Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 . Солевой стресс и засоление, воздействие на растения 8
1.1.1. Засоление как фактор среды 8
1.1.2. Механизм действия солей на растения и адаптация 9
1.2.Воздействие солевого стресса и засоления на растения 11
1.2.1. Влияние солей на рост и морфологию растений 11
1.2.2. Влияние солей на мезоструктуру тканей и органов растений 12
1.2.3. Влияние солей на ультраструктуру клеток растений 14
1.2.4. Влияние стрессовых факторов на структуру и функции цитоскелета 15
1.2.5. Влияние стрессовых факторов на клеточный цикл меристемы растений 18
1.2.6. Влияние солей на физиологические параметры 20
1.2.7. Влияние солей на биохимические процессы 22
1.2.8. Влияние солей на транспорт и накопление ионов 24
1.2.9. Роль осмотически активных веществ в формировании солеустойчивости 28
1.2.10. Роль белков в формировании солеустойчивости 31
1.3.Способы повышения солеустойчивости растений 35
1.3.1. Традиционные методы [ 35
1.3.2. Современные биотехнологические методы и генетическая инженерия 36
1.4.Методы оценки соле- и стрессоустойчивое растений 39
1.4.1. Традиционные методы 39
1.4.2. Другие методы оценки устойчивости 40
1.5.Мобилизация запасных веществ, влияние стрессовых факторов 43
1.5.1. Мобилизация запасных веществ при прорастании 43
1.5.2. Запасные белки 49
1.5.3. Запасные полисахариды 51
1.5.4. Запасные липиды 53
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 56
2.1. Схема постановки эксперимента 56
2.2. Фиксация и подготовка препаратов для ультраструктурного анализа_58
2.3. Приготовление пленок - подложек 59
2.4. Микротомия препаратов для ультраструктурного анализа 59
2.5. Выявление тубулнновых компонентов цитоскелета (микротрубочек) клеток корня. 60
2.6. Определение пигментов 61
2.7. Определение пролина 61
2.8. Статистическая обработка 62
РЕЗУЛЬТАТЫ 63
3.1. Биометрические показатели контрольных растений и растений, развивающихся в условиях осмотического стресса 63
3.1.1. Всхожесть семян 63
3.1.2. Динамика роста корня 64
3.1.3. Динамика изменения сырой биомассы 65
3.1.4. Содержание пролина 66
3.1.5. Содержание пигментов в надземных органах проростков 67
3.1.5.1. Содержание хлорофилла ; 67
3.1.5.2. Содержание каратиноидов 67
3.1.6. Жизнеспособность проростков после развития в условиях осмотического стресса 68
3.2. Сравнительный анализ структурной организации основных внутриклеточных компартментов контрольных растений и растений, развивающихся в условиях осмотического стресса 69
3.2.1. Цитоскелет 69
3.2.1.1. Интерфазный цитоскелет 69
3.2.1.2. Цитоскелет при подготовке клеток к делению (С2-фаза, профаза) 70
3.2.1.3. Прометафаза : 71
3.2.1.4. Метафаза 72
3.2.1.5. Телофаза 72
3.2.2. Ультраструктура интерфазных ядер 84
3.2.3. Динамика утилизации крахмальных зерен в пластидах клеток корневой меристемы и семядолей . 90
3.2.3.1. Клетки мезофилла семядолей 90
3.2.3.2. Клетки меристемы корней 91
3.2.4 . Динамика утилизации белковых тел и организация вакуолей в клетках
корней и семядолей, 95
3.2.4.1. Клетки мезофилла семядолей 95
3.2.4.2. Клетки корня 96
3.2.5. Динамика утилизации олеосом в клетках корней и семядолей 99
3.2.5.1. Клетки мезофилла семядолей 99
3.2.5.2. Клетки меристемы корня 100
3.3. Сравнительный анализ анатомического строения семядольных листьев люцерны
сорта Надежда и устойчивого к засолению NaCl Клона 124 103
3.3.1. Сорт Надежда 104
3.3.2. Клон 124 107
ОБСУЖДЕНИЕ ПО
4.1. Эффекты NaCl, ШгБСч и маннитола на биометрические и физиологические параметры проростков при прорастании в различных изоосмотических концентрациях.
