Содержание к диссертации
Введение
1. Актуальность проблемы 6
2. Цели и задачи работы 8
3. Научная новизна 9
4. Обзор литературы 10
4.1. Селекция капусты белокочанной. Сорта и гибриды 10
4.2. Трансгеноз как новый метод селекции растений 12
4.2.1. Трансформация Brassica oleracea сегодня 12
4.2.2. Техника трансформации 13
4.2.3. Маркерные гены 13
4.2.4. Регуляторныс последовательности 16
4.2.5. Агробактериальная трансформация 17
4.2.6. Прямой перенос генов 20
4.2.7. Наследование трансгенов у генетически модифицированных растений 21
4.3. . Факторы, влияющие на эффективность трансформации 23
4.3.1. Бактериальные штаммы и генотип растений 23
4.3.2. Тип экспланта 24
4.3.3. Оптимальные условия ко-культивирования 26
4.3.4. Отбор трансформированных клеток 29
4.3.5. Регенерация и снижение стрессовых факторов 33
4.3.6. Характеристика трансформантов и экспрессия трансгеиов 36
4.4. Исследование геномного окружения сайтов интеграции Т-
ДНК 37
4.4.1. Метод обратной ПЦР (Inverse PCR) 39
4.4.2. Метод быстрой амплификации геномных окончаний (Rapid
amplification of genomic ends - RAGE) 40
4.4.3. TAIL-PCR 41
AAA. Метод AL-PCR (adaptor ligation PCR) 43
5. Материалы и методы 45
5.1. Линии капусты, использованные в работе 45
5.2. Методы ведения культуры in vitro 45
5.2.1. Стерилизация семян 45
5.2.2. Среды, использованные в работе для поддержания растений культуры in vitro и трансформационного процесса 45
5.2.3. Состав и методика приготовления компонентов питательных сред 46
5.2.4. Определение оптимальной концентрации селективного агента 47
5.2.5. Подбор концентрации селективного агента для анализа поколений трансгенных растений 47
5.2.6. Обработка проростков поколения ТІ раствором гербицида «Баста» 48
5.3. Создание вектора рВаг на основе нлазмиды рВІВаг 48
5.3.1. Методика выделения плазмидной ДНК 48
5.3.2. Рестрикция вектора 49
5.3.3. Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля 49
5.3.4. Лигирование вектора 49
5.3.5. Методика приготовления компетентных клеток 49
5.3.6. Трансформация E.coli лигированным вектором 50
5.3.7. Трехродительская конъюгация 50
5.4. Культура агробактерии 50
5.4.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 50
5.4.2. Состав и способы приготовления среды для культивирования агробактериальных штаммов 51
5.4.3. Наращивание агробактериалыюй культуры для трансформации 51
5.5. Статистический анализ 51
5.5.1. Дисперсионный анализ однофакторного опыта 52
5.5.2. Наименьшая существенная разница 53
5.5.3. Оценка соответствия между наблюдаемыми и ожидаемыми (теоретическими) распределениями по критерию %2 53
5.6. Методика выделения растительной ДНК 54
5.7. Методика проведения ПЦР 55
5.7.1. Состав реакционной смеси для ПЦР: 55
5.7.2. Анализ продуктов ПЦР 55
5.8. Методика проведения дот-блот гибридизации 56
5.9. Методика проведения AL-PCR 57
5.9.1. Рестрикция геномной ДНК 57
5.9.2. Конструирование специфических адаптеров и дотирование адаптеров с рсстрикциоиной смесью 57
5.9.3. Проведение ПЦР 57
5.9.4. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 58
5.9.5. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР 58
6. Результаты 60
6.1. Конструирование вектора рВаг для трансформации капусты белокочанной 60
6.2. Разработка схемы селекционного процесса с участием трансгенной составляющей 61
6.3. Получение трансгепных растений капусты белокочанной, устойчивых к гербициду фосфинотрицину 63
6.3.1. Изучение регенерационной способности различных типов эксплантов 63
6.3.2. Изучение влияния фитогормонов на регенерационную способность линий капусты белокочанной 64
6.3.3. Определение оптимальной концентрации селективного агента 68
6.4. Первичный молекулярный анализ трансгенных растений капусты белокочанной 70
6.4.1. Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи ПЦР-анализа 70
6.4.2. Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи дот-блот гибридизации 71
6.4.3. Трансформация четырех линий капусты белокочанной 73
6.5. Определение количества копий трансгенной вставки методом AL-PCR 74
6.5.1. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДПК с 5' конца (правая граница Т-ДНК) 74
