Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Аналитический обзор 11
1.1 Пищевые красители: применение и способы их выявления в напитках 11
1.1.1 Синтетические пищевые красители, разрешенные и запрещенные к применению 12
1.1.2 Проблема фальсификации напитков 15
1.1.3 Способы выявления синтетических пищевых красителей в напитках 20
1.2 Хитозан и его сорбционные свойства 26
1.2.1 Общая характеристика хитозана 26
1.2.2 Источники хитина и хитозана 30
1.2.3 Сорбция красителей хитозаном 32
1.2.4 Активация хитозансодержащих сорбентов 34
1.3 Хитозан грибного происхождения и способы его выделения 37
1.3.1 Состав клеточной стенки грибов. Сравнительный анализ грибных источников для получения хитозана 37
1.3.2 Способы получения хитозана и хитозансодержащих продуктов из грибов 40
1.4 Получение продуктов при культивировании Rhizopus oryzae 43
1.4.1 Получение хитозансодержащих сорбентов 44
1.4.2 Получение молочной кислоты и полилактатов 45
1.4.3 Получение ферментных препаратов 46
1.4.4 Получение этанола 47
1.4.5 Метаболизм гриба Rhizopus oryzae 49
1.5 Заключение 53
Глава 2 Организация эксперимента. Объекты и методы исследования 55
2.1 Схема организации эксперимента 55
2.2 Объекты исследования 56
2.3 Методы исследования. 59
2.3.1 Приготовление питательных сред. 59
2.3.2 Культивирование гриба Rhizopus oryzae 59
2.3.3. Анализ питательной среды и культуральной жидкости 60
2.3.4 Анализ биомассы. 63
2.3.5 Определение концентрации минеральных компонентов в биомассе и полученных биосорбентах 64
2.3.6 Определение сорбционной емкости биомассы и полученных из нее биосорбентов 65
2.3.7 Определение состава биосорбентов методом ИК-спектроскопии 66
2.3.8 Определение степени деацетилирования биосорбентов. 66
2.3.9 Определение оптических характеристик напитков и модельных растворов фотометрическим методом 67
2.3.10 Экспресс-метод выявления синтетических красителей в напитках и модельных растворах. 67
2.3.11 Идентификация синтетических красителей в напитках методом тонкослойной хроматографии. 68
2.3.12 Определение концентрации синтетических красителей в напитках методом капиллярного электрофореза. 70
2.3.13 Статистическая обработка результатов экспериментов. 70
Глава 3 Изучение селективности сорбции красителей из напитков различными сорбентами 71
3.1 Исследование оптических характеристик напитков для оценки селективности сорбции красителей . 71
3.2 Сравнительный анализ сорбентов в отношении селективности извлечения синтетических красителей 75
3.2.1 Активированный уголь 75
3.2.2 Сорбенты на основе полисахаридов 77
3.3 Заключение 80
Глава 4 Исследование процесса культивирования Rhizopus oryzae 81
4 1 Сравнение показателей роста Rhtopus oryzae на картофельно-глюкозной и глюкозо-пептонной средах 81
4.2 Исследование роста Rhizopus oryzae на картофельных отходах и оценка сорбционных свойств полученной биомассы 83
4.3 Исследование влияния концентрации глюкозы и характера роста гриба на выход биомассы нее сорбционные свойства 87
4.4 Влияние азотсодержащих добавок к питательной среде на накопление биомассы и ее сорбционные свойства 90
4.5 Исследование влияния рН среды на выход биомассы. Подбор реагентов для нейтрализации 92
4.6 Определение состава и соотношения продуктов, получаемых при культивировании Rhizopus oryzae 94
4.7 Заключение 101
Глава 5 Разработка технологии получения хитозансодержащих биосорбентов из биомассы Rhizopus oryzae и исследование их сорбционных свойств 103
5.1 Подбор условий обработки биомассы щелочью для получения хитозансодержащих биосорбентов из биомассы 104
5.2 Разработка способа активации биосорбентов 109
5.3 Технологическая схема получения биосорбента РИОСОРБ 112
5.4 Исследование состава полученного биосорбента 115
5.5 Исследование сорбционных свойств полученного биосорбента в сравнении с крабовым хитозаном в отношении синтетических красителей 118
5.6 Заключение 120
Глава 6 Разработка экспресс-метода выявления синтетических пищевых красителей в напитках 121
6.1 Исследование влияния обработки биосорбентом на натуральные красные вина и модельные растворы синтетических красителей 121
6.2 Исследование влияния времени обработки биосорбентом напитков и модельных растворов на их оптические характеристики 124