4.2. Эффекты NaCl, Na2SC>4 и маннитола на структуру тубулинового цитоскелета (микротрубочек) на разных фазах клеточного цикла в клетках меристематической зоны корня при прорастании семян люцерны в различных изоосмотических концентрациях 114
4.3. Эффекты NaCl, Na2S04 и маннитола на ультраструктурную организацию ядрышка клеток меристематической зоны корня при прорастании семян люцерны в различных изоосмотических концентрациях 117
4.4. Эффекты NaCl, Na2SC>4 и маннитола на утилизацию крахмала в клетках- мезофилла семядолей и меристематической зоны корня проростков люцерны при прорастании в различных изоосмотических концентрациях 120
4.5. Эффекты NaCl, Na2S04 и маннитола на утилизацию запасных липидов в клетках мезофилла семядолей и меристематической зоны корня проростков люцерны при прорастании в различных изоосмотических концентрациях 125
4.6. Эффекты NaCl, Na2SC>4 и маннитола на утилизацию запасных белков в клетках мезофилла семядолей и меристематической зоны корня проростков люцерны при прорастании в различных изоосмотических концентрациях 127
4.7. Сравнение анатомической структуры семядольных листьев Клона 124 и сорта Надежда при прорастании в различных изоосмотических концентрациях NaCl и маннитола : 128
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 130
ВЫВОДЫ 133
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 135
- Солевой стресс и засоление, воздействие на растения
- Схема постановки эксперимента
- Биометрические показатели контрольных растений и растений, развивающихся в условиях осмотического стресса
- Эффекты NaCl, ШгБСч и маннитола на биометрические и физиологические параметры проростков при прорастании в различных изоосмотических концентрациях.
Введение к работе
Известно, что различные абиотические факторы, такие как почвенное засоление, недостаток влаги (засуха), экстремальные температуры и гипоксия, являются основными причинами снижения продуктивности сельскохозяйственных растений. По прогнозам FAO [2005], к 2050 году засуха и засоление почв могут привести к значительному ухудшению качества более чем 50% возделываемых земель во многих регионах мира.
Особую опасность для эффективного земледелия представляет повышенное содержание в почве неорганических ионов, так как их избыток оказывает сильное ингибирующее воздействие на рост и урожайность культурных растений. Именно по этой причине выведение солеустойчивых форм до настоящего времени является одной из приоритетных задач селекционной работы. Тем не менее, успехи в этой области нельзя считать значительными. Проведенное в начале 90-х годов обобщение данных о внедренных в практику солеустойчивых сортах, показало, что их количество составляет менее 30 [Flowers and Yeo, 1995]. С 1993 по 2000 г в журнале Crop Science были зарегистрированы только три новых солеустойчивых сорта [Flowers, 2004]. Это означает, что «классическая» селекция давно столкнулась с проблемой отсутствия в имеющемся наследственном фонде старых сортов - доноров признаков устойчивости к засолению. Привнесение в культурные разновидности таких свойств из отдаленных сородичей занимает несколько лет работы и зачастую упирается в ограничения, накладываемые барьером несовместимости при скрещиваниях.