6.5.2. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДНК с 3' конца (левая граница Т-ДНК) 79
6.6. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений....82
6.6.1. Расщепление в первом семенном поколении от самоопыления трансгенного растения 82
6.6.2. Расщепление в первом семенном поколении от скрещивания трансгенного растения со стерильной родительской формой 83
6.7. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений на проявление признака устойчивости в условиях in vivo 85
7. Выводы 88
8. Список литературы 89
Список ИЛЛЮСТРАЦИЙ
Рис. 1 Генетическое родство видов Brassica 12
Рис. 2 Схема проведения обратной ПЦР 40
Рис. 3 Схема проведения TAIL - ПЦР 42
Рис. 4 Схема проведения AL-PCR 44
Рис. 5 Специфические праймеры на область Т-ДНК для проведения
AL-PCR 58
Рис. 6. Рестрикционный анализ дериватов рВШаг (негатив) 60
Рис. 7. Карта вектора рВаг 61
Рис. 8. Схема селекционного процесса трансгенных растений для получения промышленных гибридов с ЦМС, устойчивых к гербицидам на основе фосфинотрицина 62
Рис. 9. Подбор оптимального типа экспланта для регенерации 64
Рис. 10. Подбор оптимальной концентрации селективного агента 69
Рис. 11. Подбор концентрации селективного агента для проростков 69
Рис. 12 Электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 1% агарозном геле 71
Рис. 13 Пример анализа растений - регенсрантов методом дот-блот гибридизации 72
Рис. 14 Электрофоретический анализ второй ПЦР на ДНК, обработанной рестриктазами EcoR V, Dra I, Нра I, Zrm I и Ssp I с праймерами API и RB2 76
Рис. 15. Результат скрининга рекомбинантов 77
Рис. 16. Секвенированная последовательность фрагментов, полученных при рестрикции эндонуклеазами EcoR V и Hpal 77
Рис. 17. Теоретическая схема отжига праймеров и проведения ПЦР 79
Рис. 18. Электрофоретический анализ данных второй ПЦР на ДНК, обработанной рестриктазами Zrm I, EcoR V, Нра I, Dra I и Ssp I с праймерами API и LB5 80
Рис. 19 Отбор трансгенных проростков на селективной среде в поколении Ті 85
Рис. 20 Отбор трансгенных проростков ио устойчивости после обработки 1,5 % раствором гербицида «Баста» 86
- Селекция капусты белокочанной. Сорта и гибриды
- Линии капусты, использованные в работе
- Конструирование вектора рВаг для трансформации капусты белокочанной
Введение к работе
Капусту белокочанную (Brassica oleracea var. capitata) выращивают в России повсеместно, практически во всех климатических зонах. Высокая продуктивность при известной простоте возделывания позволяет капусте белокочанной стабильно занимать третье место после злаковых культур и картофеля в отечественном сельскохозяйственном производстве [www.mosreg.ru/11820, 2006]. По содержанию в своем составе витамина С капуста белокочанная занимает одно из первых мест (до 45 мг\100 г), превосходя по этому показателю, например, лимоны (40мг\100г), и считается незаменимым его источником в зимнее время на большей части территории Российской Федерации.
В связи с этим, получение стабильного урожая капусты белокочанной является одной из важнейших задач отечественного растениеводства. Решение этой проблемы подразумевает как увеличение продуктивности культивируемых гибридов капусты, так и повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды [Ranjekar P. et al., 2003].
Селекция белокочанной капусты в последние годы вышла на качественно новый уровень благодаря созданию гибридов F1, которые оказались устойчивыми, высокоурожайными и соответствующими всем стандартам современного промышленного овощеводства [Моиахос Г.Ф., 2003].
Сегодня для создания сортов и гибридов белокочанной капусты с новыми направленно измененными агротехническими свойствами в сочетании с методами традиционной селекции перспективным представляется использование методов генетической инженерии. Комбинация традиционных способов селекции и методов трансгенеза позволяет эффективно совместить полезные признаки, кодируемые вносимым геном, с набором выгодных сортовых характеристик, полученных благодаря многолетнему труду селекционеров.
