Содержание к диссертации
Введение
1. Новые подходы в генотераттии. Рекомбинантные ДНК как инструменты переноса генов и потенциальные лекарственные препараты 9
1.1.1. Преимущества и недостатки молекулярных структур, переносящих гены 10
1.1.2. "Терапевтический ангиогенез" как часть генотерапии 13
1.2. Ангиогенез 20
1.2.1. Ангиогенин и его роль в ангиогенезе: функциональная активность, генетическая и белковая структура 23
1.2.2. Гомеобоксные гены белковых ростовых факторов и регуляторная роль их белков в процессах морфогенеза и ангиогенеза 28
1.3. Ранний постнатальный онтогенез как чувствительная модель для гснотерапевтических воздействий (переноса клонированных генов) 33
1.4. Биореакторы в современной микробиологии и биотехнологии (сравнительный аспект) 39
1.5. Теоретическое обоснование процесса вихревого принципа 43 ферментации
1.5. Заключение по обзору литературы 47
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48
2.1. Реагенты, реактивы и оборудование 48
2.2. Ферменты 49
2.3. Буферные системы и среды 49
2.4. Бактериальные штаммы 49
2.5. Плазмиды, содержащие промоторы генов млекопитающих, как системы доставки и временного увеличения дозы гена 50
2.6. Методы 51
2.6.1. Методика трансформации рекомбинантных плазмид в штамм co//JM109 51
2.6.2. Метод наработки бактерий Е. coli, трансформированных рекДНК, в газо-вихревых биореакторах «Биок» 52
2.6.3. Аналитический метод выделения рекДНК 54
2.6.4. Методика тестирования препаратов рекомбинантной ДНК, содержащих клонированный ген ангиогенина человека, на хориоаллантоисной мембране развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) 55
2.6.5. Методика введения биопрепаратов в организм новорожденных мышей линии Tg-8 55
Глава. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 57
3.1. Изучение параметров получения полупрепаративных количеств биомассы Е. coli, содержащей рекомбинантные плазм иды, в газо-вихревых реакторах «Биок» 57
3.2. Отработка методов получения из полупрепаративных количеств биомассы Е. coli рекомбинантных ДНК, обладающих ангиогенным эффектом 76
3.3. Результаты тестирования препаратов клонированного гена ангиогенина человека на хориоаллантоисной мембране развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) 82
3.4. Экспериментальные данные о влиянии рекомбинантной ДНК со вставкой гена ангиогенина на ранний постнатальный онтогенез мышей линии Tg-8 85
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 90
Заключение 95
Выводы 96
Список литературы 97
- Преимущества и недостатки молекулярных структур, переносящих гены
- Реагенты, реактивы и оборудование
- Изучение параметров получения полупрепаративных количеств биомассы Е. coli, содержащей рекомбинантные плазм иды, в газо-вихревых реакторах «Биок»
Введение к работе
Новая область науки - генотерапия - возникла как интегральное развитие биотехнологии, генетики и медицины. За последнее десятилетие в развитых странах мира значительно возрос интерес к генотерапии. Причина такого интереса заключается в том, что генотерапия обещает революционизировать медицину, лечить не следствие, а причину болезни. Ранее результаты клинической эффективности генотерапии были определены, как слабо управляемые и недостаточно безопасные. Впоследствии удалось перейти от опасных вирусных векторов, интегрирующихся в геном млекопитающих и человека, к невирусным плазмидным ДНК (Баранов и др., 2000; Горбунова, Баранов, 1997).
