Содержание к диссертации
Введение
2.Обзор литературы 16
2.1. Оборудование для культивирования микроорганизмов, культур клеток и вирусов 16
2.2 .Питательные среды и ингредиенты, используемые при культивировании клеток животных и вирусов 19
2.3.Штаммы и их характеристика 23
2.4.Культивирование фиксированных штаммов вируса бешенства 28
2.5.Методы и процессы культивирования микроорганизмов, культур клеток и вирусов 36
2.6.Выделение, очистка и концентрирование вирусного материала 54
2.7.Методы диагностики бактерийных и вирусных препаратов 63
2.7.1 .Традиционные методы 63
2.7.2.ИФА-методы 65
2.7.3.ПЦР-методы 69
2.8.Антигенные свойства вирусов 72
2.9.Инактивация вируса 84
2.10 .Механизмы выработки иммунитета 8 5
2.11 .Технология производства гипериммунных сывороток 92 2.12.Трансгенные животные 94
2.13.Биологические свойства адъювантов и их компонентов 96
2.14.0бсуждение литературного обзора 96
3.Собственные исследования 99
3.1 . Материалы и методы 99
3.1.1 .Культуры клеток и эмбрионы птиц 100
3.1.2.Животные 100
3.1.3.Штаммы 101
3.1.4.0борудование 101
3.1.5.Методы 102
3.1.5.1 .Культивирование микроорганизмов в биореакторах 104
ЗЛ.5.2.Культивирование клеток и вирусов в биореакторах 105
3.1.5.3.Репродукция вируса бешенства 105
3.1.5.4.Репродукция вируса инфекционного ринотрахеита 105
3.1.5.5.Концентрирование вируса 106
3.1.5.6.0чистка вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота от клеточных белков 106
3.1.5.7.0пределение титра инфекционности вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота 106
3.1.5.8.Белок 106
3.1.5.9.Комплементсвязывающая активность вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота 106
3.1.5.10.Преципитирующая активность вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота 107
3.1.5.11 .Гемагглютинирующая активность вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота 107
3.1.5.12.0чистка Ig G 107
3.1.5.13 .Оценка чистоты препарата иммуноглобулина G 107
3.1.5.14.0днородность и специфичность препаратов иммуноглобулинов 108
3.1.5.15.0ценка реактогенности масел на мышах 108
3.1.5.16.Оценка токсичности масел на мышах 109
3.1.5.17.Получение гипериммунной сыворотки против "
гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней 109
3.2. Результаты исследований 110
3.2.1. Культивирование культур клеток и вирусов в биореакторах в суспензии и на микроносителях 110
3.2.2. Основные факторы, влияющие на гибель клеток при глубинном культивировании в биореакторах 113
3.2.3. Влияние механического перемешивания и аэрации на гибель клеток в биореакторе 116
3.2.4. Способ оценки токсичности масляных адъювантов и их компонентов, используемых при разработке и производстве биопрепаратов с помощью культуры клеток свиной почки в пробирке с монослоем 124
3.2.4.1. Клеточная культура 124 3.2.4.1.1. Подготовительные операции 124
3.2.4.2. Культивирование первичных клеток СП 124
3.2.4.2.1. Приготовление питательных сред 124
3.2.4.2.1.1. Основной раствор 125
3.2.4.2.1.2. Разведенные растворы 126
3.2.4.2.2. Приготовление масляных адъювантов 128
3.2.4.3. Приготовление первичных клеток СП 128
3.2.5. Суспензионное культивирование клеток сперматогоний свиньи 134
3.2.5.1. Теоретическое обоснование 134
3.2.5.2. Периоды сперматогенеза 135
3.2.5.3. Регуляция сперматогенеза 135
3.2.5.4. Суспензионное культивирование 136
3.2.5.4.1. Первый период суспензионного культивирования клеток семенника поросенка
3.2.5.4.2. Второй период суспензионного культивирования сперматогоний 139
3.2.5.4.3. Третий период суспензионного культивирования сперматоцитов 142
3.2.5.4.4. Четвертый период суспензионного культивирования сперматидов 144
3.2.5.4.5. Основные выводы 147