Промышленное земледелие предполагает интенсивное использование гербицидов для борьбы с сорняками. Многие годы для борьбы с сорняками в период вегетации использовали гербицид «Семерон». В настоящее же время, в списке разрешенных к использованию препаратов, гербициды для обработки вегетирующих растений отсутствуют [Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в 2005 году].
Поэтому разработка схемы создания гибридов капусты, включающей трансгенную компоненту и получение на ее основе устойчивых к гербицидам растений, представляется весьма актуальной задачей. Таким образом, создание трансгенных гербицндоустойчивых гибридов Fj позволит полностью механизировать процесс выращивания этой культуры.
2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
Целью настоящей работы являлось создание трансгенных фертильных аналогов родительских форм перспективных гибридов белокочанной капусты, несущих ген фосфнпотрицииацетилтрансферазы (bar), обеспечивающий устойчивость к гербицидам на основе фосфинотрицина.
Для достижения поставленной цели нами решались следующие задачи:
- конструирование вектора для трансформации растений не несущего в переносимой части (Т-ДНК) генов устойчивости к антибиотикам;
- разработка схемы селекционного процесса с участием трансгенной составляющей для получения гибридов капусты белокочанной;
- разработка эффективных протоколов регенерации и трансформации для четырех линий капусты белокочанной отечественной селекции Гэс-2, Мег- 2, Зму 7, Дрв 2;
- получение трансгенных растений на основе линий капусты белокочанной, экспрессирующих ген устойчивости к гербициду фосфинотрицину bar;
- проведение молекулярно - биологического анализа полученных трансгенных линий капусты (ПЦР-анализ, дот-блот гибридизация, определение количества копий Т-ДНК инсерций методом AL-PCR);
- проведение лабораторных и ограниченных полевых испытаний на проявление признака в поколении Tj и анализ полученного расщепления.
3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые разработана схема селекционного процесса с участием трансгеннон составляющей для получения гибридов капусты белокочанной. На основании схемы определена точка приложения трансгенной технологии в традиционном селекционном процессе, то есть, выбран компонент для генетической модификации.
С использованием метода агробактериалыгай трансформации впервые получены трансгенные фертильные аналоги стерильных родительских форм четырех линий капусты белокочанной.
Впервые для молекулярной характеристики полученных трансгенных растений капусты белокочанной применен метод полимеразной цепной реакции с пришитыми адаптерами (Adaptor Ligation-PCR).
Селекция капусты белокочанной. Сорта и гибриды
Человек начал использовать в пищу овощи на заре своего существования. На сегодняшний день в мире известно около пяти тысяч употребляемых в пищу растешп ї. Медицинские нормы потребления овощей составляют 120-130 кг на одного человека в год. Почти вдвое превосходит этот уровень Италия потребляющая до 230 кг/чел. В России потребление овощной продукции в три раза меньше, чем в этой средиземноморской стране, и на 50 кг/чел меньше рекомендуемых норм, т.е. 70-80 кг в год па одного человека [Луговой А.С. и др., 2004]. Огородники нашей страны возделывают около 30 видов овощей, в составе же промышленной овощной продукции 88% занимают шесть видов овощных культур: капуста белокочанная, томат, огурец, морковь, свекла, и репчатый лук [Пивоваров В.Ф., 1995].
Селекция овощных культур на протяжении последних 50 лет направлена на переход от возделывания сортов к гибридам. Так что же такое гибрид и каковы основные преимущества гибридов над сортами. Обычно сортом называют группу растений, обладающую комплексом каких-либо сходных хозяйственных признаков (скороспелость, урожайность, характеристики плодов и т.д.). В зависимости от генетической однородности сорта эти характеристики могут колебаться в значительной степени, например в пределах одного сорта некоторые растения могут иметь высокую урожайность, другие - низкую, одни скороспелые, другие - поздние. Такое колебание сорта по хозяйственным признакам в большинстве случаев очень неудобно в производстве, например наличие в сорте низкопродуктивных растений или растений с плодами, не соответствующими каким-либо требованиям (неоднородными по размеру). Как известно, самыми однородными являются чистые линии. Линии получают отбором и длительным самоопылением нескольких поколений (обычно не менее 3-4) растений. Однако при длительном самоопылении обнаруживается инбредная депрессия. Такие растения обычно меньше ростом, менее продуктивны и т.д.