Плазмидные «чистые» рекДНК после введения в организм существуют в нём недолгое время (1-1,5 месяца), успевают экспрессировать нужный ген, стоящий под запускающим экспрессию в организме млекопитающих промотором и разрушаются. Такое их непродолжительное существование в организме даёт временный адресный эффект. Надо сказать, что за последнее десятилетие генотерапевтическое лечение (раковые заболевания, инфекционные заболевания, ревматоидные артриты, наследственные нарушения нервной системы, заболевания сердечно-сосудистой системы, послеоперационное восстановление тканей, заживление трофических язв) в Европе и Америке прошло около 3 тысяч волонтёров (Montain, 2000). Большинство клинических наблюдений у пациентов, прошедших курс генотерапевтического лечения, сделаны благодаря использованию генов белков факторов роста кровеносных сосудов (ангиогенина и подобных ростовых факторов), способных вызывать пролиферацию определённых клеток (в частности, ангиогенез).
Ангиогенез, - это неоваскуляризация или образование новых кровеносных сосудов из уже сформированной кровеносной системы. Он наблюдается при нормальном состоянии организма в постнатальном онтогенезе и в случаях восстановления патологических изменений и повреждений сосудов или ран, а также коллатеризации, стимулированной ишемией. Известно, что ангиогенез практически полностью отсутствует в тканях взрослого организма. Это многоступенчатый процесс формирования кровеносных сосудов, связанный с серией скоординированных биохимических реакций. Ангиогенез состоит из ряда отдельных взаимосвязанных этапов, реализуемых на клеточном и биохимическом уровнях (Мертвецов, Стефанович., 1997).
До недавнего времени клинические способы регуляции роста кровеносных сосудов ограничивались лишь подавлением ангиогенеза с целью предотвращения образования, роста и метастазирования раковых опухолей. Однако в последнее время локальную стимуляцию ангиогенеза стали применять для лечения ишемических заболеваний миокарда и
конечностей человека, а также диабетических язв и при заживлении ран (Baumgartner et al., 1998; Giordano et al., 1996). В связи с этим в последнее время наиболее активно развивается такое направление генотерапии, как «терапевтический ангиогенез». «Терапевтический ангиогенез» и перенос генов факторов роста сосудов в клетки тканей млекопитающих (трансгенозис) - актуальная проблема современной биологии и медицины. Для исследовательских целей в области «терапевтического ангиогенеза» применяют тест-системы на биологических объектах.
В качестве тест-системы для оценки биологической активности белка ангиогенина, нередко используют хориоаллантоисную мембрану (ХАО) развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) (Denefle et al., 1987).
В нашей работе было решено применить аналогичную схему, тестируя зкспрессирующиеся в организме млекопитающих генетические конструкции, содержащие клонированные гены. Предполагалось, что в случае активности рекомбинантной ДНК (рекДНК) результаты могут оказаться близки по степени ангиогенеза белковым тестам, проводимым ранее в нашей лаборатории (Кислых и др., 2000), или иметь положительную направленность.
На сегодняшний день наработка полупрепаративных количеств рекомбинантной плазмидной ДНК в мире в основном ведётся по стандартной методике на шейкерах в колбах. Эффективность при этом низка. В то же время на проведение курса лечения одного пациента необходимо использовать 4-8 мг рекДНК, что снижает интерес к такому лечению из-за высокой стоимости препарата, произведенного по старой методике (Жданов и др., 2000; Montain, 2000). Для наработки рекомбинантной плазмидной ДНК в Е. col. мы решили использовать газо-вихревые биореакторы типа «Биок» (Кислых и др., 2000). К такому решению проблемы мы пришли потому, что эти ферментеры работают при любом заполнении, стерилизуются текущим паром и позволяют менять скорость вращения и объём культуры во время работы. Простоту работы с их использованием можно приравнять к обычной лабораторной методике.
Используя низкоскоростные многолитражные центрифуги, можно работать с большими объёмами культуральной жидкости, выделяя биомассу бактерий, В дальнейшем мы предполагали модифицировать щелочную методику выделения ДНК и литиевую доочистку ДНК (Мазин и др., 1990; Sambrook et al., 1989) и уменьшить скорость центрифугирования. Таким образом, мы предполагали получать очищенные препараты рекДНК в больших количествах на низкоскоростных, но крупногабаритных центрифугах. Поскольку в стандартных методиках при выделении рекДНК, не теряя своих свойств, проводится через отмывку 96 % этанолом, то видимо этот этап можно было бы использовать
Научная новизна работы:
1. Создана система культивирования в газо-вихревых биореакторах "Биок" для наработки
биомассы бактерий Е. coli, содержащих рекомбинантныеДНК, а также выделения из неё
рекДНК с клонированными генами человека.
