Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Интродукция картофеля в Европу и Россию
1.1.1. Интродукция картофеля в Европу. 10
1.1.2. Интродукция картофеля в Россию 14
1.2. Систематика картофеля 16
1.3. Основные заболевания картофеля 23
1.3.1. Рак картофеля 23
1.3.2. Вирус скручивания листьев (вирус PLRV) 24
1.3.3. Фитофтороз картофеля 25
1.3.3.1. Симптомы болезни и биология возбудителя 26
1.3.3.2. Распространение и вредоносность фитофтороза 28
1.4. Метод контроля качества. Сортовая идентификация 33
1.5. Молекулярные маркеры в генетическом анализе растений 43
1.5.1. Полиморфизм длины рестриктазных фрагментов (RFLP-маркеры) 43
1.5.2. Произвольно амплифицированная полиморфная ДНК (RAPD-маркеры) 44
1.5.3. Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов (AFLP-маркеры) 47
1.5.4. Микросателлитные маркеры 49
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 60
2.1. Реактивы и материалы 60
2.2. Приборы и методы 61
2.3. Общие методики 62
2.3.1. Выращивание растительных образцов 62
2.3.2. Выделение геномной растительной ДНК на силикагелевом сорбенте 62
2.3.3. Выделение геномной растительной ДНК 63
2.3.4. Выделение плазмидной ДНК 66
2.3.5. Полимеразная цепная реакция 67
2.3.6. Электрофорез в агарозном геле 68
2.3.7. Электрофорез в полиакриламидном геле 68
2.3.8. Визуализация ДНК в полиакриламидном геле с помощью нитрата серебра 68
2.3.9. Секвенирование ДНК-матриц по Сэнгеру 69
2.3.10. Приготовление стандартов длины 70
2.3.11. Проведение ферментативных реакций 70
2.3.12. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК 70
2.3.13. Трансформация клеток coli 71
2.3.14. Анализ клонов с помощью ПЦР-амплификации 71
2.3.15. Анализ флуоресцентно-меченных ПЦР-фрагментов 72
2.3.16. Выравнивание нуклеотидных последовательностей 72
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 73
3.1. Исследование межвидовой вариабельности представителей рода Solanum методом микросателлитного анализа 77
3.1.1. Выбор праймеров для анализа полиморфизма микросателлитных локусов картофеля и его дикорастущих сородичей 77
3.1.2. Исследование выбранных микросателлитных локусов на представителях рода Solanum 80
3.1.3. Оценка генетического полиморфизма видов Solanum 83
3.2. Исследование внутривидовой вариабельности представителей рода Solanum методом микросателлитного анализа 93
3.3. Исследование полиморфизма генома картофеля методом микросателлитного анализа 100
3.4. Контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в
гибриды 124
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 135
ВЫВОДЫ 136
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 138
- Интродукция картофеля в Европу и Россию
- Реактивы и материалы
- Исследование межвидовой вариабельности представителей рода Solanum методом микросателлитного анализа
Введение к работе
Семейство Solanaceae является одним и j самых представительных семейств двудольных расіений, ставших незаменимыми объектами в жизнедеятельности человека [Knapp S. et al, 2004]. Многие растения этого семейства являются основными овощными сельскохозяйственными культурами - картофель {Solanum tuberozwn L.), томат (Solanum lycopersicum L.), баклажан (Solanum melongena L), перец (Capsicum annuum).
В настоящее время картофель является одной из важнейших сельскохозяйственных овощных культур, возделываемых практически во всех реї ионах Российской Федерации. Разнообразие зон возделывания и направлений использования кулыуры привело к необходимости создания сортов карюфеля с различными хозяйственными и биологическими особенностями, такими, как устойчивость к болезням и вредителям, устойчивость к экстремальным условиям природной среды, высокие хозяйственные показатели и др. Современная селекция имеет существенные практические результаты, однако, требования, предъявляемые к современным сортам, постоянно возрастают в связи с периодическими вспышками болезней, посюянными зколоіическими изменениями в регионах, усиливающейся конкуренцией на рынке и т.п. Для решения этих сложных задач необходимо применять современные методы селекции, основанные на достижениях генетики и друїих смежных наук, и использовать разнообразный хорошо изученный на і енетическом уровне исходный материал для селекции.
