Содержание к диссертации
Введение
1 СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА 11
1.1 Биологические и экологические особенности, распространение и применение ивы Salix acutifolia Willd 11
1.2 Кора деревьев и области ее применения 16
1.3 Биохимический состав коры и листьев ивы 19
1.4 Фармацевтические свойства биологически активных веществ из коры ивы 23
1.5 Влияние условий выращивания и сушки ивы на состав и количественное содержание салицилатов 26
1.6 Способы выделения биологически активных веществ из коры ивы28
1.7 Области применения вторичных ресурсов при переработке коры ивы 32
2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
2.1 Объекты исследования 38
2.3 Методы исследования 41
2.3.1 Методика определения общего салицина методом ВЭЖХ 41
2.3.2 Способ экстракции салицилатов сверхкритической флюидной экстракцией углекислым газом 44
2.3.3 Способ экстракции салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлазы и р-глюканазы 44
2.3.4 Методика определения адсорбционной активности коры и шрота ивы по отношению к Т-2 микотоксину 45
2.3.5 Методика определения Т-2 токсина методом ТСХ 46
2.3.6 Методика испытания энтеросорбента на основе коры ивы при подостром Т-2 микотоксикозе на белых нелинейных крысах 48
2.3.7 Методика определения влияния летучих веществ коры и шрота Salix acutifolia на физиологию Aspergillus parasiticus 49
2.3.8 Методика анализа норсолориновой кислоты и афлатоксинов В1, В2, Gl, G2 тонкослойной хроматографией 50
2.3.9 Методика анализа летучих веществ коры и шрота ивы методом ГХ-МС 52
2.3.10 Методика выделения РНК мицелиальных грибов 53
2.3.11 Методика определения уровня транскрипции 56
2.3.12 Статистический анализ 57
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 58
3.1 Оценка биоресурсов салицилатов 58
3.1.1 Сравнительный анализ содержания салицилатов в различных
видах ивы 58
3.1.2 Анализ изменчивости Salix acutifolia по доле коры в побегах 60
3.1.3 Анализ изменчивости Salix acutifolia по содержанию салицилатов 64
3.2 Усовершенствование способов экстракции салицилатов 68
3.3 Определение адсорбционных свойств коры и шротов ивы Salix acutifolia по отношению к Т-2 микотоксину 76
3.4 Влияние летучих веществ коры и шротов ивы Salix acutifolia на физиологию Aspergillus parasiticus 81
4 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО РЕШЕНИЯ НА ОПЫТНОЕ ПРОИЗВОДСТВО БИОПРОДУКТОВ ИЗ КОРЫ SALIXACUTIFOLIA 94
ВЫВОДЫ 98
ПРАКТИЧЕСКИЕ ГІРИЛОЖЕНИЯ 100
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 101
- Биологические и экологические особенности, распространение и применение ивы Salix acutifolia Willd
- Методика определения общего салицина методом ВЭЖХ
- Усовершенствование способов экстракции салицилатов
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы в развитых странах наблюдается тенденция к увеличению применения лекарственных растений и экстрактов из них взамен синтетических лекарственных препаратов. Важное место среди источников природных лекарственных веществ занимают растения ивы (род Salix, семейство Salicaceae). Экстракт коры ивы обладает противовоспалительными, обезболивающими, жаропонижающими свойствами (Marz, 2002, Кортиков, 2005), применяется при ревматических воспалениях и суставной боли (Chrubasik, 2001, Chrubasik, 2001, Chrubasik, 2000), ингибирует тромбин (Jedinak, 2006), обладает противоопухолевыми свойствами (El-Shemy, 2003, El-Shemy, 2007).
Однако ресурсы имеющихся в России диких популяций ивы по содержанию салицилатов не оценивались, а технологии переработки ивы как лекарственного растения имеют серьезные недостатки. Шроты после экстракции находят применение только как топливо, что не допустимо, так как в них остаются биологически активные вещества. В целом это снижает экономическую и экологическую эффективность использования ивы как растительного ресурса.
Известно также, что многие высшие растения содержат метаболиты, обладающие противомикробными свойствами (El-Shemy, 2007), однако совершенно не изучено влияние веществ коры ивы на физиологию микроорганизмов, синтезирующих патогенные для человека и животных экотоксины. Микотоксины накапливаются в сельхозпродуктах, являются причиной потери урожая и гибели животных. Они передаются по трофической цепи к человеку и способны вызывать сильную интоксикацию.
В связи с этим актуально проведение исследований, направленных на изучение возможности комплексной переработки коры ивы с получением биопродуктов.