2. Разработана оригинальная схема эксперимента по переносу генов, заключённых в
рекомбинантных плазмидных конструкциях, в раннем постнатальном онтогенезе мышей
для генотерапевтических воздействий.
Практическая ценность:
Разработанные способы культивирования, выделения и очистки рекДНК, содержащих клонированные гены животных и человека, позволяют получать полупрепаративные количества рекДНК для использования в генотерапии.
Разработанная схема переноса клонированных генов в раннем постнаталыюм онтогенезе мышей представляет практическую ценность для реализации генотерапевтических конструкций в тканях млекопитающих.
На защиту выносятся следующие основные положения:
Разработан способ суспензионного культивирования бактерий Е coli в газо-вихревом биореакторе "Биок" для получения полупрепаративных количеств рекомбинантных плазмид, содержащих кДНК ангиогенина человека.
Модифицирована и апробирована методика выделения, очистки и хранения полупрепаративных количеств рекомбинантных плазмидных ДНК, нарабатываемых в газо-вихревом биореакторе "Биок".
Тестирование рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих ген ангиогенина человека на хориоаллантоисной мембране развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ), свидетельствует об их биологической активности.
Гекноинженерные конструкции, введённые мышам на второй день после рождения (голая рекомбинантная ДНК, содержащая клонированный ген ангиогенина человека), влияют на постнатальный онтогенез мышей линии Tg-8, значительно тормозя их рост с 28 по 40 день послеутробного развития. Период раннего постнатального онтогенеза (вторые сутки) показал себя чувствительным к влиянию рекомбинантной ДНК ангиогенина человека. Таким образом, впервые отработана схема переноса генов плазмидных рекДНК в ткани млекопитающих в раннем постнатальном онтогенезе.
Преимущества и недостатки молекулярных структур, переносящих гены
Генотерапия (ГТ) - развивалась на стыке генетики, молекулярной биологии и медицины. ГТ - это биомедицинская технология, нацеленная на получение терапевтических эффектов введением генетических конструкций (клонированных генов или антисенс -олигонуклео гидов). Генотерапия - одно из перспективных направлений в медицине и биологии XXI века, находящаяся в стадии своего становления. Клинические и доклинические испытания генотерапевтических методов лечения продолжаются уже более 10 лет. Тем не менее, это лишь только начало. До сих пор ни одна болезнь таким путём не побеждена, и нельзя сказать о преимуществе того или иного метода генотерапии (Жданов и др., 2000; Шафеи, 2000; Montain, 2000). В области генотерапии в настоящее время существует ряд нерешённых проблем. Например, есть проблема корректировки самого генома, поскольку развитие технологий пошло по пути реализации экстрахромосомной экспрессии вводимых генетических конструкций. Не решена проблема лечения злокачественных новообразований с помощью антисенс-олигонуклеотидов, генов цитокинов, генов, контролирующих апоптоз и ряда других генов, которые не гарантируют полного излечения, так как в том случае, когда остаются единичные трансформированные клетки, опухоль может дать рецидив. Проблема лечения вирусных инфекций методами генотерапии также не решена. Не найдены подходы к повышению низкой эффективности существующих методов переноса генов и их экспрессии в клетках-мишенях и тканях и обеспечению высокого уровня экспрессии (Жданов и др., 2000; Шафеи, 2000; Montain, 2000).