3.2.5.4.6. Оптимизация культивирования клеток ткани семенника поросенка по основным физико-химическим и биофизическим параметрам 147
3.2.6. Накопление вируса (бешенства, ИРТ, ПГ-3) при
глубинном культивировании в биореакторах 148
3.2.7. Культивирование пастерелл, гемофил и стрептококков в биореакторах 149
3.2.7.1. Анализ традиционного процесса культивирования пастерелл 150
3.2.7.2. Разработка управляемого процесса периодического культивирования пастерелл 153
3.2.7.2.1. Оптимизация процесса культивирования пастерелл на начальной стадии роста (на фазе приспособления и начале фазы логарифмического роста) 154
3.2.7.2.2. Влияние окислительно-восстановительного потенциала культуральной жидкости на рост Pasteurella multocida 155
3.2.7.3. Испытание управляемого процесса культивирования пастерелл
в лабораторных и промышленных условиях 156
3.2.7.3.1. Испытание управляемого процесса культивирования
в лабораторных биореакторах 156
3.2.7.3.2. Испытание управляемого процесса культивирования
в промышленных биореакторах 156
3.2.8. Современные оборудование и методы очистки, концентрирования
и инактивации биоматериала антигенов, вирусов и микроорганизмов 164
3.2.8.1. Очистка и концентрирование вируса ИРТ КРС 164
3.2.8.2. Биологические свойства вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота 182
3.2.8.3. Биологические свойства культурального вируса бешенства 186
3.2.8.4. Очистка и концентрирование вируса бешенства 187
3.2.8.5. Инактивация вируса бешенства 188
3.2.8.6. Получение конъюгата анти-IgG КРС с пероксидазой из хрена 191
3.2.8.6.1. Выделение иммуноглобулина класса G из сыворотки крови крупного рогатого скота 191
3.2.8.6.2. Очистка иммуноглобулина вируса бешенства 195
3.2.9. Разработка метода определения токсичности масляных адъювантов
и их компонентов 196
3.2.9.1. Изучение токсичности масляного адъюванта и его компонентов
на культуре клеток СП в пробирках с монослоем 196
3.2.9.2. Сравнительное изучение показателей токсичности масляных адъювантов и их компонентов, используемых в производстве биопрепаратов, на белых мышах и культуре клеток СП в пробирках с монослоем 199
3.2.10. Получение специфических гипериммунных сывороток для изготовления диагностикумов 202
3.2.10.1. Получение лечебной ассоциированной гипериммунной сыворотки против пастереллеза, гемофилеза и стрептококкоза свиней с использованием различных видов животных 203
3.2.10.2. Способ получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней 203
3.2.11. Изготовление диагностических наборов в промышленных условиях 214
4. ОБСУЖДЕНИЕ 219
5. ВЫВОДЫ 231
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 233
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 235
8. ПРИЛОЖЕНИЕ 293
- Оборудование для культивирования микроорганизмов, культур клеток и вирусов
- .Питательные среды и ингредиенты, используемые при культивировании клеток животных и вирусов
- Материалы и методы
Введение к работе
Современная биотехнология занимает ведущее положение в системе биологических, медицинских, ветеринарных и зоотехнических исследований и представляет собой современную прогрессивную форму промышленной технологии, основу которой составляют биологические объекты - человек, животные, растения, микроорганизмы, клетки и вирусы.
Фундаментом современной биотехнологии являются микробиология, вирусология, генетика, биохимия, биофизика, технология, приборостроение. Сочетанное использование основных элементов указанных дисциплин позволяет создавать производственные системы для выпуска биологических-препаратов, предназначенных для индикации возбудителей, диагностики, профилактики инфекционных болезней и лечения животных [211].