6.3 Подбор количества биосорбента, необходимого для определения синтетических пищевых красителей в напитках 129
6.4 Определение степени сорбции красителей из растворов в белом вине 131
6.5 Установление пределов определения синтетических пищевых красителей в напитках 133
6.6 Заключение 136
Глава 7 Апробация экспресс-метода выявления синтетических пищевых красителей в напитках 137
7.1 Исследование различных напитков разработанным экспресс-методом 137
7.2 Выявление и идентификация синтетических красителей в напитках методами тонкослойной хроматографии и капиллярного электрофореза 140
7.3 Заключение 144
Выводы 145
Список использованных источников 147
Приложение А Акт испытаний 168
- Общая характеристика хитозана
- Исследование оптических характеристик напитков для оценки селективности сорбции красителей
- Подбор условий обработки биомассы щелочью для получения хитозансодержащих биосорбентов из биомассы
- Выявление и идентификация синтетических красителей в напитках методами тонкослойной хроматографии и капиллярного электрофореза
Введение к работе
Актуальность работы
В настоящее время особое внимание уделяется проблеме фальсификации напитков. Одним из распространенных способов фальсификации является не разрешенное стандартами применение синтетических красителей при приготовлении напитков, что представляет опасность для здоровья потребителей.
Известны различные методы выявления синтетических красителей в напитках: хроматографические методы, метод капиллярного электрофореза и другие.
Однако в связи с наличием у каждого из них существенных недостатков, связанных с длительностью проведения анализа, применением дорогостоящего оборудования и вредных для здоровья химических веществ, перспективной является разработка экспресс-метода, позволяющего определить наличие синтетических красителей в анализируемом напитке за минимальное время с наименьшими затратами, применяя безопасные реагенты.
Для проведения анализа экспресс-методом нами предложено использовать
принцип селективного извлечения синтетических красителей
хитозансодержащими сорбентами.
Современные технологии позволяют получать хитозансодержащие сорбенты из хитина методом деацетилирования, включающим, как правило, применение концентрированных щелочей и нагревание до высоких температур.
Вопросам усовершенствования технологии получения хитозансодержащих препаратов посвятили свои работы российские и иностранные исследователи: Феофилова Е.П., Немцев Д.В., Нудьга Л.А., Куприна Е.Э., Гамаюрова B.C., Muzzarelli R.A.A. и многие другие.
Ввиду неоднородности состава панцирьсодержащего сырья и проблем, связанных с его транспортировкой, целесообразной является разработка технологии получения хитозансодержащих биосорбентов из грибов. Благодаря возможности контроля состава питательной среды и условий культивирования, биосорбенты будут обладать однородным составом и стабильными свойствами, а также меньшей стоимостью по сравнению с хитозаном из панцирьсодержащего сырья за счет получения дополнительных ценных продуктов.
В данной работе при выборе микроорганизма для получения хитозансодержащих биосорбентов предпочтение было отдано грибу Rhizopus oryzae - представителю класса Zygomycetes (класса грибов, содержащих хитозан в составе клеточной стенки в отличие от многих других грибов, содержащих в клеточной стенке предшественник хитозана - хитин, обладающий намного меньшей сорбционной активностью). В связи с этим, преимуществом Rhizopus oryzae является возможность получения из него хитозана и хитозансодержащих комплексов, избегая затратной и небезопасной стадии деацетилирования.
Следует отметить, что Rhizopus oryzae является перспективным продуцентом молочной кислоты, амилолитических ферментов и других ценных продуктов, что позволит создать комплексное производство, снижая себестоимость каждого из получаемых продуктов и одновременно решая проблему утилизации отходов.
Таким образом, получение из биомассы Rhizopus oryzae биосорбентов для выявления синтетических красителей в напитках, а из фильтрата культуральной жидкости - комплекса продуктов, каждый из которых имеет широкую область применения, является актуальным в настоящее время.
Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Санкт-Петербурга и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа «У.М.Н.И.К.»).
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлась разработка технологии получения биосорбентов из гриба Rhizopus oryzae с возможностью получения дополнительных ценных продуктов, а также разработка экспресс-метода выявления синтетических пищевых красителей в напитках с применением полученных биосорбентов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
определить состав и соотношение продуктов, получаемых при культивировании гриба Rhizopus oryzae;
исследовать влияние состава питательной среды и условий культивирования на выход биомассы Rhizopus oryzae и ее сорбционные свойства;
разработать технологию получения хитозансодержащих биосорбентов из биомассы;
исследовать состав полученных биосорбентов;
провести анализ селективности сорбции красителей из напитков различными сорбентами;
провести сравнительный анализ сорбционной активности полученных биосорбентов и крабового хитозана в отношении синтетических пищевых красителей;
разработать экспресс-метод выявления синтетических пищевых красителей в напитках с применением полученных биосорбентов.
Научная новизна работы
Впервые установлено различие сорбционной способности хитозана и хитозансодержащих сорбентов в отношении природных красящих веществ напитков и синтетических красителей.
Получены новые биосорбенты и впервые предложено применять их для селективной сорбции красителей.
Разработан сорбционный экспресс-метод выявления синтетических красителей в напитках, новизна которого подтверждена патентом РФ № 2324179.
Исследовано влияние условий глубинного культивирования Rhizopus oryzae (состав среды, качество посевного материала, способ корректировки рН) на выход биомассы и ее сорбционные свойства.
Подобраны условия культивирования Rhizopus oryzae, позволяющие в одном технологическом цикле получить биосорбенты, молочную кислоту и амилолитические ферменты.
Впервые изучено влияние условий щелочной обработки биомассы Rhizopus oryzae на способность селективной сорбции синтетических красителей
из напитков. Показана необходимость и разработан способ кислотной активации хитозансодержащих биосорбентов.
Впервые исследовано влияние параметров обработки различных напитков биосорбентом на их оптические характеристики.
Предложена методика оценки селективности сорбции красителей из напитков путем расчета показателя наличия синтетических красителей (ПСК).
Практическая значимость работы
Результаты данной работы могут представлять интерес для предприятий, производящих сорбенты, молочную кислоту и ферментные препараты. Получение нескольких продуктов в результате одной ферментации позволит, во-первых, снизить себестоимость каждого продукта, а во-вторых, решить проблему утилизации отходов.
Показана возможность применения пищевых крахмалсодержащих отходов в качестве субстрата для культивирования Rhizopus oryzae.
Разработанные новые биосорбенты и новый экспресс-метод выявления синтетических пищевых красителей в напитках могут быть использованы инспекционными лабораториями контроля качества напитков, а также индивидуальными потребителями. Применение тест-систем на основе полученных биосорбентов при осуществлении контроля наличия синтетических красителей в напитках позволит значительно сократить как временные, так и материальные затраты на проведение данного анализа.
Проведены испытания разработанного экспресс-метода выявления синтетических красителей независимой лабораторией ООО «Центр коллективного пользования «Аналитическая спектрометрия», о чем свидетельствует акт испытаний, представленный в приложении к диссертационной работе.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы были представлены на всероссийских и международных научных конференциях, в том числе на
IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и
перспективы развития» (Москва, 2007); научно-прикладном семинаре
«Аналитические методы и приборы для химического анализа» (Санкт-Петербург,
2007); IX, X и XI Международных конференциях молодых ученых «Пищевые
технологии и биотехнологии» (Казань, 2008, 2009, 2010); международном
семинаре «CRDF PDP Technology Entrepreneurship Workshop» (Санкт-Петербург,
2008); Третьем Всероссийском форуме студентов и аспирантов «Наука и
инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2009);
XIII Международной конференции молодых ученых «Синтез, исследование
свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений -
V Кирпичниковские чтения» (Казань, 2009); международном семинаре "Growing
Green Links Between Russia and Finland" (Санкт-Петербург, 2010);
II Международной конференции Российского химического общества
им. Д.И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии
материалов и продуктов» (Москва, 2010).