Существенный прорыв в решении проблемы повышения солеустойчивости сельскохозяйственных культур наметился после внедрения в селекционную практику биотехнологических приемов. До настоящего времени биотехнологии в этой области базировались на различных методах клеточной селекции, однако в последние 10 лет почти полностью переключились на современные методы генной инженерии, с использованием генетических систем, контролирующих биосинтез осмолитов, ионный гомеостаз и детоксикацию. К белкам, которые кодируются перечисленными генами, относятся транскрипционные факторы [Winikov, 2000]; ферменты, отвечающие за синтез осмопротекторов [Mohanty et al., 2002]; мембранные белки-переносчики ионов [Apse et al., 1999], белки-шапероны [Sugino et al., 1999] и многие другие. Большая работа проводится по выявлению в растениях, устойчивых к засолению, новых генов, ответственных за синтез белков, связанных с солеустойчивостью. Так, в России клонированы гены, Н+пирофосфотазы [Дьякова и др., 2005], у-глутамилкиназы и глутамил-у-семиальдегид-дегидрогеназы [Сохансандж и др., 1998] и Ка+/Н+антипортеров [Бабаков А.В.].
Необходимо учитывать, что создание генетических конструкций для последующей трансформации нужных культур является только первым этапом в длительном процессе выведения нового сорта. Одним из лимитирующих факторов на этом пути является время, необходимое для выращивания нескольких поколений трансформированных растений и испытания их устойчивости в полевых условиях. Как это не парадоксально, но до настоящего времени не предложены методы, позволяющие уже на ранних этапах развития отбирать потенциально устойчивые к засолению экземпляры для их дальнейшего выращивания [Flowers, 2004]. Теоретическим обоснованием возможности разработки такого рода методов служат две группы данных. Во-первых, снижение содержания воды в клетках при водном дефиците и сопутствующее увеличение концентрации ионов в цитоплазме вызывают денатурацию белков, угнетение их ферментативной активности и существенные нарушения в целостности биомембран. Во-вторых, в ответ на действие стрессовых факторов усиливается и/или подавляется экспрессия некоторых генов, что, в свою очередь, приводит к синтезу и накоплению новых белков. Очевидно, что следствием перечисленных эффектов солевого воздействия могут быть нарушения метаболизма, проявляющиеся как на уровне целого растения, так и на клеточном уровне. Действительно, по некоторым данным действие солей на растения приводит к нарушению их роста [Parida and Das, 2005] и существенно сказывается на структуре клеток и ультраструктурной организации пластид [Парамонова и др., 2004; Усатов и др., 2004].
Чрезвычайно удобной моделью для анализа клеточного ответа на разного рода воздействия являются растения, находящиеся на ювенильной стадии роста. Именно в этот период осуществляется мобилизация запасных питательных веществ, и запускаются крупные программы развития не только на уровне клеток, но и на уровне тканей и органов целого растения. Логично предположить, что проращивание в присутствии осмотически активных веществ, влияющих на метаболизм клетки, должно сказаться на динамике тех процессов, в которые вовлечены специализированные клеточные органоиды с депонированными в них белками, липидами и полисахаридами. Именно эти структурные компартменты клетки в процессе акклимации растений к стрессовым факторам могут служить надежными цитологическими маркерами их устойчивости или чувствительности к засолению. Цель работы:
Идентифицировать цитологические маркеры, позволяющие тестировать исходные и модифицированные формы растений на устойчивость к солевому и осмотическому стрессам
Задачи работы:
/. Охарактеризовать основные биометрические показатели контрольных и
экспериментальных растений на ювенильной стадии развития.
Выявить возможные нарушения цитоскелета в пролиферирующих клетках корневой меристемы, позволяющие оценить влияние солевого и осмотического воздействий на процессы деления, роста и дифференцировки клеток.
Изучить действие маннитола, NaCl и Nu2S04 на структурное состояние аппарата синтеза рибосомной РНК (ядрышка) в клетках меристемы корня.
На ультраструктурним уровне изучить динамику мобилизации запасных веществ (полисахаридов, белков и липидов), депонированных в крахмальных зернах, белковых телах и олеосомах, у контрольных растений и растений, развивающихся в присутствии маннитола, NaCl и Na2SC>4.
Охарактеризовать общие закономерности изменения анатомического строения семядольных листьев растений, подвергнутых солевому и осмотическому воздействию у сорта Надежда и полученного клеточной селекцией клона 124.