Проблема инбредной депрессии была решена с помощью гибридов F1, которые получают скрещиванием двух линий (хотя многие гибриды трех- и более линейны, но это связано с вопросами размножения гибридов). При получении гибридов F1 было обнаружено, что некоторые из них по ряду хозяйственно ценных признаков (урожайность, скороспелость и т.д.) превосходят обоих родителей - как материнскую, так и отцовскую формы. Это явление получило название гетерозис. При этом все растения F1 одинаковы по всем признакам. Таким образом, при применении гибридов F1 удалось избежать проявления инбредной депрессии, при этом иметь однородный сорт. К основным преимуществам гибридов над сортами относятся:
сочетание эффекта гетерозиса с высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды, болезням, вредителям;
преодоление отрицательных генетических корреляций, например, таких как скороспелость - продуктивность, лежкость - продуктивность и т.д.;
высокая морфологическая и биологическая однородность;
более надежная защита авторских прав;
использование дешевого беспересадочного способа семеноводства у двулетних культур;
возможность оперативного реагирования на нужды рынка (для создания сорта для ряда культур необходимо до 20 лет, в то время как при наличии чистых линий в качестве родительских форм, для создания гибридов требуется, как правило, не более 2-х лет);
создание гибридов с групповой устойчивостью к болезням (не менее 3-4 признаков устойчивости).
Благодаря таким явным преимуществам гибридов, в настоящее время в Государственном реестре селекционных достижений из 132 наименований капусты белокочанной на долю гибридов приходится более 62 % [www.gossort.com]. В настоящий момент в Европе, Японии и Северной Америке гибриды F1, получаемые путем скрещивания инбредных или дигаплоидиых линий (из пыльников или культуры микроспор), практически полностью заменяют ранние перекрестноопыляемые культуры, особенно это касается таких культур как брюссельская капуста, кольраби, брокколи, цветная и т.д. [Puddephat et al., 1996].
Линии капусты, использованные в работе
Материалом для работы служили растения четырех линий капусты, фертильные аналоги перспективных родительских линий с цитоплазматической мужской стерильностью (табл. 2). В качестве эксплаптов использовали гипокотили и семядольные листья 7-8 дневных проростков, выращенных в культуре in vitro.
Для получения исходного растительного материала для трансформации семена стерилизовались в течение 1 мин. в 70% этаноле, затем 7 минут в 4% пшохлорите натрия и отмывались 3 раза по 5 минут в стерильної! дистиллированной воде. Стерильные семена для получения полноценных растений in vitro помещали в контейнеры па агаризовапную питательную безгормональную среду Gamborg. Контейнеры инкубировали при освещенности 120цЕ в условиях фотопериода 16 часов день/8 часов ночь и при температуре +19ц21С.
Среды, использованные в работе для поддержания растений культуры in vitro и трансформационного процесса
Для приготовления сред, представленных в табл. 3, готовили раствор Gamborg-солей в деионизованной воде, доводя рН до значения 5,6 с помощью растворов IN КОН и Ш НС1. Стерилизацию сред осуществляли в автоклаве при 1 атм., 121С в течение 20 минут. После охлаждения среды до +45ц50С добавляли гормоны, антибиотики и селективные агенты (методика приготовления и концентрации стоков см. табл. 4) соответственно составу сред и заливали чашки Петри (ц9 см) по 20 мл среды в каждую. диаметр пор 0,22 мкм); " — стоки антибиотиков храниться 1 месяц при 4С; при -20С большинство антибиотиков сохраняют стабильность в течение нескольких месяцев.
Определение оптимальной концентрации селективного агента
Для определения оптимальной концентрации фосфшютрицина регенеранты, полученные из нетрансформированпых эксплантов в количестве 30 штук помещали в вегетационные контейнеры с агаризованной средой RIM, по вариантам, содержащим различные концентрации фосфшютрицина (табл. 5). Опыт проводили в трех повторностях, повторность представляла собой контейнер, содержащий 30 эксплантов изучаемой линии.
Выводы о концентрации селективного агента делали на основании следующих параметров:
- жизнеспособность в течение 14 дней;
- укоренение на селективной среде.