Основы биотехнологии у нас в стране отражены в работах наших ученых [32, 33, 34, 19, 20, 193, 202, 205, 82, 116, 218, 219, 300, 213, 240], за рубежом [472,6,407, 179].
Современные биотехнологические производства представляют собой сложный комплекс взаимосвязанных биохимических, физико-химических и биологических процессов, оптимизация которых возможна на клеточном, популяционном, биоценотическом и аппаратурно-технологическом уровне.
Успехи отечественной ветеринарной науки и практики в проведении специфической профилактики инфекционных болезней связаны с крупными научными открытиями, сделанными в конце XIX и начале XX столетий [211, 234, 175].
В течение 40 лет сотрудниками ВНИТИБП накоплен большой опыт в создании новой высокоэффективной техники и биотехнологии получения вакцин, диагностикумов, специфических антигенов вирусного и микробного происхождения, гипериммунных сывороток, методов очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов, выделении специфического антигена и методов их оценки.
Разработаны суспензионные методы культивирования микроорганизмов. клеток животных и вирусов [200, 201, 205, 206, 211, 198, 197, 196, 195, 194,231].
Обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами - одна из главных задач биотехнологии.
Впервые о получении трансгенных сельскохозяйственных животных сообщили две лаборатории в США и Германии. В обоих случаях для переноса генных конструкций в эмбриональные линии был использован метод микроинъекции. Этот метод и сегодня остается наиболее широко используемым для трансгенеза в животноводстве [94, 279].
Таким образом, использование при разработке новых и совершенствование существующих промышленных биотехнологий производства биопрепаратов с использованием современного оборудования (биореакторов, сепараторов, разделительных центрифуг, фильтров и т.д.), иммунобиологических методов будет способствовать повышению их эффективности и улучшению эпизоотической, экологической и социальной обстановки в стране.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в совершенствовании и разработке современных биотехнологических процессов и иммунобиологических методов при промышленном производстве ветеринарных препаратов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать с использованием современного оборудования методы и биотехнологические процессы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов и репродукции культур клеток (включая сперматогонии с генетическим вектором нужной направленности.
2. Разработать современные методы получения специфических антигенов микробного и вирусного происхождения при производстве биопрепаратов.
3. Разработать метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре при промышленном изготовлении диагностикумов и лечебных сывороток и для получения гипериммунных сывороток.
4. Разработать современные биотехнологические процессы производства препаратов (диагностикумов, вакцин, лечебных сывороток) и иммунологические методы их оценки (ИФА, ПЦР).
5. Оценить экологическую, экономическую и социальную эффективность использования предложенных методов и биотехнологий и иммунологических методов.
Научная новизна. Усовершенствованы и разработаны
- биотехнологические процессы и современные иммунобиологические методы анализа при промышленном производстве ветеринарных препаратов, включающие:
- впервые разработан «Набор для ретроспективной ИФА-диагностики инфекционного ринотрахеита КРС»;
- впервые разработан «Набор для ранней ИФА-диагностикиг ринотрахеита КРС»;
впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса бешенства, штамм «Щелково-51», репродуцированного в культуре клеток ВНК-21;
впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса ИРТ, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80 для КРС, изучены свойства вируса и определены условия и сроки его хранения без потери биологической активности;
разработаны схемы иммунизации лабораторных животных, обеспечивающие получение высокоактивных и специфических гипериммунных сывороток к вирусу ИРТ КРС и анти-IgG мыши сывороток при разработке тест-системы для индикации антигенов вирусов бешенства и ИРТ КРС;
- впервые разработан метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов на первичнотрипсинизированных культурах клеток при изготовлении гипериммунных диагностических и лечебных сывороток;
- впервые получена гипериммунная сыворотка для создания пассивного иммунитета у свиней против гемофилеза, стрептококкоза и
пастереллеза с использованием волов как продуцентов, а в качестве антигенов бралась культура Pasterella multocida серовариантов А штамм 1231, В штамм 681 и Д штамм Т-80, Haemophilus pleuropneumoniae серовара I штамм ГУ-19 и серовара П штамм 5870 и Streptococcus suis серовара II (штамм Кае ли);
- впервые изобретен способ размножения стромальных клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов, включающий в себя их выделение, адаптацию и культивирование вне организма, а также интеграцию (вшивание) в них генетического вектора. Размножение осуществляли в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота, энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма;
- впервые установлено, что кормление перепелок сбалансированным рационом с добавлением циалитов значительно увеличивает выход культур клеток из перепелиных эмбрионов.