В настоящее время в мировом сортименте карюфеля насчитывается свыше Зтыс. сортов. Практически ежегодно в России в Государственный Реестр селекционных достижений вносятся новые сорта. Для реіистрации новою сорта по ряду основных сортоотличительных морфологических признаков, отражающих степень
выраженности примаков отличимости, однородности и стабильности (Distinctness, Uniformity and Stability (DUS)) сорюв, требуются длиіельньїе полевые испытания. В настоящее время представляется перспективным применение ДИК-технолоіий, с помощью которых станег возможным решение различных задач современной селекции, таких как подбор родительских форм для скрещивания, контроль интрогрессии генетическою материала, паспортизация и сертификация сортов, создание «генетическою паспорта» сельскохомйственных растений, представляющею собой основу защиты иніеллектуальной собственности селекционеров.
Наибольшее распространение в иіучении генетическою разнообразия расіений получил подход, основанный на применении молекулярных маркеров. Использование таких молекулярных ДНК-маркеров открывает большие перспективы для легального картирования хромосом, идентификации іенов, ответственных іа хозяйственно-ценные признаки культуры, а также позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды при скрещивании. Широкое применение находят методы анализа растений, основанные на амплификации произвольных или заранее выбранных последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), проведение которой требует сравнительно небольших затрат времени. Метод ПЦР-анализа позволяет специфично копировать in vitro определенные фрагменты генома, увеличивая их количество в геометрической прогрессии, используя небольшие (ні) количества геномной ДНК. Среди ПЦР-методов наиболее широко используют метод анализа полиморфизма микросателлитных последовательностей.
Гипервариабельность микросателлитных последовательностей, высокая плотность и равномерность их распределения по геному, кодоминантное наследование и простота их обнаружения в автоматическом режиме делает микросателлиты
незаменимыми маркерами для исследования меж- и внутривидовою разнообразия, генотипирования и популяционного анализа растений, а также для построения подробных іенетических карг.
К преимуществу метода микросателлитного анализа можно отнести возможность создания на его основе эффективной универсальной технологии, пригодной для контроля интрогрессии генетического материала при отдаленных скрещиваниях, для различения и идентификации источников, доноров, іибридов и сортов сельскохозяйственных растений. Па момент начала наших исследований было известно достаточное количество микросателлитных локусов растений рода Solatium, однако, их применимость для решения задач по различению и идентификации каргофеля была мало изучена.
Таким образом, представляется актуальным разрабоїка удобной в эксплуатации, относительно быстрой, высокопроизводительной и надежной технологии для генотипирования растений на основе анализа полиморфизма микросателлитов.
Целью данной работы явилась разработка технологии для генотипирования картофеля и ею дикорастущих сородичей на основе микросателлитного анализа.
Интродукция картофеля в Европу и Россию
Родиной картофеля являются страны Южной и Центральной Америки, где и сейчас произрастают его дикие виды. Именно на этой территории картофель был введен в культуру индейскими племенами 8 тыс. лет назад. В Европу картофель завезли в XVI веке. Участник испанской экспедиции Кастильянос впервые увидел картофель в 1536 г. и впоследствии описал его как растение с бледно-фиолетовыми цветками и мучнистыми корнями приятного вкуса, оценив его как дар для индейцев и лакомство для испанцев.
Другой участник экспедиции Сиэс де Лэон познакомился с картофелем в Перу в 1538 г. и, вернувшись в Испанию, подробно описал все увиденное в своей книге, изданной в 1553 г. Существовали и частные сообщения. Например, испанец Вальдивий еще до выхода упомянутой книги в 1551г. уведомлял императора Карла V о неизвестном европейцам культурном растении, произрастающем в Чили.