Цель и задачи исследований. Цель исследования – обоснование целесообразности применения и разработка технологии салицилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры Salix acutifolia Willd.
В соответствии с поставленной целью в задачи исследований входило:
оценка сырьевых источников салицилатов;
совершенствование способа выделения салицилатов;
определение возможности использования коры и шротов ивы в качестве адсорбентов экотоксинов;
исследование влияния летучих веществ коры и шрота ивы на рост, спороношение и синтез афлатоксинов грибами Aspergillus parasiticus.
разработка технологического решения производства салицилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры Salix acutifolia.
Научная новизна работы. Установлено содержание салицилатов в коре взрослых деревьев S. acutifolia - 8,3-11,3 %, в листьях и коре молодых побегов 3,2-7,5 % и 4,0 - 9,9 % соответственно. Выявлено положительное влияние ферментного комплекса целлюлазы и -глюканазы на степень извлечения салицилатов из растительного сырья. Показана эффективность адсорбции корой и шротом ивы Т-2 микотоксина в условиях in vitro и in vivo. Установлено влияние летучих веществ коры и шрота Salix acutifolia, представленных альдегидами, кетонами, производными фурана, фенольных соединений и др., на рост, неполовое спороношение и синтез афлатоксинов Aspergillus parasiticus.
Практическая значимость работы. Рекомендовано использование коры популяций Salix acutifolia в бассейне Средней Волги как наиболее эффективного источника для получения салицилатов. Предложен оптимальный способ экстракции салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлазы и -глюканазы из коры Salix acutifolia. Рекомендовано применение коры и шротов ивы в качестве фитосорбентов микотоксинов, которые могут быть использованы в составе кормов для их детоксикации. Летучие вещества коры и шротов Salix acutifolia могут применяться как ингибиторы синтеза афлатоксинов. Разработано технологическое решение производства салицилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры Salix acutifolia.
Результаты диссертационной работы использованы в научной и образовательной деятельности ГОУ ВПО «Марийский государственный технический университет» при разработке учебно-методических комплексов дисциплин «Биотехнология», «Основы биохимии и ее применение в генетике» и «Основы биотехнологии». Результаты внедрялись при выполнении НИР и ОКР по темам: Выполнение работ по развитию центра коллективного пользования научным оборудованием «Экология, биотехнологии и процессы получения экологически чистых энергоносителей (ЦКП ЭБЭЭ)» (07.03.2007-31.03.2008); Обеспечение центром коллективного пользования научным оборудованием комплексных исследований в области рационального лесопользования, разработки технологий переработки и получения топлива и энергии из органического сырья (01.04.2008 – 31.03.2009).
Положения, выносимые на защиту:
1. Оценка сырьевых источников для получения салицилатов.
2. Усовершенствованные способы экстракции салицилатов.
3. Установленные адсорбционные свойства коры и шротов ивы в отношении микотоксинов.
4. Установленное влияние летучих веществ коры Salix acutifolia на рост, неполовое спороношение и синтез афлатоксинов Aspergillus parasiticus.
5. Технологическое решение по производству биопродуктов из коры Salix acutifolia: экстракта салицилатов и энтеросорбента микотоксинов, результаты опытных работ и испытания энтеросорбента в условиях in vivo.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на международных и всероссийских конференциях и конгрессах: 2-ая Российско-корейская конференция «Современные проблемы химии природных соединений и биотехнологии» (Новосибирск, 2010), «Фитофарм 2008» (Санкт-Петербург, 2008), «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), «VIII Международный салон инноваций и инвестиций» (Москва, 2008), «2-я Биотехнологическая выставка-ярмарка “РосБиоТех-2008”» (Москва, 2008), «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар-Уфа, 2008), «Национальные проекты России как фактор её безопасности и устойчивого развития в глобальном мире» (Йошкар-Ола, 2008), «Пути рационального воспроизводства, использования и охраны лесных экосистем в зоне хвойно-широколиственных лесов» (Чебоксары, 2008), «Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений» (Красноярск, 2007), «Перспективы развития инноваций в биологии» (Москва, 2007) и др. Работа поддержана персональным грантом (стипендией) Президента Российской Федерации для стажировки за рубежом (Приказ Федерального агентства по образованию (Рособразование) №350 от 18.04.2008) и грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К»; награждена большой золотой медалью и дипломом биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2008» (за разработку способа получения экстракта из растений семейства Salicaceae); дипломами VIII Московского международного салона инноваций и инвестиций (за разработку способа получения салицина) и биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007» (за достижения в области биотехнологии и возобновляемой энергетики).