На основе полученных данных разработать метод, позволяющий на ранних этапах развития тестировать биотехнологически модифицированные растения на их устойчивость к солевому и/или осмотическому стрессу.
Солевой стресс и засоление, воздействие на растения
Высокие концентрации солей в почвенном растворе оказывают сильный ингибирующий эффект на рост и урожайность культурных растений. Хотя общее количество засоленных земель точно неизвестно, их распространённость в мире уже достаточна для того, чтобы представлять собой угрозу для сельскохозяйственного производства (Flowers and Yeo, 1995; Munns, 2002). В настоящее время в связи с получением новых данных о генетических и физиологических аспектах адаптации и солетолерантности у различных видов и успехов современной биотехнологии и генетической инженерии сформировалось несколько принципиально различных подходов к решению проблем использования засоленных почв: 1) Введение в культуру галофитов и улучшение их качеств; 2) Получение трансформированных гликофитов, устойчивых к засолению; 3) Выращивание гликофитов на подвое, обладающем некоторыми свойствами галофитов; 4) Совершенствование технологий дренирования и меллиорации. Существенные успехи сделанные в последние годы пока не вышли за рамки лабораторных исследований, так как результаты были получены большей частью на модельных растениях [Flowers, 2004]. Однако анализ экспериментов по получению новых растений выявил ряд проблем, связанных с многофакторностью устойчивости к действию засоления. В частности, большая часть растений показывает худшее прорастание и рост растений в отсутствие соли, что может привести к проблеме в промышленном семеноводстве этих культур. В связи с этим понятие стресса в отношении засоления может быть неоднозначным, так как в отличие от других негативных абиотических факторов соли часто не только и не столько стрессоры, но в большей степени постоянно действующий фактор среды, в ряде случаев переходящий в течении вегетации из роли негативной в нейтральную и даже позитивную. Особую сложность это свойство солей представляет при постановке эксперимента, так как осмотический стресс как неожиданное воздействие возникает в природе в ограниченном числе случаев, например, при цунами или сильных волнах, разливе соленых озер, переносе «соленой корки» ветром и некоторых других. Чаще встречается постепенное увеличение засоления или колебания концентраций в период вегетации. Между тем, большая часть работ воспроизводит именно солевой стресс, так как семена замачивают, а нередко и предварительно проращивают в дистилированной воде, и лишь потом помещают в солевые растворы. Кроме того, модельные эксперименты чаще всего сконцентрированы на исследовании дейстия только хлорида натрия, что не дает цельной картины действия солей на рост и развитие растений, так как состав водорастворимых солей в почвенном растворе и твердой фазе почвы может быть весьма разнообразным. В подавляющем большинстве случаев эти соли представляют собой комбинацию катионов NaT, CaZT и анионов СГ, SO4 , СОз2 , и НСОз". Наиболее распространенными солями почв являются: NaCl, Na2S04 Na2C03, MgCl2, Mg(HC03)2, СаС12, СаСОз, CaS04, Са(НСОз)2 и некоторые другие.
Механизм действия солей на растения и адаптация
Устойчивость к засолению обуславливает необходимость адаптации сразу к трем независимым стрессовым факторам: осмотическому, токсическому и оксидативному (рис. 1). Осмотический стресс приводит к нарушению гомеостаза и ионного транспорта в клетках [Serrano et al., 1999; Zhu et al., 2001]. Токсическое действие засоления обуславливается вмешательством активных ионов в метаболизм на уровне клеток и целого растения. Окислительный стресс, который часто сопровождает как солевой, так и другие стрессы (высокую температуру, воздействие засухи), может приводить к нарушению конформации и денатурации структурных и ферментативных белков [Smirnoff, 1998]. Как следствие, эти различные абиотические воздействия часто активируют сходные сигнальные пути [Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1997; Zhu, 2001, 2002] и клеточные ответы, такие как синтез стрессовых белков, антиоксидантов и накопление совместимых осмолитиков [Zhu et. al., 1997; Cushman and Bohnert, 2000]. Это обстоятельство позволяет использовать гены, кодирующие защитные молекулы «родственных» абиотических стрессов и/или их ферменты в генно-инженерной практике.