Большое внимание уделяется поиску сильных и специфических промоторов в целях повышения эффективности трансформации плазмидной рекДНК и усиления экспрессии генов. Серьёзных результатов можно ожидать в будущем. Тем не менее, уже сейчас можно лечить болезни сосудистого характера, стимулируя или угнетая васкуляризацию с помощью плазмидной рекДНК, содержащей клонированные гены ростовых факторов (фактор роста фибробластов, фактор роста сосудистого эндотелия, ангиогенин). В области экспериментальной генотерапии также уделяется внимание разработке методов введения рекомбинантньгх ДНК. Например, используется новый метод инъекции генов белка дистрофипа в ткани при помощи генной ртутной пушки, но результаты, не превышают эффектов от инъекций такого гена иглой (Баранов и др., 2000; Богданенко и др., 2000; Шафеи, 2000). Диалогично р-галактозидазная активность плазмиды pGEM не отличалась от данных эксперимента с введением иглой в работе В. С. Баранова и сотр. (Баранов, Баранов, 2000). Способы введения плазмидной рекДНК in vivo существуют и продолжают совершенствоваться. Хорошо зарекомендовали себя внутрибрюшинное введение рекДНК, а также введение рекДНК в воротную вену печени и в почечные артерии (Кривцов, Жданов, 2000). Используется и поверхностное ведение плазмидной рекДНК - это так называемая «трансдермальная» ДНК - иммунизация (внесение генетических конструкций через кожу с помощью специальных кремов). Эффективность такого лечения несколько ниже, чем при аналогичном «трансдермальном» внесении белков (Баранов и др., 2000).
Основными результатами 10-летних исследований в этой новой биомедицинской технологии стала смена парадигм и взглядов в этой области. Произошла смена основной цели генотерапии с исправления дефектов в хромосомах на усиленную экспрессию или включение экспрессии необходимого гена, т. е. наблюдается переход от «генетической» к «генной» терапии, к лечению путём введения генов для коррекции генети ческих и вирусных заболеваний. На основе направленного мутагенеза возник комплекс операций для замены мутантных нуклеотидов в ДНК высших организмов (ДНК/РНК- олигомеры) (Баранов, Баранов, 2000; Богданенко и др., 2000). Наблюдается переход от практики переноса генов к пересадке определенных типов клеток, трансформированных генами или продуцентами ретровирусного вектора. Следует отметить вероятность лечения этим методом нейро -дегенеративных заболеваний (например, болезни Паркинсона). Для этих целей используют дофаминергические нейроны, трансформированные генами нейротрофических факторов, а также клетки сперматозоидов и фибробластов (Баранов, Баранов, 2000). Используют также клетки РА 3-17 - продуценты ретровирусного вектора, содержащего ген тимидинкиназы. Однако в 1999 г. в США использование аденовирусного вектора третьего поколения, считающегося достаточно безопасным, привело к гибели пациента в ходе лечения. Причиной этого оказалось, по-видимому, наличие содержащихся в аденовирусном векторе нуклеотидных последовательностей, активирующих цитотоксические механизмы. В результате было решено приостановить использование аденовирусных векторных систем в генотерапии. В последние годы выявилась тенденция к использованию более безопасных, как правило, не вирусных систем (Шафеи, 2000; Montain, 2000). Рассмотрим их специфические особенности по отношению к вирусным системам.
Реагенты, реактивы и оборудование
В работе использовали следующие реактивы:
Натрия хлорид, борная кислота, кальций хлористый - квалификации "осч", соляная кислота - квалификации "хч", этанол, глицерин - производства В/О "Реахим"
Д- глюкоза, "чда" - производства "Лаверна" (Москва)
Аампициллина натриевая соль, «хч» - производства АКО "Синтез" (Курган)
Трис (гидроксиметил) аминометан, дрожжевой экстракт, пептон, агароза, -производства фирмы ICN (США).
Лизоцим - производства НПО "Биохимреактив" (Олайнский завод химреактивов).
ЭДТА, бромистый этидий, бромфеноловый синий - производства фирмы "Serva" (ФРГ).
Бакто-агар - производства фирмы "Difco" (США).
Для целей приготовления компетентных клеток пользовались центрифугой К23Д (ГДР).