Личный вклад автора заключается в формировании целей и задач работы, проведении исследования, обработке и анализе экспериментальных данных.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 1 заявка на изобретение (положительное решение о выдаче от 11. 02. 2010).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, 5 приложений, содержит 21 таблицу и 22 рисунка. Список использованной литературы включает 212 наименований (в т.ч. 154 зарубежных авторов).
Биологические и экологические особенности, распространение и применение ивы Salix acutifolia Willd
С ботанической точки зрения, ивы {Salix L. 1753) - это двудомные листопадные фанерофиты с симподиальным типом нарастания побегов. По современным представлениям род Salix включает примерно 300-400 видов [10]. Виды, близкие в эколого-морфологическом отношении, объединяются в 29 секций, а секции, близкие в эволюционно-морфологическом отношении, - в три подрода: Salix, Vetrix, Chamaetia. Род Salix вместе с родами Populus (Тополь) и Chosenia (Чозения) входит в семейство Salicaceae (Ивовые) монотипного порядка Salicales (Ивоцветные) подкласса Archichlamydeae (Первичнопокровные) класса Dicotyledoneae (Двудольные).
Большинство Ивовых {Salicaceae) населяет умеренный пояс Северного полушария. Наибольшее разнообразие ив и тополей наблюдается в Восточно-Азиатской области, меньшее число видов - в Атлантическо Североамериканской области, еще меньше видов Ивовых - в Европе. Единичные виды ив встречаются в Северной Африке и Южной Америке. Высокое видовое разнообразие ив обнаруживается в высокогорьях и в Арктике. В европейской части России произрастает не менее 22 видов [11]. Ивы - это свето- и влаголюбивые, морозоустойчивые обитатели различных ландшафтов: пойм и переувлажненных внепойменных местообитаний. Поэтому естественные насаждения ив приурочены к поймам рек (аллювиально-пойменные виды) и разнообразным переувлажненным внепойменным местообитаниям (прибрежно-болотные виды). Ивы предпочитают умеренно плодородные кислые и слабокислые почвы. При этом нетребовательность к почвенно-климатическим условиям сочетается с низкой конкурентоспособностью. В то же время, разные виды характеризуются различным отношением к плодородию почв и характеру увлажнения, различной устойчивостью к затенению, затоплению и засыпанию песками. В результате в различных эдафо-фитоценотических условиях формируются ивняки различного видового состава. Диапазон эдафотопов естественных насаждений от АЗ...А5 до D3...D5. В природе ивы являются мощными эдификаторами — организмами, создающими вторичную среду обитания. Ивы характеризуются высокой интенсивностью метаболизма, что повышает их роль в обменных процессах, протекающих в экосистемах. Облиственные и безлистные побеги многих видов ив охотно поедаются травоядными животными. Листья служат кормом для гусениц и других фитофагов, которые, в свою очередь, поедаются зоофагами. В период цветения ивы вырабатывают большое количество нектара и являются отличными ранними медоносами для диких опылителей: бабочек, пчел, шмелей. В антропогенных ландшафтах ивы населяют разнообразные вторичные местообитания, часто культивируются. В то же время, ивы как типичные пионерные виды часто заселяют нарушенные местообитания, обочины дорог, пустыри, а при низкой культуре земледелия являются засорителями лугов [11].
Ива остролистная (Salix acutifolia) встречается по всей европейской части России в границах ареала: Петрозаводск - Архангельск - верховье Печоры - левобережье Камы и Волги до Каспия и Предкавказья. Представляет собой кустарник высотой до 12 м с овальной кроной средней густоты и пурпурно-красными, прутьевидными, гибкими побегами, покрытыми легко стирающимся сизым налетом. Листья линейно-ланцетные (8-12 см), длиннозаостренные, по краю пильчатые, сверху темно-зеленые, блестящие, снизу сизоватые. Черешки желто-красные. Цветет до распускания листьев. Растет быстро со 2-3-го года жизни, развивает глубокую и далеко расходящуюся (до 10 и более м) мощную корневую систему [10,12,13]. Это один из самых малотребовательных к условиям произрастания видов ив, засухоустойчив и морозостоек, растет на свежих и влажных почвах, гигромезофит, успешно переносит паводковые воды, но не переносит застоя воды, требовательный к свету. Поселяется преимущественно на песчаных почвах по долинам и поймам рек, берегам озер, вдоль дорог, выходит на бугристые пески. При пересадке может расти на супесчаных и суглинистых почвах у водоемов. Размножается семенами, превосходно — зимними черенками, а также крупными, ветвями, которые при засыпании песком укореняются и дают побеги, образуют поросль у пня [Ю, 12].
