 и +1010 мВ отн. Ag/AgCl. Повышение потенциала окисления для дГМФ по сравнению с гуанином более чем на 200 мВ обусловлено индуктивным влиянием N-гликозидной связи, затрудняющей отрыв электронов от азотистого основания (Oliveira-Brett et al., 2004). Окисление гуанозина и гуанозинтрифосфата (ГТФ) происходит при потенциалах, близких к потенциалу пика дГМФ (рис.12Б). Это наблюдение свидетельствует о том, что рибозильный и дезоксирибозильный остатки оказывают сходное влияние на электрохимическое поведение азотистых оснований. Присутствие остатков о-фосфорной кислоты тоже не приводит к сдвигу потенциала окисления нуклеотида (ГТФ) по сравнению с нуклеозидом (гуанозином). На вольтамперограммах ГТФ, гуанозина и дГМФ помимо главного пика окисления вещества обнаруживался меньший по размерам пик при потенциале около +800 мВ (рис.12). Известно, что препараты исследуемых соединений, как правило, содержат примесь гуанина в количестве, достаточном для его выявления (Dryhurst, 1971; Oliveira Brett and Matysik, 1997). Наблюдаемый нами пик, очевидно, тоже соответствует гуанину, высвобождаемому при гидролизе нуклеозида (нуклеотида), поскольку другие продукты гидролиза(производные рибозы) не проявляют электрохимической активности в этих условиях (Oliveira-Brett et al., 2004). Пик окисления аденина на СУЭ-УНТ наблюдается при потенциалах около + 1 В (рис.12Б).
Принимая во внимание данные из литературы (Dryhurst, 1972; Oliveira-Brett et al., 2002a; Goyal and Sangal, 2003; Oliveira-Brett et al., 2004), а также полученные нами результаты (рис.12А), можно предположить, что окисление адениновых нуклеотидов будет протекать при более высоких потенциалах по сравнению с аденином. Однако анодные вольтамперограммы аденозинтрифосфата или аденозинмонофосфата на СУЭ-УНТ не содержали пиков окисления вещества. По-видимому, детектированию адениновых нуклеотидов препятствует резкое увеличение фонового тока модифицированного электрода при потенциалах более + 1 В, обусловленное разрядом ионов электролита. Поскольку пиримидиновые нуклеотиды имеют еще более высокие потенциалы окисления (Oliveira-Brett et al., 2004), регистрация токов в этих условиях тоже оказывается невозможной. Вольтамперные кривые соединений I-V (рис.11), полученные при низкой скорости развертки потенциала, имеют форму почти симметричных пиков (рис.12), что характерно для редокс-процессов с участием сильно адсорбированного вещества (Laviron, 1979a,b; Laviron and Roullier, 1980). Изучение зависимости тока окисления от времени инкубации СУЭ-УНТ в растворах, содержащих гуанин, дГМФ или аденин, показало, что насыщение поверхности модифицированного электрода веществом происходит уже в течение 60 с. инкубации. Дальнейшее увеличение времени инкубации СУЭ-УНТ в растворе вещества не приводило к повышению регистрируемого сигнала. Промывка электродов в буферных растворах не сопровождалась уменьшением сигнала, что указывает на стабильное удерживание азотистых оснований и их производных на СУЭ-УНТ. Электрохимические свойства гуанина, дГМФ и аденина на чистом СУЭ отличались от поведения этих соединений на СУЭ-УНТ. На анодных вольтамперограммах исследуемых веществ, адсорбированных на чистых СУЭ, появлялись едва заметные волны окисления. Потенциалы этих волн смещены почти на 100 мВ в область положительных потенциалов по сравнению с потенциалами соответствующих пиков, регистрируемых при окислении пуринов на СУЭ-УНТ (рис.12).