Три основные группы белков, кодируются генами, контролирующими устойчивость к стрессам.
1) Белки, участвующие в каскадах передачи сигнала и в транскрипционном контроле -MYC, MAP киназы и SOS киназа [Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1997; Munnik et al., 1999; Zhu, 2001) и транскрипционные факторы - представители семейств CBF/DREB и ABF/ABAE [Stockinger et al., 1997; Choi et al, 2000; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1997].
2) Белки, непосредственно вовлеченные в защиту мембран, белки теплового шока (Hsps), шапероны и белки, обильно появляющиеся при позднем эмбриогенезе (LEA) [Vierling, 1991; Ingram and Battels, 1996] осмопротектанты и нейтрализаторы свободных радикалов [Bohnert and Sheveleva, 1998].
3) Белки, участвующие в поглощении и транспорте воды и ионов - аквапорины и ионные транспортеры [Serrano et al., 1999; Tyerman et al., 1999; Zimmermann and Sentenac, 1999; Blumwald, 2000].
Схема постановки эксперимента
Исследование проводили с использованием следующих сортообразцов.
Medicado sativa L., 2n=32
Систематическое положение.
Семейство Leguminosae Endl., род Medicago L., подрод Falcago (Reichb.) Grossh.
Синонимы.
Medicago varia Mart., Medicago media Pers.
Биология и морфология.
Многолетнее травянистое растение. Корневище обычно толстое, уходящее в почву на глубину до 4 метров. Стебли прямостоячие, четырехгранные, голые, или в верхней части волосистые, обильно ветвящиеся, от 40 до 90 см высотой. Прилистники до 1/3-1/2 сросшиеся, в свободной части треугольно-ланцетные, при основании цельные или чаще с одним-двумя зубцами. Листья очередные, тройчатые, листовые пластинки 15-30 мм длиной и 3-10 мм шириной, продолговато-яйцевидные или линейные, зубчатые в верхней трети, на верхушке чаще выемчатые, с более длинным зубцом в центре выемки, сверху темно-зеленые, снизу - светлые. Соцветие - компактная кисть 10-25 мм, состоящая из 5-30 цветков. Венчик 6-15 мм длиной, от бледно-желтого до голубого и черно-фиолетового цвета, чашечка трубчато-ворончатая с линейно-шиловидными зубцами. Боб спирально-закрученный в 2-4 не тесно сомкнутых оборота, 3-9 мм в диаметре с вьщающейся сетью жилок, голый или прижато пушистый. Семена неправильно сердцевидные, каштанового цвета, 3-5 семян в бобе. Часть семян отличается твердосемянностью. Перекрестно опыляемое. Цветение - май-июль, созревание бобов - июль-сентябрь. 2n = 16, 32.
Распространение.
Европейская часть бывшего СССР, Крым, Кавказ, Западная Сибирь, Казахстан, Средняя Азия.
Экология.
Произрастает на лугах, травянистых склонах, на осыпях, по опушкам, среди кустарников, а также на заброшенных землях, пустырях, как сорное и одичавшее; от равнины до среднего пояса гор.
Хозяйственное значение.
Введено в культуру как наиболее урожайное бобовое кормовое растение. Характеризуется высокой экологической пластичностью. Отзывчиво на орошение и плодородие почв. Используется в селекционных программах как донор хозяйственно-ценных признаков (солеустойчивость, зимостойкость, семенная продуктивность и т.д.). Благодаря симбиозу с клубеньковой бактерией Sinorhizobium medicae обладает высокой азотофиксирующей способностью.
Надежда - сорт люцерны посевной (Medicado sativa L., 2п=32). Районирован в Волгоградской области и на Украине (Херсонская область). Отличается быстрым отрастанием после скашивания; при орошении обеспечивает 4-5 укосов за вегетационный период; устойчив к полеганию. Характеризуется высокой продуктивностью кормовой массы и семян, средней устойчивостью к болезням.