Около 1565 г. картофель попал в Испанию, а уже через восемь лет (в 1573 г.) его приобретали для больных. Часть картофеля из Испании была послана в качестве подарка папе римскому Пию IV. Папский кардинал в 1587 г. привез картофель в Бельгию в качестве лекарственного средства. Несколько клубней нового растения подарили мэру маленького городка Моне, и мэр из собственного урожая послал в 1588 г. два клубня и ягоду картофеля известному венскому ботанику К. Клузиусу. Англичане познакомились с картофелем независимо от испанцев. Адмирал Дрейк, побывав в 1578 г. на острове Моча (38 ю. ш.), около берегов Чили, обнаружил там участки земли, на которых возделывали картофель. Его клубни служили основным продуктом питания для аборигенов. Предполагается, что Дрейк завез в Англию первую партию картофеля в 1586 г. Этот картофель был взят либо на захваченных Дрейком испанских факториях, либо с испанского корабля, шедшего в Европу.
Таким образом, во второй половине XVI века картофель был ввезен в Испанию и Англию. Затем в течение всего XVII века он распространялся по европейскому континенту. Из стран, освоивших культивирование картофеля, он распространялся в регионы Восточной Европы.
Первоначально картофель распространялся в Европе как лекарственное растение, его возделывали на огородах аптекарей и в ботанических садах. В отличие от других культур, завезенных из стран Нового Света (фасоль, кукуруза), картофель довольно медленно входил в хозяйственный оборот всех европейских стран, кроме
Ирландии, где отмечалось более быстрое его вовлечение в сельскохозяйственное производство.
Путь картофеля с огородов аптекарей на огороды крестьян занял около 150 лет. Этим периодом завершается первый этап селекции картофеля в Европе, этап очень короткий для эволюционного развития, но весьма результативный, поскольку итогом стало создание нового подвида - картофеля культурного Solanum tuberosum.
Следующие несколько этапов селекционной работы были обусловлены влиянием неблагоприятных факторов - появлением новых болезней и вредителей. Так, во второй половине XVIII века в Западной Европе распространился вирус скручивания листьев; во второй половине XIX века картофель впервые был поражен фитофторой; в начале XX века (1910 г.) в Европе распространился рак картофеля. Появление столь опасных болезней картофеля способствовало созданию новых сортов, обладающих ценными качествами, таким образом, постепенно обновлялся и расширялся сортимент картофеля. Так, на рубеже XIX и XX столетий на германском рынке появились высококрахмалистые сорта, которые впоследствии стали возделываться в России: Меркер (1892 г.), Вольтман (1895 г.), Грация (1898 г.), Император Рихтер, Силезия (1895 г.). К этому же времени относится выход германских сортов, ставших впоследствии родоначальниками многих современных сортов и широко распространившихся по странам мира: Гранат, Элла (1898 г.), Альма (1904 г.), Юбель (1908 г.). В Англии в тот же период были созданы такие широкоизвестные сорта, как Эрстлинг (1891г.), Эпикур (1897 г.), Кинг Эдуард (1902 г.), Кинг Георг (1907 г.), Мажестик (1911 г.), Гольден Вондер (1908 г.), Грет Скот (1909 г.), и др.
Реактивы и материалы
Олигонуклео гиды, используемые в работе, были синтезированы в ЗАО «Синтол» (Россия) на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM 102U (Россия).
В работе использовали ферменты: Taq ДНК-полимеразу ThermoStar, обеспечивающую «горячий старт» при проведении ПЦР, производства ВНИИ СБ (лаб. Молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций, зав. лаб. Лунин В.Г.), термосеквеназу фирмы Amersham BioSciences (США), эндонуклеазы рестрикции Msp I, Eco RI, Т4 ДНК-лигазу и соответствующие буферные растворы фирмы MBI Fermentas (Литва).