Результаты диссертационной работы были включены в проекты, признанные лучшими по итогам конкурса по программе «У.М.Н.И.К.» (Санкт-Петербург, 2007); конкурса инновационных разработок в рамках международного семинара «CRDF PDP Technology Entrepreneurship Workshop» (Санкт-Петербург, 2008); конкурса «Молодые. Дерзкие. Перспективные» в номинации «Научно-технические разработки» (Санкт-Петербург, 2009); конкурсных отборов для предоставления в 2009 и 2010 годах субсидий молодым ученым, молодым кандидатам наук ВУЗов и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2009, 2010); конкурса проектов молодых ученых в рамках 3-й международной выставки «Международная химическая ассамблея ICA-2010» (Москва, 2010).
По материалам конференций и конкурсов опубликованы тезисы докладов.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 4 статьи, 12 тезисов докладов, 1 публикация в сборнике разработок и 1 патент на изобретение.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа включает введение, семь глав, в которых представлены аналитический обзор, план организации эксперимента, объекты и методы исследования, экспериментальная часть, выводы, список использованных источников литературы, содержащий 170 наименований отечественных и зарубежных источников информации, и одно приложение. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, включает 27 таблиц и 42 рисунка.
Общая характеристика хитозана
Хитозан представляет собой линейный аминополисахарид, сополимер D-глюкозамина и І-ацетюі-Б-глюкозамина, соединенных Р (1—»4) -гликозидными связями. Традиционно хитозан получают из его предшественника - хитина, состоящего из остатков г Г-ацетил-0-глюкозамина [50].
В основе получения хитозана лежит реакция деацетилирования хитина. В соответствии с приведенным на рисунке 4 уравнением реакции, происходит отщепление ацетильной группировки от структурной единицы хитина.
Транс-расположение заместителей (ацетамидной и гидроксильной групп) у С(2) и С(3) в элементарном звене макромолекулы хитина обусловливает значительную гидролитическую устойчивость ацетамидных групп, в том числе и в условиях щелочного гидролиза. Поэтому отщепление ацетильных групп удается осуществить лишь в сравнительно жестких условиях - при обработке 40-49%-ным водным раствором NaOH при температуре 110-140С в течение 4-6 часов [50]. Однако и в таких условиях степень деацетилирования (СД), показывающая процентное содержание элементарных звеньев D-глюкозамина в молекуле хитозана, как правило, не достигает 100%. Традиционно в зависимости от эффективности реакции деацетилирования получают хитозан со степенью деацетилирования от 75 до 95% [50].
Реакция деацетилирования сопровождается одновременным разрывом гликозидных связей полимера. Таким образом, хитозан представляет собой полидисперсный по- молекулярной массе полимер D-глюкозамина, содержащий некоторое количество звеньев N-ацетил-D-глюкозамина [51].
По внешнему виду хитозан представляет собой чешуйки или порошки различного помола, от белого до кремового цвета, часто с желтоватым, сероватым или розоватым оттенком, без запаха [50, 51].
Полимерная структура хитозана позволяет получать препараты различных агрегатных состояний: от растворов до густых кремообразных и твердых субстанций. Высоковязкие растворы хитозана обладают адгезионными свойствами, способны образовывать пленки, обладающие высокими прочностными свойствами [52].
В отличие от практически нерастворимого хитина, хитозан,. растворимый в разбавленных органических и неорганических кислотах (кроме серной), имеет широкие возможности для применения в различных отраслях промышленности, сельском хозяйстве и медицине [50]. Хитозан является полифункциональным соединением, обладающим высокой совместимостью с животными тканями, биодеградируемостью, отсутствием токсичности, бактерицидностью, способностью связывать и выводить радионуклиды, тяжелые металлы и др. [53].
Хитозан содержит амино- и гидроксильные группы, способные к взаимодействию с различными веществами по механизмам ионного обмена и комплексобразования за счет высокой электронодонорной способности атомов азота и кислорода. Вследствие этого хитозан обладает высокой сорбционной способностью. Атом азота первичной аминогруппы имеет неподеленную электронную пару, которая может связываться, например, с ионами металлов; возникшая связь затем усиливается при взаимодействии с гидроксильными группами с образованием хелатов [51]. Полимерные цепи хитозана с высоким содержанием аминогрупп и разнообразной пространственной конфигурацией также способствуют усилению сорбционной активности.