Экологические, биохимические и морфологические особенности ивы (быстрый рост, способность образовывать тонкие и гибкие побеги, наличие в коре танинов и салицилатов, декоративность) открыли широкие возможности ее использования [14].
Методика определения общего салицина методом ВЭЖХ
Содержание салицилатов в экстрактах определяли как общий салицин после щелочного гидролиза, в результате чего многие фенольные гликозиды, такие как, например, саликортин и тремулацин превращаются в салицин [154-156].
Приготовление пробы. Точную навеску массой 1 г воздушно-сухой коры, измельчённой до частиц размером менее 2 мм (дробилка Waring Pro Prep), экстрагировали 10 % раствором этилового спирта. Нагревали в колбе с обратным холодильником в течение 30 мин. Экстракт отфильтровывали через бумажный фильтр и отбирали 1 мл фильтрата для хроматографического анализа. Затем к 1 мл экстракта добавляли 0,5 мл 0,1 н NaOH и выдерживали в течение 60 мин. при 60 С. После этого добавляли 0,5 мл 1 н НС1 (для остановки гидролиза). Для
хроматографирования использовали образец смеси, предварительно очищенной с помощью мембранного фильтра PTFE-13-2 (Supelco) с диаметром пор 0,2 мкм.
Условия хроматографического анализа. Подвижная фаза - смесь 1,8 % тетрагидрофурана и 98,2 % воды (объем.), содержащая 0,5 % (объём.) фосфорной кислоты. Для разделения веществ использовалась колонка Pecoshere, СІ 8, 33x4.6 мм, 3 мкм, (PerkinElmer). Длина волны детектирования 270 нм. Поток подвижной фазы 1 мл/мин. Объём пробы, вводимой в хроматограф для анализа, 20 мкл. Воду, используемую для приготовления растворителя, подвергали предварительной очистке в системе Millipore Simplicity.
Расчёт. Содержание общего салицина в коре ивы (Р, %) вычисляли по формуле:где с - концентрация салицина в анализируемой пробе, мг/мл; D - фактор разбавления, мл; m - масса коры, используемой для анализа, мг. c = a + Srb, (2) где Si - площадь пика салицина на хроматограмме анализируемой пробы, мкВ-с; а и b - коэффициенты, равные -6,03 и 63,74 соответственно.
Коэффициенты а и b в формуле (2) были определены экспериментально и рассчитаны по калибровочному графику зависимости площади пика стандартного образца В(-)-салицина (Рапгеас) на хроматограмме от концентрации его в 10 % растворе этилового спирта (рис. 2.3). Вид хроматограммы экстракта коры ивы, проанализированного описанным методом, представлен на рис. 2.4.
Содержание салицина определялось по вышеописанной методике определения общего салицина, но без проведения щелочного гидролиза.
Усовершенствование способов экстракции салицилатов
Известно, что содержание салицилатов в коре и листьях ивы сильно варьирует (от 1 до 15 %) [168]. Существующие способы экстракции салицилатов не позволяют извлекать максимально возможное количество биологически активных веществ из коры ивы. Были рассмотрены различные способы экстракции салицилатов: 1) Твердофазная экстракция органическими растворителями (10-, 50-, 80 % ацетон, 10-, 50-, 70 % этанол) и водой.
Анализ проводился на образцах коры взрослых деревьев популяции Salix acutifolia одного географического происхождения (река Б. Кокшага). Результаты приведены на рис. 3.5.
В результате статистической обработки данных установлено, что нет достоверных различий между средними арифметическими значениями отдельных вариантов экстракции на 5-, 1- и 0,1 %-ном уровнях значимости. Результаты дисперсионного анализа приведены в табл. 3.11.Критерий F устанавливает только факт наличия достоверных различий между средними, но не указывает на различия между конкретными вариантами опыта. Для оценки достоверности частных различий вычислили НСР [171]. Результаты приведены в табл. 3.12.Приведенные данные показывают, что все используемые экстрагенты, за исключением 80% ацетона, имеют одинаково высокую степень извлечения салицилатов.2) Ускоренная экстракция растворителями из твердых образцов (метод ASE) при разных условиях процесса: 1 — экстракция водой (160 С, 3x20 мин.); 2 - двухступенчатая экстракция: 1) экстракция водой (160 С, 3x5 мин.), 2) водой (100 С; 3x20 мин.) . 3 — многоступенчатая экстракция: 1) экстракция гексаном, (90 С, 3x5 мин.), 2) смесью ацетон - вода (95:5), (100 С, 3x5 мин.), 3) водой (100 С, 3x5 мин), 4) водой (160 С, 3x20 мин.). Результаты приведены в табл. 3.13. Наиболее полная экстракция салицилатов в экстракторе ASE 300 (Dionex) происходит при 2 способе: двухступенчатая экстракция. 3) Сверхкритическая флюидная экстракция углекислым газом. Данный вид экстракции при выбранных условиях процесса (глава 2) показал выход салицилатов менее 1 % (0,60±0,19 %). 4) Способ экстракции салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлозы и (3-глюканазы.