Новизна полученных результатов подтверждена 7 патентами, в т.ч. 3 заявками (Патент № 2184568 от 10.07.20002г., Патент № 2196336 от 10.01.2003г., Патент № 2196609 от 20.01.2003г., Патент № 2196820 от 20.01.2003г. и Заявки на патент № 2006131443 от 1.09.2006 г., № 2007123692 от 20.06.2007г. и №2007142025 от 15.11.2007г.).
Практическая ценность работы. Результаты проведенных исследований вошли в НТД производства диагностикумов и лечебных ассоциированных сывороток.
Результаты проведенных исследований использованы при разработке технологии биопрепаратов и включены в 6 нормативных документов на изготовление, контроль и применение диагностикумов ИРТ, ПГ-3, бешенства и хламидиоза, ИФА, РСК, РИФ, РДП и ассоциированных сывороток против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза.
Все препараты внедрены в производство и ветеринарную практику или производятся и применяются в ветеринарной практике в порядке широкого производственного опыта за период 2001-2007 гг.
За период с 2001 по 2007 гг. выпущены для практического применения в АПК России диагностикумы против вирусов ИРТ ИФА - 500, бешенства РДП - 3500, РИФ - 4000 и хламидиоза РСК - 15000 наборов. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защит
1.Результаты совершенствования и разработки биотехнологических процессов с использованием современного оборудования и современных иммунобиологических методов при промышленном культивировании микроорганизмов, культур клеток и вирусов и контроля репродукции вирусов и микроорганизмов при промышленном выпуске ветеринарных биопрепаратов.
2. Результаты исследований по использованию при промышленном производстве ветеринарных препаратов современных методов и оборудования для разделения, очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов и выделение специфических антигенов и методы их оценки.
3. По результатам оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре клеток и практическое использование этого метода для получения гипериммунных сывороток в процессе разработки и промышленного выпуска диагностикумов ИФА ИРТ, РДП и РИФ бешенства, ИРТ, ПГ-3, хламидиоза и ассоциированных лечебных сывороток (гемофилез, стрептококкоз и пастереллез).
Апробация. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международной конференции, посвященная 80-летию Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, Москва (1999 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов», посвященная 30-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности,
Щелково (2000 г.); Всероссийской научно-производственной конференции «Разработка и освоение производства нового поколения лекарственных средств для животных и их применение в ветеринарной практике» в Федеральном государственном унитарном предприятии «Ставропольской биофабрике», Ставрополь (2000 г.); Международной научно-практической конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии, Покров (2000 г.); Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии, Москва (2000 г.); Биологической научно-практической конференции ВГНКИ, Москва (2000 г.); Науковий вісник Национального аграрного університету, Киев (2001 г.); Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, Щелково (2001, 2002, 2004гг.); Международной научно-практической конференции «Нейроинфекции: бешенство, гупкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтфелдта-Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена», Покров (2001 г.); Шестой международной конференции «Новые перспективы применения хитозана и хитина», Москва (2001 г.); Международной научно-практической конференции «Биолого экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей», Покров (2002 г.);
Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск (2002 г.); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково (2003, 2005, 2007 гг.); XI Московском международном ветеринарном конгрессе, Москва (2003 г.); Международной научно практической конференции, посвященная 75-летию Научно 15 исследовательского института микробиологии Московской области Российской Федерации, Киров (2003 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», Москва (2006 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково (2006 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы молекулярной диагностики в ветеринарной медицине и биологии», Крым (2007 г.); Научно-практической конференции «Грипп птиц: профилактика и меры борьбы», Москва (2007 г.); на заседаниях ученого совета ВНИТИБП, Щелково (2000-2007гг.).