Следует подчеркнуть, что по сравнению с хитином сорбционные свойства хитозана выражены значительно сильнее благодаря наличию у хитозана первичных аминогрупп.
Многими авторами установлена сорбционная активность хитозана по отношению к тяжёлым и переходным металлам. В связи с этим, хитозан может быть применен для извлечения тяжелых металлов из различных источников, для очистки воды и почв [50, 51, 54-63].
Ярко выраженные сорбционные свойства хитозана сделали его привлекательным для извлечения металлов не только из водных растворов, биологических жидкостей и почвы, но также из вин и виноматериалов. Няниковой Г.Г. и Маметнабиевым Т.Э. [64-66] предложено применять хитозан для деметаллизации вин с целью предупреждения металлических помутнений.
Благодаря наличию свободных аминогрупп, в, кислой среде хитозан приобретает положительный заряд. Показано [50], что поэтому при низких значениях рН хитозан, связывает свободные жирные кислоты и холестерин с образованием нерастворимых комплексов. Как высокомолекулярный поликатион, хитозан может связываться с кислыми белками и нуклеиновыми кислотами [53].
Растворимость хитозана зависит от его молекулярной массы и от значения кислотности среды [67].
Большое количество водородных связей, которые способен образовывать хитозан, определяют его способность связывать различные органические водорастворимые вещества, в том числе токсины, образующиеся в толстом кишечнике в процессе пищеварения.
С другой стороны, обилие водородных связей между молекулами хитозана приводит к его плохой растворимости в воде, поскольку связи между молекулами хитозана более прочные, чем между молекулами хитозана и молекулами воды. Вместе с тем, хитозан набухает и растворяется в органических кислотах - уксусной, лимонной, щавелевой, янтарной, причем при набухании он способен прочно удерживать в своей структуре растворитель, а также растворенные и взвешенные в нем вещества. Хитозан также способен связывать предельные углеводороды, жиры и жирорастворимые соединения за счет гидрофобных взаимодействий и сетчатой структуры [50].
Многими исследователями показана высокая сорбционная способность производных хитозана: аммониевых солей, йодида N-триметилхитозана, N-карбоксибутилхитозана и других [51, 68-71].
Хитозан может служить предшественником ряда глюкозаминогликанов. Так, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, гиалуроновая кислота участвуют в образовании и метаболизме тканей, в том числе кости, хряща и пародонта [72].
Таким образом, хитозан является универсальным сорбентом, способным связывать огромный спектр веществ органической и неорганической природы, что определяет широчайшие возможности его применения.
Исследование оптических характеристик напитков для оценки селективности сорбции красителей
Окраска является одной из определяющих органолептических характеристик напитков. Для объективной оценки окраски используют показатели интенсивности и оттенка. Интенсивность окраски (I) определяется как сумма оптических плотностей, измеренных при длинах волн 420, 520 и 620 нм. Оттенок окраски (N) определяется как частное от деления оптической плотности, измеренной при 420 нм, к оптической плотности при 520 нм.
Поскольку наибольшую практическую ценность имеет выявление синтетических красителей в винах ввиду их значительной стоимости и сложного состава, основные характеристики селективности сорбции были. исследованы на винах и модельных растворах вин.
Для проведения оценки характеристик натуральных красных вин для данных вин были определены интенсивности и оттенки окраски.
В таблице 4 приведены характеристики исследованных вин, рассчитанные по методике, описанной в пункте 2.3.9, на основании измерений оптических плотностей вин в пяти повторностях на фотометре.
Как известно, характеристики цвета различных виноградных вин сильно отличаются и зависят от сорта винограда, региона его произрастания, типа получаемого вина и его возраста.
Для разработки метода выявления синтетических пищевых красителей были приготовлены модельные растворы пищевых синтетических красителей в-белом вине, соответствующие по окраске натуральным винам. Количества и пропорции красителей и вин для приготовления модельных растворов были установлены на основании подбора соотношений для получения оптических характеристик, близких к оптическим характеристикам красных вин.
В таблице 5 представлен состав модельных растворов.
Для выявления синтетических красителей необходимо подобрать сорбент, извлекающий синтетические красители из модельных растворов, но и не извлекающий натуральные красители из натуральных напитков.