Подбор концентрации селективного агента для анализа поколений трансгенных растений.
Для определения оптимальной рабочей концентрации селективного агента фосфшютрицина семена капусты белокочанной в количестве штук помещали на чашки Петри, но вариантам, содержащим различные концентрации фосфинотрицина (табл. 5).
Выводы об оптимальной концентрации селективного агента для отбора делали на основании следующих параметров:
- жизнеспособность в течение 14 дней;
- нормальный рост и развитие;
- некротизация семядольных листьев
. Обработка проростков поколения ТІ раствором гербицида «Баста».
Для удешевления процесса отбора трансгенных проростков, на стадии 3 листьев растения обрабатывали 1,5% раствором гербицида «Баста». Анализ на устойчивость проводили через 2 недели после обработки подсчетом числа выживших и погибших растений.
Создание вектора рВаг на основе плазмиды pBIBar.
Плазмиду pBIBar обрабатывали экзонуклеазами Рте I и Hind III.
Получающиеся липкие концы застраивали фрагментом Клёнова.
Результирующий фрагмент ДНК размером 10967 п.н. выделяли из легкоплавкой агарозы.
После замыкания в кольцо лигированным вектором трансформировали штамм Е. coli DH10B.
Отбор трансформантов проводили по устойчивости к канамицину. Скрининг трансформантов проводили при помощи рестрикции эндонуклеазой Pst I.
Конструирование вектора рВаг для трансформации капусты белокочанной
Для решения поставленной цели, нам необходимо было определить, какую компоненту будущего промышленного гибрида необходимо трансформировать чужеродным геном.
Учитывая возможный риск распространения трансгенной пыльцы (горизонтальный перенос) на близкородственные виды, связанного с перекрестным опылением, мы определили, что конечной трансгенной родительской формой в селекционном процессе должна быть форма с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС). Однако с точки зрения селекционного процесса линию с ЦМС нельзя использовать в качестве исходной для трансформации, так как в таком случае невозможно получить семенное потомство от самоопыления и, следовательно, растение, гомозиготное по трансгену. Вместе с тем, с точки зрения классической генетики, проявление чужеродного гена у трансгенных растений рассматривается как доминантная мутация, а генотип растения -первичного трансформанта - с единичной вставкой трансгена определяется как гемизигота.
Исходя из вышеизложенного, в качестве исходных для трансформации нами были выбраны линии, каждая из которых являлась фертильным аналогом стерильной родительской формы, используемой в селекционном процессе при создании перспективных, высокоурожайных российских гибридов.
Кроме того, при выборе исходных линий для трансформации мы учитывали сроки созревания, в частности то, что в Российской Федерации среднеспелая и позднеспелая капуста занимает около 90% от всей возделываемой площади.
Для использования в промышленных посадках гибридов F1 капусты белокочанной, созданных на основе полученных трансгенных растений, мы разработали схему селекционного процесса для получения трансгенных родительских форм с ЦМС будущего гибрида F1, гомозиготных по гену bar (рис. 8).
После определения точки приложения трансгенной технологии в селекционном процессе, на следующем этане работы мы приступили к генетической модификации фертильных аналогов стерильных родительских форм.
Несмотря на то, что методология трансформации двудольных, в частности капустных, считается хорошо разработанной, одним из лимитирующих факторов при трансформации капусты остается плохо предсказуемое поведение того или иного генотипа в культуре in vitro. Различные генотипы обладают неодинаковым регенерационным потенциалом и компетентностью к трансформации.
Оптимизируя ключевые параметры трансформации, требовалось получить высокоэффективные протоколы трансформации для данных линий и получить трансгенные растения.
Изучение регенерационной способности различных типов эксплантов
Для анализа способности к регенерации различных частей растения использовали два типа эксплантов: семядольные листья и гипокотили.
Сравнительная оценка реакции генотипов на условия культивирования in vitro проводилась по следующим критериям: отсутствие формирование каллуса, образование морфогеппого или нсморфогешюго каллуса, эффективность регенерации.
В результате проведенных экспериментов было показано, что в качестве экспланта необходимо использовать гипокотили, т.к. при использовании семядольных листьев в качестве экспланта формирование морфогеппого каллуса практически отсутствовало (рис. 9). При использовании пшокотилей наблюдалось формирование морфогеппого каллуса и регенерация.