Публикации результатов исследований
По материалам диссертации опубликовано 73 научные работы, в том числе 7 патентов (из них 3 заявки на патент) и 3 монографии.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 305 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 46 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 604 наименования, из которых 282 отечественных и 322 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие Л.К. Эрнст, Е.Э. Школьников, Б.В. Соловьев, B.C. Иванов, А.И Гуславский, Э.Я. Сазанова, сотрудники отделов молекулярная биология и иммунология и оказывали практическую и консультативную помощь, за что приносим им сердечную благодарность. Выражаем искреннюю признательность за помощь сотрудникам, перечисленным в качестве соавторов в списке публикаций по теме.
Оборудование для культивирования микроорганизмов, культур клеток и вирусов
В последнее время значительно возрос интерес к крупномасштабному выращиванию клеток животных для производства таких биопрепаратов как плазминоген, урокиназы, гормоны, интерферон, моноклональные антитела, опухолевые антигены и т.д. [564].
Для обеспечения массообменных характеристик биореакторов используются три метода [24]:
1) аэрация культуры газовой смесью путем ее разбрызгивания в питательной среде с образованием пузырьков;
2) аэрация через проницаемые мембраны;
3) диффузионный перенос 02 и С02 через газо-жидкостные интерфазы.
Первый метод нашел широкое применение при масштабном культивировании клеток в процессах производства противовирусных вакцин. Однако прямая аэрация культуральнои жидкости часто приводит к механическому разрушению части клеток животных. Наиболее перспективен метод аэрации клеточных культур через проницаемые (гидрофобные) мембраны, в которых не происходит образование пузырьков на границе раздела фаз газ-жидкость. Диффузионный массоперенос наблюдается в биореакторах с пленочным мат-риксом и широко используется при роллерном культивировании. При разработке оборудования для культивирования клеток животных необходимо соблюдение их оптимальных конструктивных соотношений, нейтральные материалы и специальные методы и устройства для аэрации и перемешивания. Перспективным является использование мембран с высокими газопроницаемыми свойствами и пористой структурой [304].
Для повышения плотности культуры клеток предложено несколько технологических и технических приемов:
- при крупномасштабном культивировании для повышения выхода клеток может быть использован мембранный биофильтр [139];
- биореакторы с использованием фибрилл в качестве твердого субстрата для прикрепления клеток [304];
- перфузионные биореакторы для длительного (непрерывного) культивирования клеток. Данная система состоит из перфузионного хемостата для суспензионных культур, биореактора с микроносителями и стационарного поддерживающего биореактора для иммобилизованных клеток [564];
- гибкая блочно-модульная система для глубинного суспензионного и псевдосуспензионного (на микроносителях) культивирования клеток животных и вирусов, включающая-биореакторы емкостью от 5 до 630 л с механическим перемешиванием, самовсасывающую мешалку, модуль технологической обвязкии блок автоматического управления [200,204].
Существуют два основных подхода к созданию необходимого оборудования для культивирования клеток и вирусов. Первый подход предполагает создание оборудования, предназначенного для ведения в оптимальных условиях только данного специфического процесса. Второй подход заключается в том, чтобы сконструировать многоцелевое оборудование, способное выполнять любой вид работы из заданной программы.