Для оценки селективности сорбции нами предложено проводить обработку напитка сорбентом, отделять , надосадочную жидкость после обработки и определять относительные изменения интенсивности и оттенка окраски, произошедшие в результате обработки [159]. Относительное изменение интенсивности окраски после обработки сорбентом Ei (%) определяется по формуле
Для комплексной оценки изменения интенсивности и оттенка окраски нами предложено ввести показатель наличия синтетических красителей ПСК, определяемый по формуле
Таким образом, необходимо подобрать сорбент, при сорбции синтетических красителей которым значения ПСК будут максимальны, а при сорбции натуральных красителей минимальны.
Подбор условий обработки биомассы щелочью для получения хитозансодержащих биосорбентов из биомассы
Для получения хитозансодержащих биосорбентов на первом этапе проводили отделение биомассы фильтрованием на вакуум-фильтре и промывку биомассы водой.
После промывки одинаковые навески биомассы обрабатывали раствором NaOH в различных режимах, согласно схеме, представленной на рисунке 21. В качестве параметров обработки были выбраны концентрация щелочи, время обработки и температурный режим, которые обеспечивали наибольшую степень деацетилирования при наибольшем выходе продукта.
Следует отметить, что традиционно хитозан получают методом деацетилирования, включающим длительную (до 6- часов) обработку щелочью при нагревании до температур 110-140С [50]. Однако поскольку Rhizopus oryzae содержит в клеточной стенке непосредственно хитозан, который может быть выделен, избегая затратной и небезопасной стадии деацетилирования, целесообразно изучить необходимость нагревания или в случае необходимости — возможность нагревания в течение значительно меньшего времени.
После обработки щелочью отфильтрованный нерастворимый в щелочи осадок промывали водой и высушивали при 50С. Полученный продукт измельчали до порошкообразного состояния. Определяли массу полученных образцов, их сорбционные свойства и степень деацетилирования.
Показано, что сорбционная емкость всех полученных препаратов в отношении синтетических красителей Е102, Е104, Е110, Е122, Е123, Е124, Е127, Е128, Е129, Е132, Е133 и Е155 в широком диапазоне концентраций красителей от 10 мг/л до 2000 мг/л отличалась незначительно. При сорбции из подкисленных лимонной кислотой растворов (модель напитков) степень сорбции полученными препаратами в количестве 100 мг/10 мл раствора составляла от 85,0 до 99,9% в зависимости от красителя и его исходной концентрации.
Поэтому выбор способа обработки производили, исходя из характеристик продукта и параметров режима обработки щелочью, приведенных в таблице 15.
Показано, что высокую степень деацетилирования удалось получить только при автоклавировании.
Поэтому результаты проведенных экспериментов были разделены на 2 группы: полученные при обработке без нагревания (образцы 1-6) и при нагревании (автоклавировании) (образцы 7-18).
Степень деацетилирования препаратов, полученных без нагревания, не превышала 46%, в то время как даже при непродолжительном автоклавировании удалось получить образцы со степенью деацетилирования 78,0±4,7%.
Характеристики полученных продуктов представлены на рисунке 22.
Получая продукт со степенью деацетилирования 78,0±4,7%, за счет автоклавирования проводится дополнительное обеззараживание биомассы, совместно с депротеинированием и деацетилированием в мягких условиях.
Несмотря на то, что выход продукта не настолько высок, как в случае обработки без нагревания, удаление неоднородных компонентов биомассы и получение продукта с высокой степенью деацетилирования позволит сделать вывод о сопоставимости характеристик продукта с крабовым хитозаном.
Поскольку степень деацетилирования является наиболее важной характеристикой получаемого продукта, то исходя из представленных в таблице 15 параметров, предпочтение отдано образцу 9 (режим обработки в автоклаве, 15 минут, 1 М раствор NaOH, соотношение биомасса: объем раствора NaOH=l :5).
Следует отметить, что определенная параллельно степень деацетилирования образцов крабового хитозана составила для хитозана, производимого в ЗАО «Биопрогресс» в виде чешуек 78,6±3,5%, для хитозана в виде порошка - 82,7±4,0%.