Реактивы: Хлорид магния, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP), агароза (Low ЕЕО), формальдегид, Ы,Ы -метиленбисакриламид, глицерин, тритон Х-100, минеральное масло, краситель бромистый этидий, красители - маркеры бромфеноловый синий (ВРВ) и ксиленцианол (ХС), акриламид, N,N,N N -тетраметилэтилендиамин, додецилсульфат натрия (ДСН), трис-(гидроксиметил)-аминометан, ацетат калия, этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), мочевина, персульфат аммония, формамид, бромид цетилтриметиламмония (СТАВ), изопропилтио-Р-О-галактозид (ИПТГ), лизоцим, р-меркаптоэтанол, 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-О-галактозид (X-gal), гуанидингидрохлорид фирмы Sigma (США), дрожжевой экстракт, бакто-триптон, бакто-агар фирмы Difco (США).
Бактериальные штаммы и питательные среды: в работе был использован лабораторный штамм Е coli DH5a. Для выращивания бактерий использовали среду LB (Luria-Bertam). 1 л среды содержал 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г хлорида натрия (рН 7,5). Для приготовления агаризованных сред непосредственно перед автоклавированием добавляли бакто-агар (15 г/л).
Плазмидный вектор: для клонирования продуктов полимеразной цепной реакции использовали pGEM Easy вектор фирмы Promega (США).
Используемые кислоты, щелочи, соли и органические растворители представляют собой коммерческие реактивы отечественного производства квалификации «хч», дополнительно очищенные по стандартным методикам.
Исследование межвидовой вариабельности представителей рода Solanum методом микросателлитного анализа
В основе предлагаемого способа генотипирования картофеля лежит метод микросателлитного анализа, неотъемлемой частью которого является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Поэтому на предварительном этапе исследований встал вопрос выбора праймеров к участкам генома картофеля, фланкирующим микросателлитные последовательности.
Конструирование праймеров для полимеразной цепной реакции требует соблюдения определенных правил [KiddK.K. et. al, 1995.], что позволяет добиться высокой селективности амплификации:
- праймеры для ПЦР должны иметь длину не меенее 15 нуклеотидов;
- выбранные последовательности праймеров должны содержать на З -конце тандем из GC оснований;
- соотношение AT и GC нуклеотидов в праймере должно быть примерно 1:1;
- праймеры не должны содержать протяженные полипуриновые или полипиримидиновые последовательности;
- последовательности праймеров не должны быть комплементарными друг к другу;
- праймеры должны иметь приблизительно одинаковые значения температуры отжига;
- последовательности праймеров для ПЦР не должны образовывать устойчивые вторичные структуры.
В рамках проведенных исследований при отборе праймеров для анализа микросателлитов картофеля мы воспользовались представленным в литературных источниках списком олигонуклеотидных затравок к известным микросателлитным локусам генома картофеля [MilbourneD. et al, 1998, McGregor СЕ. et al, 2000, AshkenaziV. et al, 2001]. В нашем случае выбор праймеров к микросателлитным участкам генома картофеля определялся следующими критериями. Во-первых, длина амплифицирумого фрагмента генома исследуемого объекта, содержащего микросателлитные последовательности, должна составлять от 100 до 300 п.н. Соблюдение этого условия в значительной степени облегчает процедуру детекции микросателлитных участков ДНК с помощью электрофореза высокого разрешения в полиакриламидном геле, позволяющего надежно разделять ПЦР-фрагменты, отличающиеся всего на несколько нуклеотидов. Во-вторых, при выборе праймеров особый интерес представляют сведения о количестве аллелей и природе повторяющихся единиц, содержащихся внутри того или иного микросателлитного локуса. Совокупность предварительных данных позволяет на начальном этапе исследования получить необходимую информацию о полиморфизме микросателлитов картофеля.