Проверку клонов на наличие плазмид в клетках после трансформации осуществляли на микроцентрифуге "Heraeus" (12000 об/мин) (Германия).
Для препаративного выделения биомассы бактерий использовали низкоекоросгиую крупногабаритную центрифугу ОС-6М (Россия). Качающийся ротор РК 4x470 (max V = 2500 min"[).
Для препаративного выделения рекДНК из биомассы бактерий использовали центрифугу ОС-6М (Россия). Угловой ротор РУ 8 90 (max V= 6000 min"1).
Для измерения оптической плотности в процессе роста биомассы в ферментёре пользовались калориметром фотоэлектрическим концентрационным КФК- 2МП-УХЛ 4,2.
Горизонтальный электрофорез в 7% агарозном геле для анализа клонов и определения наличия вставки кДНК вели с использованием источника питания ПЭФА-1-УХЛ 4,2, мощностью 100 вольт-ампер (ВА). Разделение фрагментов проводили при напряжении 4 в/см.
Дяя проверки нарабатываемых нами препаратов рекДНК на наличие вставки гена ангиогенина и факторов роста фибробластов использовали рестриктазы EcoRl (20 ед/мкл), Hind III (20 ед/мкл), Xba I (20 ед/мкл) производства ООО "Сибэнзим" (Новосибирск).
Маркёры длин фрагментов ДНК получали рестрикцией ДНК фага X фирма "Promega" (США), рестриктазой Pstl (20 ед/мкл) производства ООО "Сибэнзим" (Новосибирск), а также рестрикцией плазмиды pBluescript II Sk производства фирмы "Stratagenc" (США) рестриктазой Mspl (20 ед/мкл) ООО "Сибэнзим" (Новосибирск).
Все ферменты не содержат неспецифических эндо - и экзонуклеазных активностей.
Буферные системы и среды
Буфер для трансформации клеток Е. coli (стерилизованный):
0,01 М Трис НС1.
0,05 М СаС12, рН 8,0.
Буфер для агарозного электрофореза (ТВЕ 10х):
0,89 мМ Трис.
0, 89мМ Борная кислота, рН 8,0.
Раствор (6 х) для нанесения образцов нуклеиновых кислот на агарозовый гель
(хранить при 4 С):
0,25%-ный бромфеноловый синий.
30%-ный глицерин в Н20.
Среда LB (Лурия-Бертрани) рН-7,4 для наработки рекДНК (на 1 литр Н?0):
Пептон- Юг.
Дрожжевой экстракт- 5 г.
NaCl - 10 г.
рН-доводили до 7,4, используя NH4NO3.
Бактериальные штаммы
Рекомбинантно устойчивый стандартный штамм E.coli JM 109 фирмы "Biolabs" (Англия): F! tra D36 pro А+В+ lac lq A(lacZ) МІ5/Л(1ас-proAB) gin V 44e 14- gyr A96 rec A1 relAl end Al thihsdR17.
Плазмиды, содержащие промоторы генов млекопитающих, как системы доставки и временного увеличения дозы гена
Использовали экспрессирующиеся in vivo в организме млекопитающих и in vitro в клетках млекопитающих векторные молекулы, содержащие промоторы цитомегаловируса. не кодирующие никаких собственных белков и поэтому безопасные. Плазмиды отличаются небольшими размерами 4,2-.5,5 тыс. н.п. и обладают высокой копийностью при наработке их в клетках Е. coll
рС DNA 3 "Invitrogen" (США) - 5400 Ър.
PCI-neo "Promega" (США) - 5470 bp.
PCI "Promega" (США) - 4000 bp.
PBS-12"Promega"(CUJA)- 5600 bp.
Такие плазмиды предназначены для временного поддержания в организме избытка дозы гена, вклонированного в них по полилинкеру под сильный промотор цитомегаловируса. Они способны поддерживать экспрессию нужного гена в организме на протяжении примерно одного месяца. Для достижения нужного аффекта необходим избыток таких плазмидных ДНК, вводимых в организм. В случае лечения человека обычно используют два введения в организм по 2-4 мг рекДНК на их основе (Montain, 2000).