Выявляемые особенности электрохимического поведения исследуемых пуринов на СУЭ, по-видимому, являются следствием слабой адсорбции этих соединений на стеклоуглероде. Это подтверждает, что удерживание азотистых оснований и нуклеотидов на СУЭ-УНТ происходит в результате их связывания с модифицирующим слоем УНТ. Установлено, что после выдерживания СУЭ-УНТ в растворе с различным содержанием гуанина или дГМФ предельный ток окисления вещества возрастает с увеличением его концентрации (рис.13). В случае гуанина сигнал достигал максимума приблизительно для 0.1 мМ концентрации вещества (рис.1 ЗА), тогда как для дГМФ насыщающие концентрации были заметно выше (около 1 мМ) (рис.ІЗБ). По-видимому, это обусловлено более эффективной адсорбцией азотистого основания на модифицированном электроде по сравнению с нуклеотидом. Как показано на рис.13, величина тока окисления гуанина, регистрируемого для насыщающих концентраций вещества, более чем в два раза превышает максимальные значения тока для дГМФ. Вероятно, это является следствием особенностей строения исследуемых пуринов, а именно, меньшим размером молекулы азотистого основания по сравнению с нуклеотидом. Поэтому поверхностная концентрация адсорбированного на СУЭ-УНТ гуанина, и, как следствие, ток его окисления, оказываются выше, чем в случае дГМФ. Кроме того, негативное влияние на чувствительность детектирования дГМФ может оказывать высокий фоновый ток на СУЭ-УНТ при потенциалах более +1 В. Наличие сильной адсорбции азотистых оснований и их производных на СУЭ-УНТ означает, что эти соединения при их одновременном присутствии в растворе могут конкурировать за связывание с поверхностью модифицированного электрода. Установлено, что в результате совместной адсорбции гуанина и аденина на СУЭ-УНТ в условиях насыщающих концентраций наблюдается уменьшение пиков окисления этих веществ (рис.14). Сходные изменения зафиксированы после совместной адсорбции гуанина и дГМФ на поверхности модифицированного электрода. Полученные результаты подтверждают конкурентный характер адсорбции азотистых оснований и их производных на СУЭ-УНТ. Это допускает возможность совместного определения гуанина и аденина или гуанина и дГМФ на СУЭ-УНТ. Поскольку аденин и гуаниновые нуклеотиды характеризуются близкими потенциалами окисления, их одновременное детектирование на СУЭ-УНТ затруднительно. 3.2.2. Механизм электрохимического окисления гуанина и дГМФ на СУЭ-УНТ Поскольку гуанин и его производные являются наиболее легко окисляемыми компонентами нуклеиновых кислот, представляло интерес выяснить особенности электрохимических реакций гуанина и дГМФ на СУЭ-УНТ, как наиболее вероятных электроактивных центров в ДНК. Линейное сканирование потенциала при скорости 100 мВ с"1, повторяемое в интервале от +100 до +1300 мВ, выявило, что адсорбированный гуанин почти полностью окисляется уже при первом сканировании. При втором сканировании зафиксировано образование нового пика (пик Gn) при потенциале около +460 мВ (рис.15). Наблюдаемый пик, вероятно, соответствует продукту двухэлектронного окисления гуанина - 8-оксогуанину, обнаруживаемому в этой области потенциалов на пирографитовых и стеклоуглеродных электродах (Dryhurst and Расе, 1970; Subramanian and Dryhurst, 1987; Oliveira-Brett et al., 2000; Oliveira-Brett et al, 2002b).