С целью сохранения биологической ценности экстракта и интенсификации процесса экстракции был разработан принципиально новый способ выделения салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлазы и (3-глюканазы (Laminex BG, с активностью 82-105 GCU/g) для гидролиза компонентов клеточной стенки. Ферментативный гидролиз проводили при расходе ферментного препарата ОД % от массы коры, при гидромодуле 1:50 и рН 5,5, в режиме термостатирования (35С) и перемешивания в течение 9 часов. Коммерческие ферментные препараты, используемые для экстракции, могут обладать несколькими ферментативными активностями, важным является то, что препарат должен проявлять, по крайней мере, целлюлазную и (3-глюканазную активности. Это связано с высоким содержанием в клеточных стенках растений целлюлозы и гемицеллюлозы и необходимостью их расщепления для более полного выделения БАВ. Целлюлазы можно подразделить, например, на эндоцеллюлазы, экзоцеллюлазы, экзоцеллобиогидролазы и целлобиазы. Эндоцеллюлазы, т.е. 1,4- Р -D-глюканглюканогидролазы, произвольно расщепляют р-1,4-связи в сердцевине молекулы целлюлозы и в результате расщепления образуются олигосахариды. Экзоцеллюлазы, т.е. 1,4- р -D-глюканглюкогидралазы, расщепляют р -1,4-связи на конце молекулы, освобождая глюкозу. Их действие на целлобиозу является замедленным. Экзоцеллобиогидролазы, т.е. 1,4- Р -D-глюканцеллобиогидролазы, расщепляют вышеуказанные связи на невосстанавливающем конце молекулы, образуя целлобиозу, и целлобиазы, т.е. р -D-глюкозидглюкогидролазы, расщепляют целлобиозу до глюкозы. Для гидролиза целлюлозы до глюкозы требуется эндоглюканаза (1,4- р -D-глюканглюканогидролаза, КФ 3.2.1.4), которая расщепляет связи в сердцевине молекулы, а также замещенные субстраты, но не разрушает кристаллическую целлюлозу, целлобиогидролаза (1,4- р -D глюканцеллобиогидролаза, КФ 3.2.1.91), которая расщепляет кристаллическую целлюлозу, и Р-глюкозидаза (P-D глюкозидглюкогидролаза, КФ 3.2.1.21), которая является целлобиазой, которая расщепляет целлобиозу и целлоолигосахариды до глюкозы. Р-глюканазы расщепляют P-D-глюканы, т.е. полимеры глюкозы, которые могут быть разветвлены и могут содержать как Р-1,3-связи, так и р-1,4-связи[172].
В экстракции салицилатов хорошие результаты были достигнуты с помощью препарата Laminex BG, произведённого компанией Genencor Intemetional. Указанный ферментный препарат получен из штамма Trichoderma reesei, наиболее активно он проявляет целлюлазную и р-глюканазную активности, а также ксиланазную, липазную и протеазную активности. Входящие в его состав ферменты расщепляют р-глюканы, пентозаны и связанные углеводы, встречающиеся в растительных субстратах.
При осуществлении предлагаемого способа происходит - дезинтеграция клеточной стенки растений ферментным комплексом, что позволяет увеличить выход целевого продукта за счет повышения интенсивности процесса экстракции; - осуществление экстракции растительного сырья при рН 5,5 предотвращает разложение фенольных соединений (производных салицина), что происходит при более высоких рН, и обеспечивает сохранение биологической ценности экстракта, а низкий температурный режим (35С) позволяет экономить энергоресурсы.
Для оптимизации параметров процесса, было осуществлено моделирование процесса экстракции при различных режимах температуры и времени экстракции, а также концентрации используемых ферментов. Результаты представлены на рис. 3.6 — 3.8.