Выявление и идентификация синтетических красителей в напитках методами тонкослойной хроматографии и капиллярного электрофореза
Для проверки результатов анализа напитков, полученных разработанным экспресс-методом, был проведен анализ напитков методами тонкослойной хроматографии и капиллярного электрофореза.
Для анализа были выбраны натуральные вина "Изабелла домашнее" и виноматериал "Каберне", вина "Кьянти" и "Бодегас ноблес", в которых синтетические красители не были обнаружены, вина "Бастардо" и вино -образец 2, в которых было обнаружено наличие синтетических красителей разработанным способом, и модельные растворы, заведомо содержащие синтетические красители.
Выявление и идентификация красителей проводились в соответствие с методикой, описанной в ГОСТ Р 52470-2005 "Методы идентификации и определения массовой доли синтетических красителей в алкогольной продукции" (пункт 2.3.11). На рисунке 39 представлены хроматограммы исследованных объектов.
Из рисунка 39 видно, что вина "Изабелла", "Кьянти", "Бодегас ноблес" и виноматериал "Каберне" не содержат в своем составе синтетические красители.
Тонкослойная хроматография подтверждает наличие кармуазина (Е122), синего блестящего FCF (Е133) и понсо 4R (Е124) в модельном растворе поз. 3, а также кармуазина (Е122), индигокармина (Е132) и тартразина (Е102) в модельном растворе поз. 4.
Наличие синтетических красителей в винах "Бастардо" и образце 2, определенное разработанным методом, также подтверждается при анализе методом тонкослойной хроматографии.
Из рисунка также видно, что исследованный образец вина "Бастардо" представляет собой раствор трех красителей. Красители идентифицированы по значениям коэффициентов распределения Rf: кармуазин (Е122) (красный, Rf=0,51), синий блестящий FCF (Е133) (синий, Rf=0,32) и понсо 4R (Е124) (красный, Rp0,28). На рисунке 40 представлены хроматограммы вина "Бастардо", свидетелей (кармуазина, понсо 4R, синего блестящего FCF) и смеси свидетелей.
Таким образом, результаты испытаний исследованных напитков методом тонкослойной хроматографии подтвердили результаты, полученные при помощи разработанного экспресс-метода.
Количественное содержание красителей было определено методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель-105».
На рисунках 41 и 42 представлены электрофореграммы смеси стандартных красителей Е122, Е124, Е129 и Е133 и представленного выше образца вина "Бастардо".
Таким образом, представленные электрофореграммы позволяют определить количественное содержание красителей в исследуемых напитках. В вине "Бастардо" определено содержание красителей кармуазина (Е122) — 131,5±10,2 мг/л, красителя понсо 4R (Е124) - 26,7±2,1 мг/л, красителя синего блестящего (Е133) - 9,8±0,9 мг/л.
В данной главе представлены результаты апробации разработанного нового экспресс-метода выявления синтетических красителей в напитках с применением биосорбентов, полученных из биомассы гриба Rhizopus oryzae. Наиболее популярными напитками, в которых имеет место несанкционированное добавление. синтетических красителей, являются, в первую очередь вина и соки, а также слабоалкогольные коктейли.
Произведен анализ более 200 различных напитков. Результаты, полученные с использованием разработанного экспресс-метода, подтверждены стандартными методами тонкослойной хроматографии и капиллярного электрофореза.
Испытания разработанного метода также проводились независимой биохимической, лабораторией ООО «ЦКП «Аналитическая спектрометрия» (акт испытаний представлен в Приложении). Все результаты испытаний также соответствовали результатам, полученным при анализе- согласно стандартной методике. ,
Таким образом, для существенного сокращения временных и материальных затрат при определении синтетических красителей в напитках целесообразно проведение двухступенчатого анализа:
На первом этапе проводится анализ; экспресс-методом результаты которого; в- течение короткого периода времени могут дать представление о наличии или отсутствии в напитке синтетических красителей. На втором этапе при необходимости проводится качественный и количественный анализ синтетических красителей только в тех образцах, где они были обнаружены [170].
Поскольку, имеющиеся в настоящее время методы не предоставляют возможность сделать вывод о наличии или отсутствии; красителей до окончания; проведения полного трудоемкого анализа, данная разработка является не только экономически выгодной, но и позволит сократить количество анализов требующих работы с токсичными веществами.