Влияние фрагментации ДНК на ее электрохимическое поведение на СУЭ-УНТ
Для разрушения ДНК использовали механические способы, такие как пипетирование шприцем и ультразвуковая (УЗ) обработка. Величины пика окисления гуаниновых нуклеотидов нДНК и дДНК на СУЭ-УНТ до и после разрушения биополимеров приведены на рис.25. Степень фрагментации биополимеров оценивали электрофоретически в агарозном геле (рис.26). Влияние используемых способов разрушения ДНК на ток ее окисления было различным. Пипетирование раствора ДНК не приводило к изменению сигнала как для нДНК, так и для дДНК (рис.25). Электрофоретические эксперименты показали (рис.26), что подобная обработка не сопровождается существенным уменьшением молекулярной массы ДНК. В частности, в результате пипетирования нДНК наблюдалось уменьшение количества высокомолекулярной ДНК, задерживающейся в лунках, наряду с некоторым увеличением подвижности основной фракции ДНК (рис.26, дорожка 3). Пипетирование дДНК не приводило к заметному уменьшению ее молекулярной массы (дорожка 6) по сравнению с контрольной пробой (дорожка 5). Пробы нДНК и дДНК, подвергнутые действию УЗ, мигрируют на значительное расстояние от старта, что свидетельствует о существенном уменьшении длины биополимеров (рис.26, дорожки 4 и 7 соответственно). При этом наблюдалось заметное увеличение тока окисления обработанных образцов нДНК и дДНК на СУЭ-УНТ по сравнению с контрольными пробами (рис.25). Относительное увеличение сигнала после обработки ДНК ультразвуком в случае нДНК было почти в 2 раза больше, чем для дДНК (рис.25). Вероятно, это связано с частичной денатурацией биополимера под действием УЗ. Полученные результаты подтверждают, что пространственная протяженность молекул ДНК оказывает влияние на ее электрохимическое поведение на СУЭ-УНТ. Появление на анодных вольтамперограммах ДНК пика гуанина (рис.22) указывает на то, что исследуемые препараты ДНК содержат примесь этого азотистого основания в мономерной форме. После диализа растворов ДНК пик окисления гуанина (пик I) исчезал на вольтамперограмме при почти неизменном пике ДНК (пик II). Это подтверждает, что пик I соответствует свободному гуанину, не связанному с сахарофосфатным остовом ДНК. Обнаружено, что содержание гуанина в растворе ДНК увеличивается после термической денатурации биополимера (рис.22Б). Это означает, что термическая обработка ДНК сопровождается ее депуринизацией.
Выяснено, что при инкубации СУЭ-УНТ в растворах с различным содержанием гуанина величина пика I линейно возрастает с увеличением концентрации вещества в интервале приблизительно от 1.9x10" до 3.6x10"5 М; уравнение линейной зависимости имеет вид: Y (Ю-6 А) = (0.63 ± 0.12) + (0.33 ± 0.02) X (10"6М) г = 0.9938 Линейная зависимость тока окисления гуанина, адсорбируемого на СУЭ-УНТ, от концентрации вещества, а также установленный выше конкурентный характер адсорбции низкомолекулярных компонентов ДНК на СУЭ-УНТ ( 3.2.1), допускают возможность применения разработанных электродов для количественного детектирования гуанина, высвобождаемого при депуринизации, в присутствии ДНК. Для проверки этой возможности исследовано влияние различных условий на депуринизацию ДНК при повышенных температурах (табл.2). Для этих целей использовали ДНК(тт), поскольку прогретые растворы этого биополимера содержали большее количество гуанина, чем растворы денатурированной ДНК(эц) (рис.22). Пробы ДНК инкубировали при 100С установленное время в растворах различного состава. После инкубации все растворы, кроме пробы 5, подвергали быстрому охлаждению (денатурации) на ледяной бане; пробу 5 охлаждали при комнатной температуре (без денатурации). Продукты инкубации адсорбировали на СУЭ-УНТ и регистрировали пики гуанина (пик I) и гуаниновых нуклеотидов (пик II) (табл.2). Прогревание раствора ДНК в дистиллированной воде сопровождалось значительным увеличением регистрируемых пиков (табл.2, пробы 2-5) по сравнению с контрольным раствором ДНК, не подвергнутым термической обработке (проба 1). Пик I увеличивался пропорционально времени инкубации в интервале 5-30 мин. (табл.2, пробы 2-4), что подтверждает зависимость депуринизации ДНК от температуры. По сравнению с пиком I, величина пика II в меньшей степени зависела от времени прогревания. К 30 мин. инкубации регистрируемые пики становятся почти равными по величине (проба 4). Для раствора ДНК в 0.01 М натрий-ацетатном буфере (рН 4.5) величина пика I была существенно выше, чем для остальных проб, что свидетельствует о высокой скорости депуринизации в этих условиях (проба 6). Содержание свободного гуанина уменьшалось при использовании 0.01 М трис-НС1-буфера, рН 7.5 (табл.2, проба 7) и достигало минимального значения в пробе с 0.1 М хлоридом натрия (проба 8). В пробе 8 количество гуанина в мономерной форме было соизмеримо с его уровнем в растворе нативной ДНК (проба 1). Результаты вольтамперометрического изучения депуринизации ДНК на СУЭ-УНТ согласуются с литературными данными о кислотном механизме гидролиза iV-гликозидной связи и замедлении этого процесса с увеличением ионной силы раствора (Greer and Zamenhof, 1962; Lindahl and Nyberg, 1972; Lindahl, 1993).