Мы перенесли в бактериальные штаммы Е. coli JM 109 следующие плазмиды, сконструированные на основе вышеперечисленных векторов в Институте молекулярной генетики РАН (Москва):
pAng 1 (рС DNA 3 + ген ангиогенина).
pAng 2 (PCI- neo + ген ангиогенина).
pAng 3 (PCI + ген ангиогенина).
ФРФ101 (PCI + ген ФРФ).
ФРФ 103 (PCI + ген ФРФ укороченный).
PNEF-FS (PBS-12 + ген pnef).
Изучение параметров получения полупрепаративных количеств биомассы Е. coli, содержащей рекомбинантные плазм иды, в газо-вихревых реакторах «Биок»
Препаративная наработка рекДНК предполагает использование новых технологий для получени её в количествах, достаточных для экспериментальных и доклинических исследований. Поэтому для наработки плазмидной рекДНК, содержащей клонированные гены ангиогенина человека, нами была использована оригинальная конструкция ферментеров, не имеющая аналогов в мире (Кислых и др., пат. № 4259449, США: МКИ с. 12 5/02, опубл. 1981; пат. № 2940446, ФРГ: МКИ с. 13 5/00, опубл. 1982) - газо-вихревой биореактор «Биок» (Рис.10). В процессе работы с биореактором «Биок» нами, как и другими исследователями, работающими с этими аппаратами (Воробьёв и др., 1989, Кислых и др., 2000) были выявлены следующие его особенности:
Аэрационная воздушная мешалка не является в случае данного биореактора мешалкой в прямом смысле этого слова, поскольку осуществляет перемешивание именно воздушными закрученными потоками. Это деталь ферментёра, создающая воздушное вращение над поверхностью культивируемых в жидкой фазе микроорганизмов. За счёт поверхностного вращения зеркало жидкой фазы начинает плавно вращаться и перемешиваться (как в вертикальной, так и в горизонтальной плоскости) вместе с культурой микроорганизмов, находящихся в суспензионном состоянии. Воздушная мепталка полностью изолирована от привода корпусом биореактора и взаимодействует с ним лишь посредством ферритовых магнитов через стенку корпуса. Воздух подаётся через аэрирующие фильтры снизу ферментёра. Отбор проб можно осуществлять непосредственно через выводящие патрубки, автоклавируемые совместно с аппаратом.
При наработке препаративных количеств целевого продукта условия культивирования, и, следовательно, урожай биомассы продуцента в значительной мере определяются инженерным обеспечением процесса биосинтеза, т. е. конструкцией биореактора, создающего оптимальные условия для биосинтеза и накопления целевого продукта. Целью предложенного технического решения является интенсификация процесса культивирования клеток за счет увеличения скорости межфазного массообмена, снижение травмируемости клеток и устранение пенообразоваиия культуральной среды. Указанная цель достигается тем, что над поверхностью суспензии клеток формируется вихрь аэрирующего газа путем его подачи в газовую полость биореактора тангенциально его цилиндрическим стенкам и выведении этого газа из приосевой зоны в центр торцевой крышки. За счет трения на границе газовой и жидкой фаз и разницы статического давления между периферией и центром газового вихря обеспечивается движение культуральной среды в виде вихревого кольца, вращающегося относительно оси биореактора, с одновременным нисходящим движением жидкости у стенок биореактора и восходящим в приосевой зоне. Аэрирующий газ взаимодействует с культуральной средой только через свободную поверхность последней, не смешиваясь с ней. В результате этого обеспечивается интенсификация массообмена за счет высокой разницы скорости аэрирующего газа и жидкости и равномерное перемешивание суспензии без застойных зон, снижение травмируемости клеток за счет исключения из объема жидкости областей с высоким уровнем турбулентности и отсутствия ценообразования.