Клон 124 - образец люцерны посевной {Medicado sativa L., 2п=32). Получен в отделе биотехнологии и клеточной селекции ВНИИ кормов им. В.Р.Вильямса Голышкиной Н.А. методом клеточного отбора из суспензионной культуры клеток. Отличается повышенной устойчивостью к хлоридному засолению. Потомство клона от самоопыления сохраняет его устойчивость [Солодкая и др., 1985].
Семена люцерны посевной {Medicado sativa L.) проращивали (одни сутки в темноте 22 С) в стеклянных чашках Петри (по 100 шт на чашку) на двойном слое фильтровальной бумаги в водных растворах NaCl, Na2S04, маннитола (объем 5 мл) и в воде. Условия проращивания: 12-ти часовой фотопериод, при освещении 5103 Люкс от белых люминесцентных ламп, и температуре 17-18 С ночью и 20-25 С днем.
Для оценки влияния компонентов солевого стресса на проростки люцерны использовали изоосмотические соотношения солей хлорида и сульфата натрия [Методические указания, 1977 ]. Концентрации маннитола расчитывали по формуле
P=CRT; C=P/RT, где RT=243 6,002 , С(концентрация маннитола г/л)=Р/243 6,002x182,2 (182,2 - молекулярный BecD-маннита) и были подобраны по осмотическому давлению растворов (2, 4, 6, 8 атм) [Гродзинский, Гродзинский, 1964], что представлено в сводной табл.1.
Биометрические показатели контрольных растений и растений, развивающихся в условиях осмотического стресса
На первом этапе работы анализировались основные биометрические показатели, (всхожесть, динамика роста корня и изменение биомассы), характеризующие ранние этапы развития растений в контроле, на фоне засоления и осмотического стресса. Эти данные необходимы для разработки модели, позволяющей выявить цитологические мишени, чувствительные к абиотическим стрессовым факторам, а также для изучения на ультраструктурном уровне процессов утилизации запасных питательных веществ. Рисунок 1. Влияние NaCl, Na2S04 и маннитола на прорастание (всхожесть) люцерны
Из данных литературы известно, что наиболее быстрым способом оценки устойчивости к засолению является способность семян к прорастанию.
На рис. 1 приведены данные о количестве семян, проросших в обычных условиях и в присутствии различных концентраций маннитола, NaCl и ЫагвСм, выровненных по осмотическому давлению. Как видно, при концентрациях реагентов, соответствующих осмотическому давлению в 2 атм, наблюдается довольно значительная стимуляция процесса прорастания. Если в контроле проросло 75% семян, то в присутствии маннитола
, NaCl - 96% и Na2SC 4 - 82%. Полученные результаты указывают на не специфическое, позитивное действие низкого осмотического давления, которое может иметь место также для естественных условий прорастания. При увеличении концентрации реагентов до 4 атм показатели всхожести уменьшаются до 64% в присутствии маннитола, до 56% для NaCl и до 38% в присутствии NaiSCv Дальнейшее повышение концентрации реагентов приводит к значительному угнетению процесса прорастания, при этом наибольшее ингибирующим действием обладает Na2SC 4.
В целом, полученные данные показывают, что, во-первых, осмотический стресс оказывает четко тестируемое ингибирующее действие на метаболические процессы, сопряженные с прорастанием семян, и, во-вторых, позволяют говорить о выраженном токсическом эффекте анионов солей на развивающиеся проростки.
Динамика роста корня
На рис. 2 приведены данные об изменении скорости роста корней растений, выращенных в нормальных условиях и в присутствии реагентов в различных концентрациях.
В концентрации, соответствующей 2 атмосферам, наблюдается одинаковое увеличение длины корня относительно контроля, что свидетельствует о стимулирующем действии использованных реагентов на процессы деления и/или растяжения клеток.