Это подтверждает, что разработанные электроды можно применять для количественного детектирования депуринизации ДНК. 3.3.5. Влияние гидроксил-радикалов на электрохимическое окисление ДНК Наряду с депуринизацией, одним из важнейших процессов, приводящих к повреждениям ДНК in vivo, является окислительная модификация ДНК активными формами кислорода (АФК) (Kawanishi et al., 2001). В связи с этим представляло интерес разработать биосенсор на основе СУЭ-УНТ для оценки повреждающего действия АФК на ДНК. АФК генерировали по реакции Фентона, основанной на одноэлектронном восстановлении пероксида водорода катионами металлов переходной группы: Fe2+ + Н202 + Н+ - Fe3+ + ОН" + ЮН Образующиеся в этой реакции гидроксил-радикалы являются одними из наиболее реакционно-способных АФК, которые, как предполагается, вносят определяющий вклад в процессы эндогенного окисления биомакромолекул (Henle and Linn, 1997; Cadet et al., 1999; Mates et al., 2000). Биосенсоры готовили, иммобилизуя нДНК на поверхности СУЭ-УНТ. Анодные вольтамперограммы ДНК, нанесенной на СУЭ-УНТ, после обработки сенсоров АФК и без обработки приведены на рис.27. Установлено, что десятиминутная инкубация ДНК-сенсоров в растворе, содержащем АФК, приводит к увеличению тока при потенциалах окисления гуаниновых нуклеотидов (рис.27). Выдерживание СУЭ-УНТ с реактивом Фентона в отсутствие ДНК не сопровождалось увеличением фонового тока электрода, свидетельствуя о том, что наблюдаемое изменение сигнала обусловлено действием АФК на иммобилизованную ДНК. Влияние АФК на ток окисления гуаниновых нуклеотидов ДНК было различным для исследуемых препаратов биополимеров. При использовании ДНК(эц) сигнал, регистрируемый до и после инкубации сенсора с реактивом Фентона, составлял соответственно 11.1 ± 0.7 и 18.1 ± 3.1 мкА (рис.27А), тогда как в случае ДНК(тт) эти значения равны 10.7 ± 2 и 42.1 ± 5.3 мкА (рис.27Б). Формы вольтамперных кривых ДНК(эц) и ДНК(тт), обработанных реактивом Фентона, тоже существенно различались между собой. Анодная кривая обработанной ДНК(тт) имеет вид широкой нарастающей волны при потенциалах более +700 мВ (рис.27Б), в то время как вольтамперограмма ДНК(эц) после действия АФК сохраняет форму пика (рис.27А). Проведенное исследование показало, что АФК оказывают выраженное влияние на электрохимическое окисление нативной ДНК, иммобилизованной на СУЭ-УНТ, и степень этого влияния может различаться для ДНК из разных источников. 3.3.6. Обсуждение результатов Согласно данным литературы, линейная ВА малопригодна для детектирования ДНК на углеродных электродах, поскольку с использованием этого метода регистрируют плохо выраженные анодные кривые ДНК, количественная обработка которых затруднена (Brabec and Koudelka, 1980; Pedano and Rivas, 2003).