Принципиальная схема работы газо-вихревого биореактора "Биок" приведена на Рис.10. Биореактор представляет собой термостатированную емкость, в которой газовая полость и культуральная среда разделяются свободно поверхностью культуральной среды. Благодаря воздушному перемешиванию объем заполнения может изменяться от 10 до 90 % физического объема биореактора, в зависимости от технологических требований. В газовой полости биореактора над поверхностью культуральной среды создается интенсивный вихрь воздуха. Воздух вовлекает во вращательное движение культуральную среду, в которой формируется поле скорости с осевой компонентной. Вследствие существенного изменения тангенциальной компоненты скорости в вихре имеет место разница статических давлений между периферией I (повышенное) и центром II (пониженное). Разница давлений в газе через свободную поверхность культуральной жидкости генерирует в последней осевое движение: нисходящее в периферийной зоне (III) биореактора и восходящее в приосевой его зоне (IV) (Рис. 10).
Закрученные течения однофазных и многофазных сред широко используют в различных отраслях современной техники. В биореакторе перемешивание суспензии клеток осуществляют путем создания в ней квазистационарного вращательного движения, генерируемого аэрирующим газом, который подают в емкость над поверхностью суспензии клеток с одновременным его закручиванием в поток с полем скорости потенциального вихря на периферии емкости (зона I) и осевым противотоком в приосевой зоне (зона II); при этом перепад давления в потоке аэрирующего газа между периферией и центром вихря поддерживают в пределах 10-2000 Па (Воробьёв и др., 1989). Энергия, необходимая для
перемешивания суспензии клеток, подводится по всей поверхности жидкости, что позволяет реализовать режимы суспензионного культивирования любых клеточных культур. В ТОМ числе, наиболее чувствительных к механическому воздействию (Щукин, Халатов, 1982; Лобода, Карлаш, 1989).
Проведённые ранее на газо-вихревом ферментёре «Биок» эксперименты по наработке полупрепаративных количеств, клеточной биомассы содержащей плазмиду PZZSA, экспрессирующую в Е. coli рекомбинантный белок ангиогенина, а также эксперименты по массообмену предполагали выбор скорости числа оборотов вращающего воздушного активатора равную 600-1600 об/мин (Воробьёв и др., 1989, Кислых и др., 2000). Расход воздуха 0,2-0,05 л/л среды в минуту. При этом исследователи (Кислых и др., 2000) проведя три культивирования плазмиды PZZSA в объёмах 3500 мл, снимали культуру в конце культивирования, получая следующие результаты по выходу биомассы:
1. На оптической плотности 1,2 при Х=590 нм - 5,2 г.
2. На оптической плотности 1,56 при Х.=590 нм - 5,8 г.
3. На оптической плотности 1,43 при Х=590 нм - 6,5 г.
4. Проведя одно культивирование в объёме 2700 мл, авторы получили (сняв культуру на оптической плотности 1,00 при .=590 нм) результат по выходу биомассы, равный 6,2 г.
Эти параметры и были взяты нами за основу на момент отработки методики культивирования полупрепаративных количеств Е. coli, содержащих рекомбинантные плазмиды, с кДНК ростовых факторов.
Существенным отличием наших наработок биомассы от работ предыдущих авторов является то, что мы не использовали индукцию внутриклеточной экспрессии плазмидного гена при помощи IPTG (изопропил-тио-галлактозида) при оптической плотности 0,8-0,9 при Х=590. Кроме того, нам было желательно получить несколько большую оптическую плотность культуры (вплоть до 2,0 ед. при v=590).
Поскольку, в отличие от работ предыдущих авторов мы занимались наработкой рекДНК, а не белка, то при отработке режима культивирования было необходимо проверить оптимальный вариант скорости вращения воздушного активатора движения жидкости (по предварительным данным это 1600 об/мин). Это было нужно в связи с сокращением как временных затрат на наработку, так и оптимизацией самого режима культивирования объектов для получения максимальных количеств рекДНК за оптимальный период времени с меньшими потерями в соотношении наработанная биомасса/выделенная из неё рекДНК.