За последние годы отмечается широкое использование микроносителей при производстве вирусных вакцин [30, 51, 59, 204, 205, 206]. При применении микроносителей достигаются высокие показатели по использованию ростовой поверхности, на которой производят выращивание клеток. Однако отмечается, что ряд лимитирующих факторов может ограничивать, в некоторых случаях, рост клеточных культур на микроносителях [385]. Используемые в лабораторных и промышленных условиях микроносители имеют диаметр 100 -200 мкм, и подразделяются на 6 основных групп.
Питательные среды и ингредиенты, используемые при культивировании клеток животных и вирусов
Питательные среды из естественных компонентов применяют в последнее время редко. Они вытеснены синтетическими средами. Однако следует отметить, что в первую фазу культивирования - выращивание клеток - к синтетическим средам, как правило, добавляют некоторые естественные компоненты и в первую очередь сыворотки крови [4].
Питательные среды из естественных компонентов готовят на основе какого-либо сбалансированного солевого раствора. Чаще всего для этих целей используют растворы Хэнкса или Эрла.
В качестве источников белкового питания, витаминов, факторов роста и других веществ, необходимых для роста клеток, в состав этих сред включают сыворотки животных, амниотические жидкости, эмбриональные экстракты. Обычно применяют сыворотки человека или некоторых животных (лошадей, крупного рогатого скота). Из амниотических жидкостей чаще всего используют коровью амниотическую жидкость. Эмбриональные экстракты готовят обычно из куриных или коровьих эмбрионов [4, 429].
Усовершенствование синтетических питательных сред развивалось главным образом в сторону упрощения среды Л 99 и определения минимального количества компонентов, необходимых для культивирования клеток и вируса [31,139].
Так, Игл [362] установил, что в число необходимых компонентов для роста клеток животных и человека должны входить по меньшей мере 13 аминокислот (изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, триптофан, треонин, валин, цистин, тирозин, аргинин, гистидин, глутамин в виде L-форм); 8 витаминов (холин, фолиевая кислота, никотинамид, пантотенат, пиридоксаль, тиамин, рибофлавин, L-мезоинозит), глюкоза; 6 неорганических ионов (калий, натрий, магний, кальций, хлориды, фосфаты).
Присутствие аминокислот в среде обязательно. Игл указывает, что если из среды, которая содержит только основные вещества, необходимые для роста, удалить одну важную аминокислоту, клетки в течение нескольких дней погибнут. На ранних стадиях дегенеративные изменения обратимы. Если недостающую аминокислоту вновь добавить в среду, клетки продолжают размножаться.
Клетки почки обезьян на первом пассаже в культуре ткани используют глутаминовую кислоту вместо глутамина, очевидно, вследствие присутствия активного синтезированного глутамина. Глицин оказывал сильно выраженное стимулирующее действие на рост эпителия почки обезьяны.
Глутамин заслуживает внимания ввиду его особого положения в синтезе вируса. Он, как и всякая другая аминокислота, переходит в белок [362, 395].
Для роста клеточных культур, помимо упомянутых аминокислот, необходимы 8 витаминов. Семь витаминов комплекса витамина В (холин, фолиевая кислота, никотинамид, пантотенат, пиридоксаль, тиамин, рибофлавин) и мезоинозит. При исключении одного витамина из состава питательной среды может наступить дегенерация клеток.
В течение ряда лет многие исследователи, работающие в области биологии клеток, стремились создать для культивирования клеток среду с определенным составом химических веществ,.которая не требовала бы добавления белков: Современные попытки решить эту проблему относятся к созданию В: 1950 г. среды 199, предложенной Морганом, Мортоном и Паркером. Авторы, проведя большую экспериментальную работу, в которой использовали культуру мышечной ткани куриного эмбриона, показали, что предложенная ими; полностью синтетическая среда поддерживает рост тканей на протяжении 3- 4 недель [4,516,561].
Материалы и методы
Работа проводилась во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН и на Федеральном государственном унитарном предприятии «Щелковский биокомбинат» Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации.
Культуры клеток и эмбрионы птиц. В работе использовались перевиваемая линия клеток ПТ-80 (почки теленка) и ТАУЭР, культура клеток ВНК 21/13, первичные культуры клеток СП (селезенки поросенка) и семенников, нормальных и обработанных ретровирусом, перевиваемые линии клеток СПЭВ, первичнотрипсинизированные культуры клеток почки, легкого и трахеи эмбриона коровы. Использовали СПФ-яйцо, производимое на ФГУП «Щелковский биокомбинат». Инкубирование яиц проводили в промышленных или лабораторных инкубаторах.
Животные. Использовали морских свинок, мышата альбиносы массой 9-21 г, кроликов разных возрастов, подсвинки в возрасте 2-6 месяцев, овец и крупный рогатый скот.
Питательные среды и растворы. Питательные среды: культуральные среды Игла; Эрла; 199; полная среда Игла, модифицированная Дульбеко (ДМЕМ) (Gibco, Панэко); бессывороточная среда Хенкса с 0,5% лактальбумином; сыворотка КРС; фетальная сыворотка телят и коров (НПО «Вектор», Панэко).
Растворы: - 0,01 М калий фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М NaCl, рН 7,3±0,1 (ФБР);
- 0,01 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М NaCl и
0,15 Тритона Х-305, рН 7,3+0,1 (ФБР-Т);
- 0,15 М фосфатно-цитратный буферный раствор, рН 5,0;
- 0,15 М фосфатно-цитратный буферный раствор, содержащий 0,4
мг/мл о-фенилендиамина (ОФД) и 0,012% Н202, рН 5,0 (субстратный
раствор);
- 62,5 мМ Трис, 2,25% ДСН, 12,5% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол и 0,01% бром-фенол голубой, рН 6,8 (дезинтегрирующий буфер);
- 0,2% Кумаси в 50% метаноле и 7% уксусной кислоте (окрашивающий раствор);
- 6,5 мМ трис-HCl буфер, содержащий 64 мМ глицина, 20% этанола, рН 8,3 (буфер для переноса);
- физиологический раствор, содержащий 0,5% Тритона Х-305 (ФР-Т);
- блокирующий раствор - 10 мМ калий-фосфатный буфер, содержащий 0,15 М NaCl и 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 7,4 (ФБР-БСА);
- 10 мМ калий-фосфатный буфер, содержащий 0,15 М NaCl, 1% БСА и 0,05% Тритона Х-305, рН 7,4 (ФБР-БСА-Т);
- 4% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК), рН 7,2; 2% водный раствор уранил-ацетата (УА);
- 0,1 М глицин НС1, рН 2,0 (элюирующий буфер);
- 10 мМ раствор гипоксантина; 0,04 мМ раствор аминоптерина;
- 1,6 мМ раствор тимидина;
- 2,5% лактальбумин, ферменты, гормоны, полиэтиленгликоль (ПЭГ) разной концентрации, физиологический раствор.
Масла и эмульгаторы. Использовали масла: вакцинное, ТУ 38101307-72, основы РМ (ГОСТ 15819-70) и АМГ-10 (ГОСТ 6794-75), Ангарское, Маркол 52 (фирма «Эссо», США) и эмульгаторы: ланолин, ФС 42-2520-88, сорбитанолеат, ТУ 18-16-9-81, Монтанид 888 и 103 (фирма «Сеппик», Франция).
Штаммы. Использовали фиксированный вирус бешенства, штамм «Щелково-51»; вирус ИРТ КРС, штамм «ТК А» (ВИЭВ) В2; хламидии, штамм «Улетово»; Pasterelia multocida, сероварианты А, «штамм 1231»; В, «штамм 681», и Д, «штамм Т-80»; Haemophilus pleuropneumoniae серовара I, «штамм ГУ-19», и серовара П, «штамм 5870», и Streptococcus suis серовара II, «штамм Касли», респираторно-синцитиальный вирус, штамм «Randall»; вирус ПГ-3, штамм «ЗКСМ».
